體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞重建眼表的實驗研究

詹冬梅，楊紅燕，哈玲芳，韓樹梅

·論 著·

體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞重建眼表的實驗研究

詹冬梅，楊紅燕，哈玲芳，韓樹梅

目的 探討以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞移植片治療堿燒傷兔動物模型的效果。方法 應(yīng)用印跡細(xì)胞學(xué)方法選取完全性角膜緣干細(xì)胞缺陷的兔眼堿燒傷模型，另眼取材通過組織塊聯(lián)合酶消化法對角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，鼠單克隆抗體AE5對其進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。對堿燒傷兔眼行植片移植，觀察術(shù)后眼表狀態(tài)變化。結(jié)果 體外培養(yǎng)的兔角膜緣細(xì)胞在去上皮羊膜上生長良好，形成復(fù)層，AE5細(xì)胞免疫鑒定呈強(qiáng)陽性。不同移植片治療堿燒傷兔眼，以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞自體移植組和同種異體移植組，術(shù)后角膜病變總評分與去上皮羊膜移植組和對照組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞自體移植與同種異體移植在兔眼堿燒傷模型的眼表重建方面均顯示出良好的效果。

角膜緣干細(xì)胞；堿燒傷；印跡細(xì)胞學(xué)；細(xì)胞培養(yǎng)；去上皮羊膜

角膜上皮在維持角膜透明性方面起非常重要的作用，其更新及創(chuàng)傷愈合的過程已被研究證實需要依靠角膜緣干細(xì)胞的增殖、分化和移行[1]。眼部酸、堿燒傷或熱燒傷、手術(shù)創(chuàng)傷和藥物毒性等多種原因，均可能導(dǎo)致角膜緣干細(xì)受損、壞死乃至功能衰竭，嚴(yán)重者可致視力喪失。角膜緣干細(xì)胞缺陷所致眼表疾病已成為角膜病致盲的重要原因之一[2-3]，針對此類疾病理想的治療途徑就是進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞移植。本研究將體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞借助去上皮羊膜載體移植至堿燒傷兔動物模型眼表，觀察術(shù)后受體眼表狀態(tài)變化，評估角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)后移植重建眼表的可行性和有效性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康清潔級新西蘭大白兔若干只，體重2～2.5 kg，限雄性，眼前節(jié)應(yīng)用裂隙燈檢查未發(fā)現(xiàn)疾患。

1.2 實驗方法

1.2.1 眼表堿燒傷兔動物模型的建立：實驗兔右眼用于制作完全性角膜緣干細(xì)胞缺陷眼表堿燒傷模型。3%戊巴比妥鈉注射液(1 mL/kg)耳緣靜脈麻醉，鹽酸奧布卡因滴眼液(倍諾喜，ALCON公司)表面麻醉，開瞼器開瞼，無菌狀態(tài)下沿角膜緣環(huán)形剪開結(jié)膜，后退3 mm，將浸透在1 mol/L氫氧化鈉溶液的濾紙環(huán)片(內(nèi)徑9 mm，外徑16 mm)置于兔角膜緣30 s后取出，大量生理鹽水沖洗結(jié)膜囊5 min，定期觀察記錄眼表情況。1個月后參照潘志強(qiáng)等制定的角膜病變評分標(biāo)準(zhǔn)[3]，選取角膜上皮部分或全部剝脫、角膜混濁≥2分，角膜新生血管評分≥3分的實驗兔，完善角膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查。

1.2.2 實驗分組：通過印跡細(xì)胞學(xué)證實角膜緣干細(xì)胞失代償?shù)膲A燒傷模型成功的實驗兔32只，隨機(jī)分為單純對照組(A組)、去上皮羊膜移植組(B組)、以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞自體移植組(C組)、以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞同種異體移植組(D組)，每組各8只。

1.2.3 制備去上皮人羊膜載體:選擇寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)婦(簽署知情同意書)胎盤，無菌條件下仔細(xì)剝離羊膜并用大量含有青鏈霉素的PBS液反復(fù)沖洗后，上皮面朝上貼附在無菌硝酸纖維膜上，修剪成4.5 cm×4.5 cm大小，置于事先消毒好備用的100%甘油瓶中脫水，24 h后在無菌條件下重新置換至新的含有甘油與DMEM/F12培養(yǎng)基(1∶1)的無菌瓶里密封，-20 ℃冰箱冷凍保存。應(yīng)用前復(fù)蘇解凍，PBS液沖洗干凈后將羊膜放于含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液中復(fù)水30 min備用。使用前需檢測羊膜無菌，無菌條件下，在培養(yǎng)皿中加入2 mL用胰蛋白酶置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中熱消化30 min；玻璃彎匙輕輕刮除羊膜上皮細(xì)胞，PBS液清洗羊膜后將羊膜去上皮面向上，平鋪于33 mm培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24 h待用。

1.2.4 兔角膜緣組織取材、體外培養(yǎng)及鑒定

1.2.4.1 兔角膜緣組織取材：對右眼造模成功的實驗兔進(jìn)行左眼角膜緣干細(xì)胞取材。全麻后無菌條件下左眼置入開瞼器，以穹窿部為基底“L”形剪開上方球結(jié)膜，顯微鏡下板層刀于角膜緣處楔形切取一淺層角膜緣灰白色交界區(qū)組織(約1 mm×3 mm×2 mm)，放入裝有PBS液的EP管中保存。

1.2.4.2 兔角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)：采用組織塊聯(lián)合胰蛋白酶消化法進(jìn)行角膜緣干細(xì)胞原代培養(yǎng)。在超凈臺里，應(yīng)用PBS液漂洗組織塊多次后放入離心管，加入用量為組織塊30倍的含有0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的混合消化液進(jìn)行熱消化37 ℃ 10 min，見有大量圓形細(xì)胞脫落時，加入PBS液及含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液以終止EDTA和胰蛋白酶的消化作用；離心后棄上清液，加入2 mL內(nèi)含20%胎牛血清的培養(yǎng)液吹打混勻后收集細(xì)胞懸液放入無菌培養(yǎng)瓶內(nèi)，連同組織塊置于培養(yǎng)箱共同培育，于第7天去除組織塊，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況。

1.2.4.3 兔角膜緣干細(xì)胞傳代培養(yǎng)：吸出培養(yǎng)瓶里的細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中吹打、洗滌、離心后加入含有20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液適量，配制成細(xì)胞密度為2×104個/mL的單細(xì)胞懸液，根據(jù)用途需要分別接種。對培養(yǎng)至特定時間(7 d、14 d和21 d)需要進(jìn)行鼠單克隆抗體AE5免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定及觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，在配置成單細(xì)胞懸液后接種至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞爬片后分別進(jìn)行鑒定及HE染色；部分單細(xì)胞懸液接種至事先鋪有已處理好的去上皮羊膜的培養(yǎng)板中進(jìn)行培養(yǎng)；倒置顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁及生長情況，用于角膜緣干細(xì)胞移植片的制作。

1.2.4.4 角膜緣干細(xì)胞鑒定及形態(tài)學(xué)觀察：將傳代培養(yǎng)至7 d、14 d和21 d的兔角膜緣干細(xì)胞，配制成單細(xì)胞懸液，依此接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)、觀察，待細(xì)胞貼壁后分別行鼠單克隆抗體AE5細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定及HE染色，光鏡下觀察、采圖。

1.2.5 移植重建眼表

1.2.5.1 手術(shù)步驟：造模后1個月，將實驗兔全麻后固定，鹽酸奧布卡因滴眼液點右眼，常規(guī)消毒、鋪巾，置開瞼器，沿堿燒傷兔眼角膜緣剪開結(jié)膜，暴露角膜緣后4 mm范圍的鞏膜，板層切除角膜表面病變組織，包括全周角膜緣的血管翳。A組僅處理眼表病變，B組、C組、D組行移植片移植(B組為去上皮羊膜移植片；C組為體外培養(yǎng)的自體角膜緣干細(xì)胞的去上皮羊膜植片；D組為體外培養(yǎng)的同種異體角膜緣干細(xì)胞去上皮羊膜植片)。將略大于角膜植床的移植片，上皮面朝上置于右眼相應(yīng)位置，8-0可吸收縫線將其間斷縫合固定于淺層鞏膜并平整緊密貼覆于植床上；將游離的結(jié)膜覆蓋于外周部分的羊膜上，8-0可吸收縫線間斷縫合固定，術(shù)眼涂氧氟沙星眼膏后4-0絲線縫合瞼裂。

1.2.5.2 術(shù)后處理和觀察：術(shù)后1周拆除瞼裂縫線，術(shù)后2周、1個月、3個月，裂隙燈觀察、記錄兔術(shù)眼眼表情況并根據(jù)表1評分。

2 結(jié)果

2.1 成功建立眼表堿燒傷動物模型:堿燒傷兔眼表角膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查可見，角膜緣及角膜緣上、下、內(nèi)、外可見大量PAS染色陽性的結(jié)膜杯狀細(xì)胞，角膜上皮細(xì)胞散在，表明角膜上皮已經(jīng)結(jié)膜化(圖1，目錄后)。

2.2 兔角膜緣干細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng):原代培養(yǎng)接種初期，顯微鏡下可見散在單個細(xì)胞，胞漿豐滿透明，呈懸浮狀態(tài)；培養(yǎng)24～72 h，細(xì)胞從組織塊爬出，散在或簇樣分布，逐漸形成“沙灘樣”匍行帶；3～5 d后，細(xì)胞生長形成生長暈；7～9 d后，生長達(dá)高峰，達(dá)到70%～80%的匯合狀態(tài)，此時取出組織塊；第10～13天后，細(xì)胞形態(tài)以多邊形和梭形為主，細(xì)胞基本匯合形成單層，鋪滿整個培養(yǎng)壁，見圖2(目錄后)。消化傳代的角膜緣干細(xì)胞接種24 h后大部分細(xì)胞即貼附于去上皮羊膜表面，2 d后成片生長，以多邊形和梭形為主要細(xì)胞形態(tài)，約7 d左右形成細(xì)胞單層，幾天后細(xì)胞呈排列致密的復(fù)層結(jié)構(gòu)覆蓋整個去上皮羊膜(圖3，目錄后)。

2.3 角膜緣干細(xì)胞形態(tài)學(xué)及鑒定:光鏡下的角膜緣干細(xì)胞多呈卵圓形或多角形，HE染色見圖3；對培養(yǎng)的兔角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行鼠單克隆抗體AE5免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，見圖4(目錄后)。

2.4 裂隙燈檢查結(jié)果:兔眼表堿燒傷1個月后，角膜混濁、瘢痕形成，瞳孔區(qū)角膜薄變，角膜周邊可見新生血管，表面結(jié)膜化；A組術(shù)后角膜水腫霧濁、表面粗糙；術(shù)后2周～3個月角膜周邊新生血管快速長入，覆蓋整個角膜，角膜上皮結(jié)膜化，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)窺不清。B組、C組、D組術(shù)后當(dāng)天可見瞳孔區(qū)角膜清，周邊淺層角膜混濁，植片在位；術(shù)后第1周，B組、C組、D組拆除瞼裂縫線后可睜眼，眼球運動不受限，植片在位、光滑無感染；B組角膜混濁，但前房及瞳孔隱見；C組、D組角膜中央清，周邊輕度霧濁水腫，前房及瞳孔隱見。術(shù)后第2周，B組植片在位、部分溶解，角膜表面仍混濁發(fā)白、粗糙，前房及瞳孔隱見，邊緣有新生血管生長；C組、D組角膜緣區(qū)植片溶解，角膜霧濁、表面較粗糙，角膜邊緣未見新生血管。術(shù)后1個月，B組植片溶解，角膜中央漸清，周邊混濁，熒光素染色顯示角膜上皮部分缺損，有新生血管向角膜長入，但未達(dá)瞳孔區(qū)；C組、D組植片大面積溶解，角膜中央清，周邊混濁，熒光素染色顯示角膜上皮點片狀缺損，部分區(qū)域角膜可見少許新生血管從周邊長入。術(shù)后3個月，B組角膜透明度有所增加，熒光素染色可見部分著色，周邊新生血管長入，部分區(qū)域角膜緣結(jié)膜化；C組、D組角膜上皮層基本完整，角膜透明度明顯增加，熒光素染色未見明顯著色，部分周邊角膜可見少量新生血管，未見結(jié)膜上皮化。

2.5 各組角膜混濁指數(shù)評分、角膜新生血管指數(shù)評分及角膜上皮熒光素染色指數(shù)評分結(jié)果:見表1。

表1 各組角膜混濁、新生血管及熒光素染色評分結(jié)果

2.6 各組角膜病變總評分(角膜混濁指數(shù)評分、角膜新生血管指數(shù)評分及角膜上皮熒光素染色指數(shù)評分之和)比較：B組、C組、D組角膜病變總評分均低于A組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；C組、D組角膜病變總評分低于B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；C組角膜病變總評分與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組術(shù)后角膜病變總評分比較(分，±s)

注：*與A組比較，P<0.05；#與B組比較,P<0.05。

3 討論

眼部堿燒傷是臨床上最常見的、具有代表性的一種眼部化學(xué)傷，可造成角膜緣干細(xì)胞缺乏，角膜上皮再生功能和屏障功能障礙，表現(xiàn)為角膜慢性炎癥、上皮持續(xù)缺損、角膜結(jié)膜化、新生血管形成、結(jié)膜囊狹窄、角膜混濁，甚至失明[2-4]。此類患者常需要通過角膜移植復(fù)明，但對此類以角膜緣干細(xì)胞功能障礙為特征的角膜疾病，傳統(tǒng)的穿透性角膜移植術(shù)或者板層角膜移植術(shù)雖可重建眼表，卻不能阻止角膜緣干細(xì)胞功能衰竭，移植片上的上皮細(xì)胞因得不到角膜緣干細(xì)胞不斷分裂增殖短暫擴(kuò)充細(xì)胞TAC的補(bǔ)充,植片本身TAC耗竭可導(dǎo)致透明植片往往在移植術(shù)后6個月后混濁、血管化[5]。因此，國內(nèi)外研究[3，6-7]認(rèn)為只有采用角膜緣干細(xì)胞移植重建角膜緣功能才是治療此類疾患必要而有效的手段。

體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞首要條件是準(zhǔn)確獲得培養(yǎng)用的角膜緣組織。角膜緣處主要由角膜基質(zhì)層及上皮層組成，共聚焦顯微鏡下在基底部可以發(fā)現(xiàn)特殊的乳頭狀結(jié)構(gòu)，稱為“VOGT柵欄”，就是角膜緣干細(xì)胞所在部位[1，2-5]。Li DQ等[8-9]發(fā)現(xiàn)了角膜上皮低分化細(xì)胞干細(xì)胞存在于角膜緣基底部的上皮內(nèi)。本研究在顯微鏡下取出一塊約1 mm×3 mm×2 mm大小的角膜緣組織及完整的上皮基底層，根本不會影響眼部健康，且通過體外培養(yǎng)出的角膜緣干細(xì)胞足以供移植使用，這為角膜緣干細(xì)胞功能障礙患者的眼表重建提供可能。

角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)的理想載體應(yīng)當(dāng)是既能替代缺損的淺層角膜基質(zhì)，解決細(xì)胞黏附問題，又能改善細(xì)胞所需的生長微環(huán)境。Kim HS等[10]在眼表化學(xué)燒傷模型的角膜表面進(jìn)行羊膜移植取得成功后，羊膜被廣泛應(yīng)用于眼科領(lǐng)域。羊膜可分泌多種細(xì)胞因子，并帶有活性細(xì)胞，是一種很好的細(xì)胞培養(yǎng)載體。有文獻(xiàn)報道[11-13]將羊膜的上皮細(xì)胞消化刮除，可以提高種植細(xì)胞的成活率，便于為接種的角膜緣干細(xì)胞提供理想細(xì)胞基質(zhì)。本實驗采用去上皮羊膜作為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)載體，發(fā)現(xiàn)接種于去上皮羊膜上的干細(xì)胞宜貼壁，成膜時間短，生長速度快。

對堿燒傷兔眼分組進(jìn)行不同的移植片移植，通過對術(shù)后角膜混濁程度、角膜新生血管生長及角膜熒光素染色情況等眼表狀態(tài)進(jìn)行評分發(fā)現(xiàn)，與單純對照組和去上皮羊膜移植組相比，以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞自體移植和同種異體移植可顯著減輕角膜病變，恢復(fù)角膜上皮的完整性，減少新生血管形成，增加角膜透明性，在角膜病變修復(fù)及眼表重建方面均顯示出較好效果。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)[14]，角膜緣HLA-DR抗原主要存在于Langerhans細(xì)胞表面，體外培養(yǎng)環(huán)境下，Langerhans細(xì)胞數(shù)量會隨培養(yǎng)時間延長而減少，其表面DR抗原也會逐漸下降。魏彤心等[15]應(yīng)用HLA-DR抗原的單克隆抗體對培養(yǎng)的人角膜緣干細(xì)胞進(jìn)行檢測時也發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)細(xì)胞中未見HLA-DR抗原陽性細(xì)胞存在。本研究也顯示，以去上皮羊膜為載體體外培養(yǎng)的角膜緣干細(xì)胞自體移植組與同種異體移植組的角膜病變總評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，因此推測，角膜緣干細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)后可能喪失了部分免疫性，其抗原性有所降低。雖然自體角膜緣干細(xì)胞體外培養(yǎng)后可有效擴(kuò)充細(xì)胞數(shù)量且可避免異體間的排斥反應(yīng)，但對雙眼患者仍不適用。同種異體角膜緣干細(xì)胞由于來源更為廣泛，經(jīng)過體外培養(yǎng)后可大大降低其抗原性，我們可以充分利用這一點，對自體移植取材困難的雙眼患者可進(jìn)行同種異體取材進(jìn)行體外培養(yǎng)后移植，希望為臨床上解決因角膜緣干細(xì)胞功能障礙所致的眼表疾病提供新的治療思路，也為同種異體角膜緣干細(xì)胞移植臨床開展提供客觀的實驗依據(jù)。

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Experimental study on reconstruction of ocular surface with transplantation of corneal limbus stem cells in vitro for the treatment of alkali burn of animals

ZHANDongmei,YANGHongyan,HALingfang，HANShumei.

DepartmentofOphthalmology，TheGeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004,China

Objective To study the transplantation about denuded amniotic membrane as the carrier of allogeneic corneal limbus stem cell for the treatment of the rabbit models of alkali burn.Methods Using the impression cytology to select the completeness of limbal stem cells dysfunction from the rabbit models of alkali burn(the right eyes).The tissue block were got in the left eyes and used the enzyme digestion method to culture the corneal limbus stem cells in vitro and identify them through the mouse monoclonal antibody AE5 immunocytochemistry staining.Then the transplantation were performed for the treatment of animal models of alkali burn.Results The cultivated limbal corneal epithelial cell on the amniotic membrane grew well and formed stratified layers.AE5 cellular immune identification was strong positive.Compared the denuded amniotic membrane transplantation group and the control group，there were statistically differences in denuded amniotic membrane as the carrier to epithelium in vitro cultured autologous and in vitro cultured allogeneic corneal limbus stem cell transplantation group respectively after surgery(P<0.05).Conclusion Combining the trypsin digestion cell suspension and tissue explant culture method can produce stem cells of limbus of cornea.The mouse monoclonal antibody AE5 resistance can be used to identify the corneal limbus stem cells.As the carrier,the denuded amniotic membrane epithelium with autologous culture in corneal limbus stem cell transplantation and allogeneic culture are all showed the same good effect in rabbit model of alkali burn in ocular surface reconstruction.

Corneallimbusstemcells；Alkaliburn；Impressioncytology；Cellculture；Denudedamnioticmembrane

10.13621/j.1001-5949.2017.04.0291

寧夏科技支撐計劃項目(2013ZYS102)；寧夏醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究基金資助重點項目(XZ201410)

寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院眼科，寧夏 銀川 750004

詹冬梅(1970-)，女，碩士學(xué)位，主任醫(yī)師，從事眼科學(xué)臨床、科研及教學(xué)工作。

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170328.2051.002.html

R779.65

A

2016-06-19 [責(zé)任編輯]李 潔