F波評估兔不同程度永久性腰髓缺血損傷動物模型的價值

欒金利，楊傳超，宋啟民，程彥昊，費昶，張健

(1.濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261053；2.臨沂市人民醫(yī)院神經外科，山東臨沂276000)

F波評估兔不同程度永久性腰髓缺血損傷動物模型的價值

欒金利1，楊傳超1，宋啟民2，程彥昊2，費昶2，張健2

(1.濰坊醫(yī)學院，山東濰坊261053；2.臨沂市人民醫(yī)院神經外科，山東臨沂276000)

目的探討兔脛后神經F波對不同水平永久性腰髓缺血動物模型的評估作用。方法30只新西蘭大白兔采用完全隨機方式分為6組，1組為對照組，其余5組為實驗組。對照組(n=5)用于確定最佳刺激強度，并用于排除麻醉和手術對F波的影響，實驗組(n=5)分別結扎左腎動脈和動脈分叉間不同水平的腰動脈，腰動脈結扎后2 h和2 d記錄F波，分別在麻醉清醒后和手術后2 d進行運動功能評分，分析實驗各組術后2 h F波波幅變化與下肢運動功能的相關性，2 d后取缺血中心區(qū)標本進行HE染色，觀察缺血區(qū)病理變化。結果F波的波幅在1根組和2根組結扎前后沒有明顯的變化(P＞0.05)，結扎前后不同時間點經方差分析，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，；結扎3根組、4根組和5根組血管后的F波的波幅下降，各組結扎前后不同時間點波幅經方差分析，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；F波的潛伏期在1根組和2根組結扎前后沒有明顯的變化(P＞0.05)，在3根組、4根組和5根組隨著缺血程度的增加逐漸延長，各組潛伏期結扎前后不同時間點經方差分析，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論兔下肢脛后神經F波的潛伏期不能量化反映腰髓缺血損傷程度，但嚴重缺血后潛伏期也可延長；F波波幅能夠反映腰髓缺血損傷程度并且能夠預測脊髓的功能。

F波；脊髓；缺血；腰動脈；兔

腰部脊髓損傷所引起的下肢癱瘓、大小便功能障礙及性功能障等是嚴重的傷殘，嚴重影響了患者的生活質量。通過建立腰髓損傷動物模型加深對腰髓損傷后生理和功能反映的研究[1]，可以有效地幫助術者在脊髓腫瘤及脊柱病變手術中預防對腰部脊髓產生不可逆性損傷的發(fā)生[2]。腰部脊髓損傷動物模型的建立及評估方法多種多樣，例如各種主觀脊髓功能評分、電生理評估和脊髓的病理分子生物學評估等。部分研究資料表明F波的波幅及其變化可以有效的反映脊髓前角運動神經元細胞的功能狀態(tài)[3]，F(xiàn)波潛伏期的長短可以有效地反映脊髓運動神經根的功能狀態(tài)[4]。本實驗中，我們在顯微鏡下依次仔細分離出新西蘭大白兔左腎動脈和動脈分叉之間的不同水平的腰動脈，并連接好一次性針式刺激電極和記錄電極。實驗中從頭側到尾側依次結扎腰升動脈，以便造成不同程度的腰髓缺血性損傷，并觀察F波在不同水平的永久性腰髓缺血損傷動物模型的變化，以此來評估F波在不同程度永久性腰髓缺血損傷中的價值。

1 材料與方法

1.1 儀器及材料美國EOCHXP神經電生理監(jiān)測設備(由臨沂市人民醫(yī)院神經外三科提供，美國的Axon syetem公司)；一次性針式刺激電極和記錄電極；導線若干；動物實驗手術器械一套；多聚甲醛；3%的戊巴比妥鈉；磷酸鹽緩沖液(PBS)等。

1.2 實驗動物與分組取體質量在3.0～3.5 kg之間的、健康的新西蘭大白兔30只，不限定雌雄，應用完全隨機方式將大白兔隨機的分為對照組(n=5)和實驗組(n=5)。對照組是用來排除手術和麻醉對F波造成的影響。實驗組沿頭尾的方向、依次來結扎左側腎動脈與動脈分叉之間的不同水平的腰動脈，分為1根組、2根組、3根組、4根組和5根組，共5組。對照組(n=5)的新西蘭大白兔被麻醉后，此后每30 min時記錄一組F波，連續(xù)記錄3 h，用以排除麻醉藥物對F波的影響；對照組(n=5)行手術操作時，分離出腰動脈但不結扎腰動脈，在手術前(和手術)后不同時間內分別記錄下F波，用以排除手術對F波的影響。在實驗組的5組內，沿頭尾方向的順序，依次結扎在左腎動脈和動脈分叉之間的不同水平的腰動脈，在腰動脈結扎后連續(xù)記錄下F波，并且記錄術后2 h和術后2 d的F波，于術后2 d后取腰髓行HE染色，并在鏡下觀察。

1.3 手術步驟動物實驗室內，用紫光燈消毒30 min后，取3%戊巴比妥鈉，通過兔耳緣靜脈注射麻醉(l mL/kg)實驗用兔，在實驗過程中可根據動物的反應，追加初始劑量的1/3～1/2。動物腹部、下肢踝關節(jié)以及足底部常規(guī)備皮，酒精紗布擦洗消毒。將兔子的四肢牢固的固定在手術操作臺上，在兔子腹部正中，做一長約10 cm的縱行切口，再沿中線逐層分離后，切開覆膜，將腹腔的腸道小心的翻向動物右側，用浸泡過溫生理鹽水的濕紗布包裹腸管，以減少水分蒸發(fā)和熱量散失來預防組織壞死。在腹膜后區(qū)仔細的、鈍性分離出腹主動脈和下腔靜脈，然后再依次分離出左腎動脈和動脈分叉處之間的5條腰動脈，如果遇到血管變異，則將該動物排除在實驗之外。在實驗過程中空調開放后，室內溫度保持在24℃～26℃之間，維持肛溫不低于38℃，并根據術中出血情況，通過靜脈補充相應的生理鹽水以維持血容量。在實驗操作完畢之后依次逐層縫合腹膜層、肌肉層、皮膚。青霉素40萬單位肌肉注射以預防感染。

1.4 兔脛后神經F波刺激的記錄方法刺激電極的陰極為刺激端，固定于兔踝關節(jié)后部近心端，陽極為參考電極，固定在刺激電極的下方。記錄電極的安放：記錄電極的陰極在足底跖肌的肌腹表面，陽極在其下方的肌腱上，兩者之間的距離大約為5 mm，刺激和記錄電極之間接地。參數設置：刺激強度4～8 mA(引起足部輕輕抖動)；單脈沖自動刺激；刺激頻率：1 Hz；刺激間期：0.3 ms。記錄參數：顯示靈敏度：500μv/div；時間基線：5 ms/div；帶通濾波范圍：50～3 000 Hz；平均化處理10個信號，信號分析時間：50 ms；陷波濾波器50 Hz關閉。

1.5 Tarlov下肢運動功能評分標準0級：后肢無運動不能負重；1級：后肢可見活動，但不能負重；2級：后肢活動頻繁或有力，不能負重；3級：后肢可支持體重，可行走1～2步；4級：可行走僅有輕度障礙；5級：行走正常。

1.6 統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，多組間計量資料比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗，相關性采用Pearson相關性分析，均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物模型成功情況本實驗所采用的30只新西蘭大白兔，其中2只兔子分別因為腰動脈的變異或術中大出血被排除外，余下的28只兔子均順利的通過了手術以及術后的評估過程。兔子麻醉清醒后，可自由進食，動物模型的成功率為93.3%。

2.2 麻醉后F波的波形及其測量正常值在本次實驗中，麻醉后共有28只兔子記錄下理想的F波的波形，采用波形的各個組成成分的極性(P或N)，各成分出現(xiàn)的先后順序對波形進行命名，以數字1、2…表示，如N1、N2…，P1、P2…。F波的波形為多相波(圖1)，在手術結扎前，28只兔子的F波的潛伏期是(11.2±1.4)ms，波幅為(790.3±589.5)μV。

2.3 對照組對照組在麻醉后不同時間的F波的波幅和潛伏期經統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；對照組假手術前后的不同時間，波幅和潛伏期經統(tǒng)計學分析，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，因此認為在實驗過程中，F(xiàn)波的變化與麻醉和手術無關。

2.4 實驗組F-wave波幅和潛伏期的變化結扎1根組和2根組血管時，結扎后并未見到F波的變化；結扎3根組、4根組和5根組血管時，結扎后F波的變化表現(xiàn)：潛伏期出現(xiàn)延長和波幅出現(xiàn)降低(圖2～圖6)，血管結扎后2 h和2 d的F波的潛伏期、波幅見表1～表2。

2.5 腰髓病理切片組織形態(tài)學觀察對照組、1根組和2根組的脊髓組織，在光鏡下觀察時發(fā)現(xiàn)組織結構保持完整，神經元形態(tài)正常(圖7)；3根組脊髓組織鏡下示結構基本完整，可見點灶狀變性、壞死，脊髓灰質可呈輕度水腫樣改變，并可見大量正常形態(tài)的神經元，個別的神經細胞可出現(xiàn)細胞體積縮小、核固縮、核染色質的密度增高呈凋亡樣變；5根組脊髓的正常結構基本消失，且廣泛腫脹，并出現(xiàn)大量的空泡變性，正常的神經細胞極少，大量的神經細胞的胞核萎縮或者溶解，胞質呈嗜伊紅染色，胞質中尼氏體消失(圖8)；4根組介于3根組與5根組脊髓損傷之間。

圖1 典型的F波波形

圖2 1根組腰動脈結扎前后的F波

圖3 2根組腰動脈結扎前后的F波

圖4 3根組腰動脈結扎前后的F波

圖5 4根組腰動脈結扎前后的F波

圖6 5根組腰動脈結扎前后的F波

表1 各組F-wave波不同時間點潛伏期(ms，)

表1 各組F-wave波不同時間點潛伏期(ms，)

組別對照組1根組2根組3根組4根組5根組只數5 4 5 5 5 4手術前10.2±0.9 11.0±1.7 11.1±1.4 12.1±1.7 11.4±1.5 11.2±1.3結扎后2 h 10.4±0.8 10.9±1.7 11.1±1.5 12.5±1.8 13.6±1.6 /結扎后2 d 10.1±1.0 11.0±1.7 11.2±1.4 12.6±1.7 13.4±1.6 / F值0.102 0.001 0.010 0.134 2.756 / P值＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05 /

表2 各組F-wave波不同時間點波幅（%，)

表2 各組F-wave波不同時間點波幅（%，)

注：a與對照組比較，aP＜0.05；b與結扎前比較，bP＜0.05。

組別對照組1根組2根組3根組4根組5根組F值P值只數5 4 5 5 5 4手術前100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 100±0 F值2.506 0.075 0.715 16.090 79.275 P值＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05 / /結扎后2 h 99.5±0.9 100.2±2.1 98.4±3.5 76.9±8.1ab33.9±10.4ab0.0±0.0a222.491＞0.05結扎后2 d 102.4±3.8 100.4±1.1 99.8±1.7 81.2±8.7ab42.3±11.7ab0.0±0.0a178.000＞0.05 // / // /

2.6 脊髓運動功能評分結果對照組、1根組、2根組、3根組、4根組、5根組血管結扎在麻醉清醒后和血管結扎后2 d的運動功能評分，見表3。

圖7 對照組骶髓HE切片（×200）

圖8 實驗組5根組骶髓HE切片（×200）

表3 各組脊髓運動功能評分()

表3 各組脊髓運動功能評分()

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與結扎前比較，P＜0.05。

組別對照組1根組2根組3根組4根組5根組F值P值只數F值P值5 4 5 5 5 4手術前5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 / / / / / /＜0.05＜0.05＜0.05手術后2 d 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 4.6±0.5 2.4±0.5ab0.3±0.5ab116.725＜0.05 / /手術后2 h 5.0±0.0 5.0±0.0 5.0±0.0 3.6±0.5ab1.4±0.5ab0.0±0.0 187.511＜0.05 13.000 86.333 381.000 / / / /

2.7 實驗組各組術后2 h F波波幅變化與下肢運動功能的關系實驗組的各組術后2 h F波的波幅變化與麻醉清醒后下的運動功能經Pearson相關性分析呈正相關，r值為0.955，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；實驗組各組術后2 h F波波幅變化與術后2 d下肢運動功能經Pearson相關性分析呈正相關，r值為0.952，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

造成組織或者器官的不可逆性損傷的一個重要因素就是組織或細胞長時間的缺血缺氧。Tator等[5]認為脊髓組織及細胞的缺血缺氧改變在脊髓繼發(fā)性損傷中有極其重要的地位，脊髓組織及細胞的缺血缺氧性改變可以通過脊髓神經的功能、脊髓組織的病理改變以極脊神經的電生理反映出來。脊柱或脊髓外傷、脊柱畸形的矯形手術、椎管或者髓內占位的手術治療以及胸腹主動脈瘤的切除或修復術等，這些疾病或疾病的手術治療過程中都會因術中操作不慎或者術后過度牽拉組織、血管等，從而導致脊髓供血動脈的損傷，這些損傷使原本就處于缺血缺氧狀態(tài)的脊髓組織愈發(fā)無法獲得足夠的氧氣，造成脊髓不可逆性的損傷。脊髓缺血性損傷所導致的機體截癱、大小便失禁以及性功能障礙等傷殘明顯的降低了患者的生活質量。脊髓損傷在手術中的預防以及在臨床治療上的進步需要依賴于脊髓實驗研究的發(fā)展，然而成功的實驗研究又需要依賴于理想動物模型的建立[6]。大量的文獻及其實驗研究認為：脊髓損傷理想的動物模型既需要能夠反映人類脊髓損傷的特點，又便于實驗者進行觀察且能夠施加各種干預措施，使模型更好的為實驗服務。

在動物實驗中經常使用的脊髓損傷動物模型評估方法包括各種主觀的脊髓功能評分、通過電生理監(jiān)測數據進行評估和通過脊髓的病理分子生物學實驗進行評估等。其中電生理監(jiān)測指標評估包括以下幾個方面：運動誘發(fā)電位、感覺誘發(fā)電位及球海綿體括約肌反射等。運動誘發(fā)電位可以用來評估脊髓的運動傳導通路的完整性，脊髓的感覺傳導通路是否完整是通過感覺誘發(fā)電位來評估的，通過球海綿體括約肌反射既可以評估骶神經的感覺、運動功能，又可以反映骶髓神經元的功能狀態(tài)[7]。多種研究資料表明可以應用F波對整個脊髓運動神經通路的功能狀態(tài)進行評估，包括運動神經根及運動神經元的功能。前期研究表明沿頭尾方向依次對兔子左腎動脈和動脈分叉之間的不同水平的腰動脈進行結扎，可以建立不同程度的腰髓缺血損傷動物模型[8]，該動物模型克服了傳統(tǒng)腹主動脈結扎所建立動物模型的各種下肢肌肉等組織的缺血性改變和上肢及心臟瘀血性等并發(fā)癥的發(fā)生[9]，本實驗我們應用F波對該模型進行進一步的評估。

脊髓前角運動神經元興奮性的高低可以通過電生理監(jiān)測儀器中F波波幅改變的靈敏度來反映出來，當脊髓前角運動神經元受到損害時，F(xiàn)波的波幅瞬時降低；脊髓運動神經根的功能是否完整可以根據F波潛伏期的變化進行判斷，當脊髓運動神經根受到損傷時可以導致F波潛伏期明顯延長[3]。本實驗通過應用F波評估不同水平上的腰動脈結扎時所建立的不同程度的永久性脊髓缺血損傷的動物模型，結果表明F波的潛伏期不能夠反映不同水平腰髓缺血損傷的程度，各組腰動脈結扎前后不同時間點的潛伏期經方差分析差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。F波的波幅對脊髓缺血敏感，能夠靈敏的反映出不同水平腰髓缺血性損傷的程度，各組脊髓缺血動物模型隨著缺血程度的增加F波的波幅逐漸下降并最終消失，腰動脈結扎3根組、4根組和5根組在結扎前后不同時間點的波幅經方差分析差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

總之，通過刺激兔下肢脛后神經在跖肌可以記錄到穩(wěn)定的F波；F波潛伏期變化不能夠反映不同水平腰髓缺血損傷的程度；F波的波幅變化能夠反映出不同水平腰髓缺血損傷的程度并且能夠預測脊髓的功能。

參考文獻

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Value of F-wave in evaluating lumbar spinal cord injury in rabbit models of different levels of permanent spinal cord ischemia.

LUAN Jin-li1,YANG Chuan-chao1,SONG Qi-ming2,CHENG Yan-hao2,FEI Chang2,ZHANG Jian2.1. Weifang Medical College,Weifang 261053,Shandong,CHINA;2.Department of Neurosurgery,Linyi People's Hospital, Linyi 276000,Shandong,CHINA

ObjectiveTo investigate the evaluating effect of F-wave of posterior tibial nerve of rabbits on the different levels of lumbar spinal cord ischemic injury in animal models.MethodsThirty New Zealand white rabbits were divided into 6 groups by complete randomization,with one of them as the control group,the other five groups as experimental group.The control group(n=5)was used to determine the best stimulus intensity and eliminate the influence of anesthesia and surgery on F-wave;the rats in the five experimental groups(n=5)were ligated in the different levels of lumbar arteries in the left renal artery and arterial bifurcation.The changes of F-wave 2 h and 2 d after ligation were recorded.The motor functions were scored after anesthesia recovery and 2 d after operation.The correlation between the changes of F-wave amplitude 2 h after operation in the experimental groups and lower limb motor function was analyzed.Specimens in the central ischemic region were collected for HE staining to observe the pathological changes in ischemic area.ResultsThere was no significant change(P＞0.05)in the F-wave amplitude before and after ligation of one or two lumbar arteries,and analysis of variance at different time points before and after ligation showed no statistically significant difference(P＞0.05).The F-wave amplitude was decreased when three or four or even five lumbar arteries were ligated,and analysis of variance at different time points in each groups before and after ligation showed statistically significant difference(P＜0.05).The latency of F-wave has no significant change(P＞0.05)before and after ligation of one or two lumbar arteries,but it was gradually prolonged with the increase of the degree of ischemia when three or four or five lumbar arteries were ligated.Analysis of variance at different time points in each groups showed no statistically significant difference in the latency of F-wave(P＞0.05).ConclusionThe lumbar spinal cord ischemic injury cannot be accurately quantified through the latency of F-wave in posterior tibial nerve of rabbits,but the latency of F-wave would be extended when spinal cord ischemia was severe.The amplitude of F-wave can reflect the degree of lumbar spinal cord injury and predict the function of the spinal cord.

F-wave;Spinal cord;Ischemia;Lumbar artery;Rabbits

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.08.004

R-332

A

1003—6350（2017）08—1215—05

2016-11-13)

山東醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃面上項目（編號：2015WS0375）

宋啟民。E-mail：1289477131@qq.com