微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片的質(zhì)量標準研究

宋藝君+蘇健+郭濤+王昌利

[摘要] 目的 建立微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片的質(zhì)量標準。方法 對微波法產(chǎn)地加工的延胡索飲片進行性狀、薄層鑒別，并對灰分、水分、浸出物進行測定，采用HPLC法對原阿片堿、延胡索乙素進行含量測定，采用分光光度法對總生物堿進行含量測定。結(jié)果 經(jīng)微波加工的延胡索飲片水分<15%，灰分<4%，浸出物>13%，符合《中國藥典》要求。薄層斑點清晰，分離度較好。延胡索乙素、原阿片堿、總生物堿含測結(jié)果準確、重現(xiàn)性好。結(jié)論 所建立的質(zhì)量標準可為微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 延胡索；質(zhì)量標準；延胡索乙素；原阿片堿；總生物堿

[中圖分類號] R000 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（b）-0029-04

Study on quality standard of origin processing Corydalis yanhusuo by microwave method

SONG Yijun1 SU Jian1 GUO Tao2 WANG Changli1

1.School of Pharmacy， Shaanxi University of Chinese medicine， Xianyang 712046， China； 2. 451st Hospital of PLA， Xi'an 710054， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard for origin processing Corydalis yanhusuo by microwave method. Methods The traits， TLC identification carried out， ash， moisture， extract measured， tetrahydropalmatine， protopine and total alkaloidswere measured by HPLC and UV spectrophotometry method respectively. Results The moisture of Corydalis decoction by microwave method is less than 15%， the ash is less than 4%， the extract is more than 13%， meeting the requirements of pharmacopoeia. The TLC spots were clear， good resolution. The determination method is accurate， reproducible. Conclusion Quality standards established could provide the basis for origin processing of Corydalis yanhusuo by the microwave method.

[Key words] Corydalis yanhusuo； quality standard； tetrahydropalmatine； protopine； total alkaloids

延胡索為罌粟科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖，屬于“浙八味”之一。具有活血止痛、利氣的功能，臨床上常用于胸脅、脘腹作痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，胸痹心痛，跌撲腫痛等癥[1]。延胡索含有的化學(xué)成分以生物堿為主，包括延胡索甲素、乙素、丙素（原阿片堿）[2-3]。由于延胡索藥材質(zhì)地堅實，采收后，直接晾曬導(dǎo)致干燥時間較長，易霉變，因此藥材在采收后應(yīng)對加工方法進行改進，前期的研究比較了不同產(chǎn)地加工方法的差異，優(yōu)選出微波法產(chǎn)地加工。為了控制產(chǎn)地微波加工法的飲片質(zhì)量，本文進行了質(zhì)量標準的研究，以此為微波法加工延胡索飲片的質(zhì)量控制提供借鑒。

1 儀器與試藥

U3000高效液相分析儀（賽默飛世爾科技公司）；UV-2550紫外可見分光光度儀（島津公司）；WFH-201B紫外投射反射儀（上海精科實業(yè)股份公司）；G80D23CSL-G1格蘭仕微波爐（佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司）

延胡索乙素對照品（批號：110726-201516）、原阿片堿對照品（批號：110853-201404）、延胡索對照藥材（批號：120928-201208）購于中國食品藥品檢定研究院；高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

延胡索鮮藥材采自陜西省城固縣，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的新鮮塊莖，除去泥沙雜質(zhì)、須根，洗凈后攤開瀝干水分。

微波法產(chǎn)地加工延胡索飲片：取10批次大小分開的延胡索（直徑范圍1.0～1.2 cm）各 500 g，依次采用功率60%的火力微波加熱10 min，取出，放冷，切片，干燥至水分低于15%。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

呈不規(guī)則圓形厚片。外表皮黃色或黃褐色，有不規(guī)則細皺紋。切面黃色，角質(zhì)樣，具蠟樣光澤。氣微，味苦。

2.2 水分、灰分和浸出物

按照《中國藥典》2015年版四部水分測定法[4]（通則0832第二法）、灰分測定法（通則2302）、 水溶性浸出物、醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法（通則2201） 對10批次的延胡索飲片樣品進行測定。結(jié)果見表1。

2.3 薄層鑒別

2.3.1 延胡索乙素 取延胡索粉末1 g，用50 mL甲醇溶解，超聲處理20 min，濾過，蒸干，殘渣用10 mL水溶解，調(diào)至堿性（濃氨試液），以10 mL乙醚萃取2次，萃取液合并，揮干，殘渣用1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取對照藥材延胡索1 g，以相同的方法制成對照藥材溶液。取對照品延胡索乙素適量，加甲醇制成0.48 mg/mL的對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取上述三種溶液10 μL，依次點于同一個用氫氧化鈉溶液（1%）制備的硅膠G板上，以丙酮-甲苯（2∶9）為展開劑進行展開，取出，晾干，于碘缸中顯色，在紫外光燈365 nm下檢視[1]139。供試品色譜中，在與對照品和對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點。見圖1（封四）。

2.3.2 原阿片堿 取本品粉末4 g，置磨口錐形瓶，加三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（5∶1∶0.8）混合溶液20 mL，超聲處理30 min，濾過，蒸干，殘渣加1 mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取對照品原阿片堿適量，用三氯甲烷溶解，制成2 mg/mL的對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，分別吸取上述兩種溶液10 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二乙胺-乙酸乙酯（16∶1∶3）為展開劑，預(yù)飽和30 min后展開，取出，晾干后噴以稀碘化鉍鉀溶液[1]279。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色斑點。見圖2。

2.4延胡索乙素含量測定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 Hypurity C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH值至6.0）（55∶45），流速：1.0 mL/min，檢測波長：280 nm，柱溫：30℃，進樣量：10 μL[1]140。色譜圖見圖3所示。

2.4.2對照品溶液制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的對照品延胡索乙素適量，以甲醇溶解，制成123.6 μg/mL的對照品溶液。

2.4.3供試品溶液制備 取本品粉末0.5 g，精密稱定，加入濃氨試液-甲醇（1︰20）混合溶液50 mL，稱定，放置1 h后回流1 h，放冷，再稱定，對減失部分予以補足，搖勻，濾過。取續(xù)濾液25 mL，蒸干，加甲醇溶解定容至5 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4線性關(guān)系考察 取“2.4.2”項下對照品溶液，依次進樣2、4、6、8、10、20 μL，以峰面積（Y）對進樣量（X，μg）進行線性回歸，得回歸方程Y=7.3352X+0.4544， r=0.9999（n=6），結(jié)果表明，延胡索乙素在進樣量0.2472～2.4720 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5精密度試驗 取同一個供試品溶液，連續(xù)6次進樣，依法測定，結(jié)果延胡索乙素峰面積的RSD為1.86%，表明本方法精密度良好。

2.4.6重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按“2.4.3”制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，依法測定，計算延胡索乙素含量，結(jié)果平均含量為3.35 mg/g，RSD為2.05%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.7穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，每隔2 h進樣一次，連續(xù)進樣6次，依法測定，結(jié)果峰面積RSD為2.21%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.8加樣回收率試驗 取6份3.35 mg/g的樣品，依次加入定量對照品延胡索乙素，制備供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為99.47%，RSD=2.03%，表明本方法回收率較好。見表2。

2.5原阿片堿含量測定

2.5.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 Hypurity C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈-三乙胺醋酸溶液（每1000 mL 水中加入冰醋酸 30 mL，三乙胺 8 mL）（18∶82），流速：1.0 mL/min，檢測波長：289 nm，柱溫：30℃，進樣量：10 μL[1]279-280。色譜圖見圖4所示。

2.5.2對照品溶液制備 取經(jīng)105℃干燥至恒重的對照品原阿片堿適量，以甲醇溶解，得到219.2 μg/mL的對照品溶液。

2.5.3供試品溶液制備 按照“2.4.3”項下方法制備。

2.5.4線性關(guān)系考察 取“2.5.2”項下對照品溶液1 mL，置10 mL的容量瓶中，加甲醇稀釋至10 mL，同法再稀釋10倍，得到對照品溶液濃度為2.19 μg/mL，分別進樣10、20、30、40、50 μL，以峰面積（Y）對進樣量（X，μg）進行線性回歸，得回歸方程Y =230.39X +0.0096， r=0.9994（n=5），結(jié)果表明，原阿片堿在進樣量0.0219～0.1095 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5.5精密度試驗 取濃度為219.2 μg/mL的對照品溶液，連續(xù)6次進樣，測定，結(jié)果峰面積的RSD為1.46%，表明本方法精密度良好。

2.5.6重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按“2.5.3”制成供試品溶液，連續(xù)進樣6次，依法測定，計算原阿片堿含量，結(jié)果平均含量為0.86 mg/g，RSD為2.10%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，2 h進樣一次，連續(xù)進樣6次，依法測定，結(jié)果峰面積RSD為2.01%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.8 加樣回收率試驗 取0.86 mg/g的樣品6份，依次加入適量原阿片堿對照品，制成供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.07%，RSD為2.25%，表明本方法回收率較好。見表3。

2.6 總生物堿含量測定[5]

2.6.1 供試品溶液制備 取0.5 g延胡索粉末，精密稱定，加水回流2次（100 mL，80 mL），每次30 min。過濾，合并濾液，離心，減壓濃縮至50 mL，加氨水調(diào)至pH10以上，移入分液漏斗，用氯仿萃取2次（50 mL，50 mL）合并萃取液，加蒸餾水洗滌，棄去水層，氯仿液合并，濃縮并定容至10 mL。

2.6.2 對照品溶液制備 取適量延胡索乙素對照品，用乙醇溶解定容于50 mL容量瓶，得到48 μg/mL的對照品溶液。

2.6.3 檢測波長的確定 取上述所得樣品1 mL于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，用乙醇溶解定容至10 mL。以乙醇作為空白溶液，分別把上述對照品溶液和樣品溶液在紫外分光光度計進行全波長掃描，對照品溶液在280 nm處有最大吸收，樣品溶液在273 nm處有最大吸收。最終選擇檢測波長280 nm， 并在280 nm處測量樣品的吸光度。

2.6.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1.0、2.0、 3.0、4.0、5.0 mL，置于5 mL容量瓶中，加乙醇定容至刻度，從而得到濃度為9.6、19.2、28.8、38.4、48.0 μg/mL的系列對照品溶液，以乙醇作為空白對照，在280 nm波長處測定吸光度，以濃度為橫坐標（C），吸光度為縱坐標（A），繪制標準曲線，得回歸方程為A = 0.0199C+0.0393，r=0.9992， 表明對照品濃度在9.6～48.0 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.6.5 精密度試驗 取濃度為48 μg/mL的對照品溶液，連續(xù)6次測定，結(jié)果總生物堿吸光度的RSD為1.85%。

2.6.6 重復(fù)性試驗 取同一批（批號151102）樣品，按“2.6.1”制成供試品溶液，連續(xù)測定6次，計算總生物堿含量，結(jié)果總生物堿的平均含量為5.49 mg/g，RSD為1.97%。

2.6.7穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，每隔2 h進樣一次，連續(xù)測定6次，結(jié)果吸光度RSD為2.07%，表明12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6.8加樣回收率試驗 取5.49 mg/g的樣品6份，依次加入適量對照品，制成供試品溶液，依法測定，計算回收率，結(jié)果平均回收率為98.74%，RSD為2.64%，結(jié)果見表4所示。

2.7 樣品含量測定

取不同批號樣品0.5 g，精密稱定，分別按照“2.4.3”、“2.6.1”項下方法制成供試品溶液，依法測定延胡索乙素、原阿片堿和總生物堿的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

在總生物堿的含量測定預(yù)試過程中，先采用酸堿滴定法[6]，存在終點顏色變化不明顯的現(xiàn)象，無法正確判斷終點，最終選擇采用分光光度法[7]測定總生物堿含量。

據(jù)文獻報道[8-10]，延胡索主要成分為生物堿，包括水溶性和脂溶性，因而在微波產(chǎn)地加工的延胡索飲片質(zhì)量標準研究中，進行了水溶性和醇溶性浸出物的測定。在鑒別和含量測定中，2015年版《中國藥典》延胡索飲片只有單一薄層色譜定性及延胡索乙素定量，不能完全反映延胡索飲片的質(zhì)量和功效特點，因此，本試驗增加了原阿片堿的定性和定量研究，且增加了總生物堿的含量測定，這對于延胡索飲片的質(zhì)量評價更為有效，可以作為內(nèi)控標準用于產(chǎn)地加工延胡索飲片的質(zhì)量控制，也為修訂和完善延胡索飲片質(zhì)量標準提供了依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 王文蜀，肖巍，喻蓉，等.中藥延胡索化學(xué)成分研究[J].中央民族大學(xué)學(xué)報，2007，16（1）：80.

[3] 黃康泰.常用中藥成分與藥理手冊[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994：874.

[4] 國家藥典委員會.中國藥典（四部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：104.

[5] 施婷婷，王建新，李希.延胡索總生物堿提取工藝的實驗研究[J].中藥與臨床，2014，5（3）：14-16.

[6] 謝明.延胡索醋制前后總生物堿含量測定及對小鼠的鎮(zhèn)痛作用比較[J].海峽藥學(xué)，2014，26（3）：33-34.

[7] 侯曉琳，石光，王新聞，等.延胡索總生物堿的提取純化實驗研究[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2013，11（12）：154-155.

[8] 蔡梅超.延胡索的化學(xué)成分及質(zhì)量標準研究[J].化工時代，2012，26（3）：45.

[9] 王登峰，羅云.HPLC法同時測定延胡索中3種生物堿類成分的含量[J].中國藥房，2012，23（31）：2951-2953.

[10] 高建莉，陳兆飛，石俊敏，等.延胡索中5種生物堿的含量測定及穩(wěn)定性研究[J].中國藥房，2012，23（15）：1386-1388.