右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)損傷的影響

陳戟+譚秀華+龐韜+詹鴻

[摘要] 目的 評價右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)損傷的影響。 方法 雄性SD大鼠24只，體重250～280 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為三組（n=8）：對照組（C組）、利多卡因組（L組）、右美托咪定+利多卡因組（DL組）。C組僅行鞘內(nèi)置管術(shù)，L組和DL組在鞘內(nèi)置管后鞘內(nèi)注射10%鹽酸利多卡因20 μL，其中DL組在鞘內(nèi)注射利多卡因前1 h，腹腔注射右美托咪定15 μg/kg。分別于術(shù)前1 d（基礎(chǔ)值）及術(shù)后1、2、3 d時測定熱縮足潛伏期（TWL）。于術(shù)后3 d行為學(xué)測定結(jié)束后處死大鼠，取脊髓組織，采用TUNEL染色測定大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率，Western bolt測定脊髓腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）表達(dá)水平。 結(jié)果 三組大鼠TWL基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；C組大鼠各時點(diǎn)TWL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與C組比較，L組大鼠術(shù)后1、2、3 d時TWL均延長（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠術(shù)后2、3 d時TWL均縮短（P < 0.05）。與C組比較，L組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率升高（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低（P < 0.05）。與C組比較，L組大鼠脊髓內(nèi)TNF-α和IL-8的表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓內(nèi)TNF-α和IL-8的表達(dá)減弱（P < 0.05）。 結(jié)論 右美托咪定通過抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減輕利多卡因所致的大鼠脊髓神經(jīng)損傷，其機(jī)制與抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 右美托咪定；利多卡因；神經(jīng)損傷；凋亡；炎性因子

[中圖分類號] R741 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）03（c）-0022-04

Influence of Dexmedetomidine on Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats

CHEN Ji1 TAN Xiuhua1 PANG Tao2 ZHAN Hong1▲

1.Department of Anesthesiology， the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510150， China； 2.Department of Clinical Laboratory， Family Planning Specialty Hospital， Guangdong Province， Guangzhou 510600， China

[Abstract] Objective To evaluate the influence of Dexmedetomidine on Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats. Methods 24 male SD rats weighting from 250 to 280 g were divided into three groups （n=8） by random number table： control group （Group C）， Lidocaine group （Group L） and Dexmedetomidine+Lidocaine group （Group DL）. Group C was only given intrathecal cathetering， while group L and group DL were given 20 μL of 10% Lidocaine hydrochloride via intrathecal injection after intrathecal cathetering， where group DL was given 15 μg/kg of Dexmedetomidine via abdominal injection 1 h before intrathecal injection of Lidocaine. Thermal withdrawal latency （TWL） was determined on 1 d before operation （baseline） and postoperative 1， 2 and 3 d. The rats were sacrificed at the end of behavior determination at postoperative 3 d， and the spinal cord tissues were taken. TUNEL staining was used to determine the apoptosis of rat spinal neurons， and Western blot was used to determine the expressions of TNF-α and IL-8. Results There were no statistical differences among each group of rats in baseline TWL （P > 0.05）， and there were no statistical differences in baseline rat TWL in group C among different time points （P > 0.05）. Compared with group C， rat TWL of group L were all prolonger at postoperative 1， 2 and 3 d （P < 0.05）. Compared with group L. rat TWLs of group DL were all shorter at postoperative 2 and 3 d （P < 0.05）. Compared with group C， cell apoptosis rate of spinal neuron was increased and the expressions of TNF-α and IL-8 were increased in group L （P < 0.05）. Compared with group L， cell apoptosis rate of spinal neuron was decreased and the expressions of TNF-α and IL-8 were decreased in group DL （P < 0.05）. Conclusion Dexmedetomidine can reduce the Lidocaine-induced spinal cord never injury in rats by anti-apoptosis of neurons， and the mechanism is related to inhibition on inflammation.

[Key words] Dexmedetomidine； Lidocaine； Never injury； Apoptosis； Inflammation factor

椎管內(nèi)麻醉為臨床常用的麻醉方法，但局麻藥的神經(jīng)毒性可引起多種相關(guān)并發(fā)癥，影響患者預(yù)后，其機(jī)制與炎性細(xì)胞因子引起神經(jīng)元凋亡有關(guān)[1-2]。右美托咪定為高選擇性α2腎上腺素能受體激動藥，可降低交感神經(jīng)張力，從而間接提高了迷走神經(jīng)張力，具有器官保護(hù)作用[3]。有研究已證實(shí)，右美托咪定激活副交感神經(jīng)抗炎通路，抑制炎性反應(yīng)，對休克和腦缺血再灌注損傷大鼠產(chǎn)生保護(hù)作用[4-5]。然而，右美托咪定是否能減輕局麻藥引起的脊髓神經(jīng)毒性尚不清楚。因此，本研究旨在評價右美托咪定對利多卡因致大鼠脊髓神經(jīng)損傷的影響，為臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性SD大鼠24只，體重250～280 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（動物合格證號SCXK2013-0024）。實(shí)驗(yàn)流程遵循廣州醫(yī)科大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)本單位實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)。于室溫24℃，濕度55%～65%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為三組（n=8）：對照組（C組）、利多卡因組（L組）、右美托咪定+利多卡因組（DL組）。

1.2 試劑及儀器

二甲基亞砜（Sigma公司，美國），右美托咪定（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：H20090248），PE-10導(dǎo)管（Smiths Medical公司，英國），BME-410A熱痛刺激儀（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）克隆抗體（Santa Cruz公司，美國），山羊抗兔IgG抗體（Santa Cruz公司，美國）。

1.3 模型建立

按參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行鞘內(nèi)置管。腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，俯臥位，在枕骨大孔上方縱向切長約2 cm的切口，鈍性分離皮下組織和頸部肌肉，暴露寰枕膜，用針尖挑破寰枕膜可見清澈腦脊液涌出并隨呼吸波動，將已經(jīng)消毒、一端封閉的充滿生理鹽水的PE-10導(dǎo)管向尾端插入7 cm，以鼠尾突然出現(xiàn)側(cè)擺或后腿抽動為導(dǎo)管成功到達(dá)椎管內(nèi)的標(biāo)志。至脊髓腰骶段，然后固定導(dǎo)管，并逐層縫合切口。術(shù)畢第1天鞘內(nèi)注射1%利多卡因20 μL，30 s之內(nèi)出現(xiàn)雙下肢癱瘓者為利多卡因篩選實(shí)驗(yàn)陽性，如鉗夾雙上肢，躲避反應(yīng)存在，而雙下肢無反應(yīng)，夾尾反射消失，則選入實(shí)驗(yàn)。術(shù)畢出現(xiàn)四肢癱瘓、活動障礙及利多卡因?qū)嶒?yàn)陰性或出現(xiàn)單側(cè)肢體癱瘓者排除。

給藥方法

1.4 給藥方案

C組僅行鞘內(nèi)置管后1 d注射二甲基亞砜20 μL對照；L組鞘內(nèi)置管后1 d注射10%利多卡因（將5 g利多卡因標(biāo)準(zhǔn)品溶于50 mL二甲基亞砜中）20 μL；DL組在鞘內(nèi)置管1 d后注射10%利多卡因，注射利多卡因前1 h腹腔注射右美托咪定15 μg/kg。

1.5 痛閾測定

參考文獻(xiàn)[7]采用熱輻射法分別于術(shù)前1 d（基礎(chǔ)值）及術(shù)后1、2、3 d時測定熱縮足潛伏期（TWL）。將一個有機(jī)玻璃箱置于3 mm厚的玻璃板上，大鼠放在玻璃板上安靜后，采用BME-410A熱痛刺激儀照射大鼠足底前外側(cè)1/3處，照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時間為TWL，最長照射時間為30 s，以防止組織損傷，測定5次，每次間隔5 min，取測定結(jié)果的平均值。

1.6 TUNEL染色

于術(shù)后3 d行為學(xué)測試結(jié)束后，在各組大鼠隨機(jī)抽取4只，腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉下，開胸，經(jīng)心臟灌流生理鹽水100 mL及4%多聚甲醛100 mL，分離并取L4～6段脊髓組織，于Bonin′s液中固定24 h，組織塊經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋成蠟塊，延垂直脊髓長軸方向連續(xù)切片，片厚5 μm，制備切片分別用于TUNEL染色[8]。切片常規(guī)二甲苯脫臘梯度酒精脫水后蒸餾水沖洗。3%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水沖洗3 min×3次。標(biāo)本片加TBS 1∶200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化15 min，TBS洗1 min×3次[9-10]。標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液（Labeling，Buffer），20 μL/片，以保持切片濕潤，并置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h，TBS洗3 min×3次。用1%的TBS稀釋SABC，均勻后50 μL/片加至切片，37℃反應(yīng)60 min，TBS洗5 min×4次[11]。DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗5 min。蘇木素復(fù)染1 min。TBS洗，蒸餾水洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片。應(yīng)用Image-pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析處理，取各大鼠脊髓斷面水平的連續(xù)切片，各組每個時間點(diǎn)每只大鼠選取三張切片，每張切片在損傷區(qū)隨機(jī)采集5個400倍視野[12]。400倍視野下計算凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 Western bolt分析

將其余4只大鼠腹腔注射水合氯醛350 mg/kg麻醉下斷頭取脊髓，分離L4～6段脊髓組織采用Western bolt，使用細(xì)胞裂解液提取蛋白，用Bradfor法進(jìn)行蛋白定量，采用蛋白定量測定試劑盒（上海美季生物技術(shù)有限公司）[13-14]。取蛋白在SDS-聚丙酰胺凝膠上電泳，后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶37℃封閉1 h，加入兔抗大鼠TNF-α和IL-8克隆抗體（1∶5000），4℃孵育過夜；加入堿性磷酸酯酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（1∶1000），常溫孵育2 h，曝光成像[15]。用Scion Image軟件檢測磷TNF-α和IL-8目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值，其比值作為TNF-α和IL-8蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠不同時點(diǎn)TWL比較

三組大鼠TWL基礎(chǔ)值比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；C組大鼠各時點(diǎn)TWL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；與C組比較，L組大鼠術(shù)后1、2、3 d時TWL均延長（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠術(shù)后2、3 d時TWL均縮短（P < 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時點(diǎn)TWL比較（s，x±s）

注：與C組比較，*P < 0.05；與L組比較，#P < 0.05；TWL：熱縮足潛伏期；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

2.2 各組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較

與C組比較，L組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率升高（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率降低（P < 0.05）。見表2、圖1。

表2 各組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率比較（%，x±s）

注：與C組比較，#P < 0.05；與L組比較，*P < 0.05；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組

圖1 各組大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，400×）

2.3 各組大鼠脊髓炎癥因子表達(dá)比較

與C組比較，L組大鼠脊髓內(nèi)TNF-α和IL-8的表達(dá)增強(qiáng)（P < 0.05）；與L組比較，DL組大鼠脊髓內(nèi)TNF-α和IL-8的表達(dá)減弱（P < 0.05）。見表3、圖2。

表3 各組大鼠脊髓炎癥因子表達(dá)比較（x±s）

注：與C組比較，#P < 0.05；與L組比較，*P < 0.05；C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白細(xì)胞介素-8

C組：對照組；L組：利多卡因組；DL組：右美托咪定+利多卡因組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-8：白細(xì)胞介素-8

圖2 各組大鼠脊髓炎癥因子表達(dá)情況

3 討論

本研究采用鞘內(nèi)置管注射10%利多卡因的方法制備大鼠脊髓神經(jīng)毒性模型，結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射利多卡因后大鼠TWL升高，腰段脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡增多，與相關(guān)文獻(xiàn)[7]結(jié)果一致，提示利多卡因誘發(fā)大鼠脊髓神經(jīng)毒性的模型制備成功。

高濃度局麻藥所致的神經(jīng)損傷是多個環(huán)節(jié)調(diào)控導(dǎo)致細(xì)胞凋亡而形成的最終結(jié)果，利多卡因可破壞神經(jīng)纖維膜的磷脂和蛋白結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生不可逆性膜破裂，同時也抑制細(xì)胞氧化磷酸化過程，影響線粒體跨膜動作電位，從線粒體途徑促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[16]，同時也有研究證實(shí)，局部注射高濃度利多卡因可激活神經(jīng)組織內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生神經(jīng)炎性反應(yīng)[17]。本研究證實(shí)，10%利多卡因鞘內(nèi)注射后將引起脊髓神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡，也在腰段脊髓內(nèi)檢測出高于正常水平的炎癥因子如TNF-α和IL-8。

右美托咪定作為α2腎上腺素能受體激動劑，其抗炎作用機(jī)制為直接抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成炎性因子，并激活膽堿能抗炎通路[18]。IL-8由單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其功能是激活中性粒細(xì)胞導(dǎo)致機(jī)體局部的炎性反應(yīng)，達(dá)到殺菌和細(xì)胞損傷的目的[19]。TNF-α是最重要的炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)組織代謝活性并促使其他炎癥因子的合成和釋放[20]。本研究證實(shí)，脊髓神經(jīng)損傷時，右美托咪定可有效抑制TNF-α和IL-8過表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對抗神經(jīng)凋亡的作用，提示IL-8可能是右美托咪定產(chǎn)生抗炎作用時細(xì)胞因子層面的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，右美托咪定通過抗神經(jīng)元細(xì)胞凋亡減輕利多卡因所致的大鼠脊髓神經(jīng)損傷，其機(jī)制與抑制炎性反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。

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（收稿日期：2016-12-23 本文編輯：李亞聰）