懷牛膝多糖的微波提取工藝研究

郭婕，李季平，劉中華

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口 466001）

懷牛膝多糖的微波提取工藝研究

郭婕，李季平，劉中華

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南周口 466001）

懷牛膝多糖是常用中藥牛膝中的主要活性成分，可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，是重要的多糖藥物之一。本實(shí)驗(yàn)采用微波輔助法提取懷牛膝中多糖，溶劑為水，采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定懷牛膝多糖含量，通過單因素及正交試驗(yàn)研究微波功率、料液比、提取溫度和微波作用時(shí)間對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響。結(jié)果表明，懷牛膝多糖微波提取的最佳工藝條件為：微波功率為600W、料液比1:20（g/mL）、浸取溫度為70℃、微波處理時(shí)間4min。

懷牛膝；多糖；微波提取

懷牛膝（Achyranthes bidentataB1）為莧科植物牛膝的干燥根[1]，屬四大懷藥，具有逐瘀通經(jīng)、通利關(guān)節(jié)、利尿通淋的作用，其中含有豐富的水溶性多糖。懷牛膝多糖是從懷牛膝根中提取、分離、純化得到的一種小分子水溶性的多糖化合物，是常用中藥牛膝中研究的較為透徹的活性成分，可作為一種免疫調(diào)節(jié)劑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)懷牛膝多糖具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及多種免疫調(diào)節(jié)作用[2]，已成為重要的多糖藥物之一。懷牛膝多糖與牛膝寡聚糖相比，免疫性更強(qiáng)。

懷牛膝多糖常見的提取方法，往往存在有效成分損失大、工序復(fù)雜、提取周期長、提取率較低等缺點(diǎn)。微波射線穿透性極好，能充分保護(hù)有效成分，對(duì)熱敏性成分的浸提極為有效。微波提取具有選擇性好、操作簡便、提取周期短、能耗低、提取率高等特點(diǎn)。微波提取在藥物成分提取及食品加工行業(yè)應(yīng)用廣泛[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)以懷牛膝為研究材料，利用微波技術(shù)研究了微波功率、料液比、提取溫度和微波作用時(shí)間對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)，考察了懷牛膝多糖提取工藝的最佳參數(shù)組合。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷牛膝，購于同和堂大藥房。

葡萄糖、氯仿、正丁醇、乙醚、98%濃硫酸均購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水乙醇，購于天津市富宇精細(xì)化工有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取粉碎的懷牛膝4g，置于干凈的錐形瓶中，按照料液比向錐形瓶中加入蒸餾水浸泡1h，微波提取2次，合并提取液，按照5∶1的比例在合并液中加入氯仿∶正丁醇=5∶1混合液后充分搖勻，4000r/min離心10min除去蛋白質(zhì)，將上清液置于90℃的烘箱中濃縮。取出濃縮液，冷卻，按照濃縮液與乙醇比為1∶3的比例加入95%乙醇，沉淀。然后攪拌均勻，靜止過夜，4000r/min離心15min，取沉淀，用乙醚洗滌沉淀，即為懷牛膝多糖粗提物[4]。

1.3 測(cè)定方法

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定懷牛膝多糖含量。將懷牛膝多糖粗提物置于干凈的錐形瓶中，向其中加入200mL蒸餾水，取1mL作為待測(cè)液測(cè)其吸光度。根據(jù)回歸方程算出測(cè)量液多糖濃度C0（μg/mL），按照以下公式計(jì)算懷牛膝多糖的提取率（mg/g）。

式中：C0，測(cè)量液多糖濃度，μg/mL；

V，粗提取液體積，mL；

K，為稀釋倍數(shù)；

W，原料干重，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定[5]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)方程式為y=0.027x-0.0094，R2=0.9946，y為吸光度，x為葡萄糖濃度（μg/mL）。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 微波功率對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

在料液比為1∶20（g/mL）、溫度為80℃、微波處理時(shí)間2min的條件下，研究不同微波功率（150W、300W、 450W、600W、750W）對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 微波功率對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著微波功率的提高，懷牛膝多糖的提取率起初隨之升高；當(dāng)微波功率達(dá)到450W時(shí)，多糖的提取率最高為12.64%，但是隨著微波功率的繼續(xù)提高，多糖的提取率反而略有下降。這可能是因?yàn)槲⒉üβ蔬^低，溫度低，浸提不完全；微波功率過大時(shí)，加熱溫度太高，可能會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)[6]，對(duì)提取多糖不利。因此，本試驗(yàn)選取450W為微波提取功率。

2.2.2 料液比對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

在微波功率300W、溫度為80℃、微波處理時(shí)間2min的條件下，研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

由圖2可知，懷牛膝多糖提取率隨著料液比的減少呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，懷牛膝多糖提取率達(dá)到最高，為17.0%。分析原因可能在于溶劑用量影響有效成分浸出液的濃度，從而影響到原料內(nèi)部與外部之間成分的擴(kuò)散過程。料液比太大，提取不完全；料液比太小，回收、過濾、轉(zhuǎn)移困難，造成浪費(fèi)，并且后期濃縮成本高。本試驗(yàn)選取1∶20（g/mL）的料液比。

2.2.3 提取溫度對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

在微波功率為300W、料液比為1∶20（g/mL）、微波處理時(shí)間2min條件下，研究不同微波提取溫度（室溫、60℃、70℃、80℃、90℃）對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

由圖3可知，在設(shè)置溫度內(nèi)懷牛膝多糖提取率隨著溫度的升高逐漸上升，提取溫度為80℃時(shí)，多糖提取率最高，之后呈下降趨勢(shì)。溫度較低時(shí)，以水作為溶劑萃取多糖，效率比較低，隨著溫度的升高，多糖的提取率增加[7]，而溫度過高時(shí)，多糖成分被破壞而使提取率下降。本試驗(yàn)選取提取溫度為80℃。

2.2.4 微波處理時(shí)間對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)得知微波處理時(shí)間對(duì)懷牛膝多糖的提取率有很大影響。在微波功率為300W、料液比為1∶20（g/mL）、溫度為80℃的條件下，研究不同微波處理時(shí)間（1min、2min、3min、4min、5min）對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

由圖4可知，微波處理時(shí)間在3min時(shí)對(duì)懷牛膝多糖的提取率最高，隨著微波加熱時(shí)間的增加多糖提取率反而下降。微波處理時(shí)電磁波把能量直接傳播到懷牛膝根內(nèi)部，使之瞬間加熱，懷牛膝根內(nèi)多糖分子運(yùn)動(dòng)迅速加劇，向外部溶液擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)急劇增加，產(chǎn)生爆沸，導(dǎo)致水分迅速流失，水分中的多糖分子也由于溫度的瞬間上升導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)被破壞；當(dāng)微波提取一定的時(shí)間后，懷牛膝多糖完全溶解出來，但隨著提取時(shí)間的延長，溫度升高，一部分多糖被破壞，從而導(dǎo)致微波提取曲線先升后降。因此，本試驗(yàn)選取微波時(shí)間為3min。

圖4 微波時(shí)間對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響

2.3 微波條件的正交優(yōu)化

為了確定微波功率、料液比、微波時(shí)間、提取溫度共同作用對(duì)懷牛膝多糖提取率的影響，得到微波提取懷牛膝多糖工藝的最佳條件，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表對(duì)以上因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素水平安排見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2（表2見下頁）。

由表2可知，通過正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析，影響懷牛膝多糖提取率的幾個(gè)因素順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即微波時(shí)間＞料液比＞提取溫度＞微波功率；微波提取懷牛膝多糖的最佳工藝條件為：A3B2C1D3，即微波功率600W、料液比1∶20（g/mL）、浸取溫度70℃、微波處理時(shí)間4min。此工藝條件下，懷牛膝多糖的提取率為12.37%，均優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用苯酚-硫酸比色法測(cè)定懷牛膝多糖含量，其原理是多糖在濃硫酸的作用下水解成單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，此糠醛衍生物與苯酚縮合生成有色化合物。本法簡單快速，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可為懷牛膝資源的開發(fā)及應(yīng)用提供相關(guān)參考依據(jù)。懷牛膝作為馳名中外的“四大懷藥”之一，具有巨大的開發(fā)潛力。

本文通過對(duì)懷牛膝多糖提取工藝的篩選優(yōu)化，確立了懷牛膝多糖微波提取工藝條件：微波功率600W、料液比1∶20（g/mL）、浸取溫度為70℃、微波處理時(shí)間4min。在此工藝條件下，懷牛膝多糖的提取率為12.37%。其工藝條件為懷牛膝多糖進(jìn)一步研究做了前期準(zhǔn)備，具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

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[2]宋義平,劉彩玉,周剛,等.牛膝多糖對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,1998,9(3)∶158-159.

[3]夏光輝,王曉雅,李冰.微波技術(shù)在果蔬加工中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國果菜,2016,36(7)∶4-8.

[4]郭婕,胡春紅,袁淑培,等.車前草多糖微波提取工藝研究[J].食品工業(yè)科技,2014,35(16)∶223-225,230.

[5]陳鈞輝,李俊,張?zhí)?等.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) [M].科學(xué)出版社, 2008,15.

[6]李永裕,陳建煙,關(guān)夏玉,等.微波輔助提取余甘多糖的工藝研究[J].海峽科學(xué),2010,(10)∶210-213.

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Microwave Extraction Technology of Polysaccharide fromAchyranthes bidentataPolysaccharide

GUO Jie,LI Ji-ping,LIU Zhong-hua
(College of Life Science and Agronomy,Zhoukou Normal University,Zhoukou 466001,China)

Achyranthes bidentatapolysaccharide is one of the main active ingredient in traditional Chinese medicine Achyranthes bidentata,and it is one of the most important polysaccharide drugs,which can be used as an immunomodulator.Microwave extraction was used to extract polysaccharide from Achyranthes bidentata in this article, using water as solvent.The influence factors on extraction yield were studied by single factor and orthogonal experiment, which included microwave power,the solid-liquid ratio,extraction temperature and microwave-heating time.The results showed that the optimal conditions were as follows:microwave power 600W,the 1:20(g/mL)ratio of solid to liquid, extracting at 70℃for 4min.

Achyranthes bidentata;polysaccharide;microwave extraction

O657 O426.5

A

1008-1038(2017)04-0016-04

2016-12-06

2015年河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（15A180065）

郭婕（1984—），女，講師，主要從事天然藥物化學(xué)研究