普通煙草RLP類受體蛋白家族成員的鑒定與進化、表達分析

李 奎，李曉旭，劉 成，段奇佳，郭永峰*

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普通煙草RLP類受體蛋白家族成員的鑒定與進化、表達分析

李 奎1,2，李曉旭1,2，劉 成1,3，段奇佳1，郭永峰1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000）

類受體蛋白（receptor-like proteins, RLPs）作為一類細胞表面受體，廣泛存在于高等植物中，參與調(diào)控植物生長發(fā)育和抗逆等過程。本研究以普通煙草（）TN90數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，構(gòu)建隱馬爾科夫模型進行檢索，鑒定了普通煙草RLP家族成員；采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行系統(tǒng)進化分析；利用GSDS對RLP家族成員的基因結(jié)構(gòu)進行了分析；利用普通煙草TN90轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析基因家族成員的表達情況；最后對普通煙草RLP家族成員進行GO注釋分析。結(jié)果表明，在普通煙草中共鑒定出70個RLP家族成員，各成員的氨基酸序列長度和等電點差異較大；系統(tǒng)進化與基因結(jié)構(gòu)分析表明，普通煙草家族成員劃分為6個亞家族，基因結(jié)構(gòu)較為簡單；轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，基因家族成員在不同組織和發(fā)育時期的表達有較大差異，個別成員在葉片衰老時期表達量較高；GO注釋結(jié)果表明，RLPs在植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果將為普通煙草基因功能分析和利用奠定基礎(chǔ)。

普通煙草；基因家族；生物信息學(xué)分析

植物細胞表面受體以一種復(fù)雜的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞內(nèi)外各種信號。植物類受體蛋白（receptor-like proteins, RLPs）是一類重要的細胞表面受體[1]，從結(jié)構(gòu)來看，RLPs由一個單向跨膜域、兩個eLRR域以及一個短尾細胞質(zhì)域組成，eLRR域中通常含有許多潛在的糖基化位點，表明RLPs可能是錨定于細胞膜上的糖蛋白受體[2]。

RLP蛋白在植物的生長與發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[3]。擬南芥鑒定出57個基因[4]，楊樹鑒定出80個基因[5]，擬南芥CLV2和其玉米中的功能同源蛋白FEA2調(diào)控著分生組織的維持與分化以及相關(guān)器官的發(fā)育[6-7]。TMM是調(diào)控擬南芥氣孔發(fā)育的關(guān)鍵因子[8]。RLP類受體蛋白也參與植物激素的信號傳導(dǎo)，如AtRLP41調(diào)控擬南芥葉片對ABA的敏感性[4]，AtRLP44參與激活油菜素內(nèi)酯信號途徑[9]。

前期研究表明，多數(shù)RLP蛋白參與植物抗病過程[10]。包括蘋果抗黑星病菌蛋白HcrVf2[11]、番茄抗葉霉菌Cf類蛋白[12]、番茄抗黑白輪枝菌Ve類受體蛋白[13]、油菜莖基潰瘍病菌小種特異性抗性蛋白LepR3[14]等。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了抗病蛋白，如AtRLP01能夠識別來自黃單胞菌的PAMP信號ReMAX，參與抗病反應(yīng)[15]； AtRLP52參與調(diào)控擬南芥對二孢白粉菌的防衛(wèi)響應(yīng)[16]；AtRLP51參與NPR1介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[17]；AtRLP42能夠識別真菌PAMP信號多聚半乳糖醛酸酶（PG）信號[18]。

RLP蛋白生物學(xué)功能研究主要集中在擬南芥，如CLV2、TMM[19]等，以及其他諸如蘋果HcrVf2蛋白、番茄Cf和Ve蛋白及小麥TaRLP1.1蛋白[20]，而煙草RLP蛋白的研究還未見報道。研究普通煙草基因結(jié)構(gòu)、表達模式及其所編碼蛋白的理化性質(zhì)，有利于進一步研究其在煙草生長發(fā)育過程中的功能。本研究采用生物信息學(xué)方法從普通煙草基因組中鑒定了70個基因，并分析了家族成員的進化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、表達情況等，用Blast2GO進行GO注釋，對其生物學(xué)功能進行預(yù)測，為開展普通煙草基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 普通煙草RLP家族成員的鑒定及序列分析

根據(jù)關(guān)于AtRLPs的文獻[4]，從TAIR數(shù)據(jù)庫（http://www.arabidopsis.org/）下載了擬南芥RLP家族蛋白全長序列。在茄科植物數(shù)據(jù)庫（http://solgenomics.net/）下載普通煙草TN90蛋白序列。用構(gòu)建的隱馬爾科夫模型檢索普通煙草TN90蛋白序列數(shù)據(jù)庫，獲得RLP候選序列，然后用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）工具剔除不含LRR的蛋白，得到普通煙草的RLP。利用ExPASy Proteomics Server（http://web.expasy.org/protparam/）工具對RLP家族成員的氨基酸長度、分子量大小、蛋白質(zhì)疏水性、理論等電點等進行分析。

1.2 普通煙草RLP家族系統(tǒng)發(fā)育分析

參照文獻[21]中方法，將預(yù)測的普通煙草RLP與擬南芥RLP蛋白全長序列進行比對。根據(jù)比對結(jié)果，用MGEA5重建鄰接發(fā)育樹。

1.3 普通煙草基因結(jié)構(gòu)分析

在茄科植物數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/），下載普通煙草TN90全基因組數(shù)據(jù)，用Perl程序分析所提取的基因的結(jié)構(gòu)信息，最后使用GSDS（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）工具對普通煙草基因結(jié)構(gòu)進行可視化展示。

1.4 普通煙草基因表達分析及GO注釋分析

在NCBI SRA（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載普通煙草TN90轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，將表達數(shù)據(jù)標準化后用R語言pheatmap程序繪制熱圖（heatmap），將其表達數(shù)據(jù)可視化。用Blast2GO對普通煙草RLP蛋白序列進行GO（Gene Ontology）注釋分析，利用WEGO工具對注釋結(jié)果進行進行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1 普通煙草RLP家族成員鑒定及其理化性質(zhì)分析

基于WANG等[4]對擬南芥RLP家族成員的分析，在普通煙草全基因組中鑒定出70個家族基因，將其命名（表1）。對普通煙草RLP家族成員進行蛋白序列和理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，RLP家族成員間氨基酸的長度差異較大，介于119aa（NtRLP63）~1136aa（NtRLP53），蛋白分子量則介于13.40 kD~83.55 kD。NtRLP家族成員蛋白的理論等電點從4.49（NtRLP67）到9.26（NtRLP38）不等，變化范圍較大，其中第II亞組中除了NtRLP51理論等電點（PI=8.56）大于7.0在堿性范圍內(nèi)，其他成員的理論等電點小于7.0（PI<7.0），均在酸性范圍內(nèi)，說明這些成員富含酸性氨基酸；第III亞組中，NtRLP19（PI=7.82）富含堿性氨基酸，其余成員的理論等電點小于7.0（PI<7.0），表明其富含酸性氨基酸；第VI亞組除了NtRLP07（PI=7.18）富含堿性氨基酸外，其他成員富含酸性氨基酸（PI<7.0），說明第II、III和VI亞家族絕大部分成員的蛋白由較多的酸性氨基酸組成。NtRLP家族中有26個成員蛋白疏水性為正值，說明其為疏水性蛋白；44個成員蛋白疏水性為負值，表明其為親水性蛋白。

表 1 普通煙草RLP家族成員理化性質(zhì)分析

2.2 普通煙草RLP家族系統(tǒng)進化與基因結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥RLP家族為參考，根據(jù)序列比對的結(jié)果，利用MEGA重構(gòu)了鄰接樹（圖1）。系統(tǒng)進化分析顯示，普通煙草70個RLP家族成員可劃分為6個亞家族，第I~VI亞家族的成員個數(shù)分別為20、10、9、7、17、7。在6個亞家族中，第VI亞家族較其他5個亞家族親緣關(guān)系較遠，是一個較為獨立的分支，而又與該家族其他成員的親緣關(guān)系較遠，是比較特殊的一個。

利用GSDS構(gòu)建普通煙草基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖（圖2）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，在家族70個成員中，45個成員沒有內(nèi)含子，17個只有1個內(nèi)含子，5個成員有4個內(nèi)含子，剩余基因所內(nèi)含子數(shù)目不等。第I亞組中，有10個內(nèi)含子，是家族中最多的；在第III亞家族中，除、外，其余成員均沒有內(nèi)含子。整體來看，基因家族成員結(jié)構(gòu)較為簡單。

2.3 普通煙草基因家族的基因表達分析

基于TN90轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，將普通煙草基因的表達數(shù)據(jù)標準化后用R語言進行可視化展示（圖3）。圖3顯示，普通煙草基因在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉等5個組織中都有表達。其中，、兩個基因在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉5個組織中表達量都較高，說明其可能在整個發(fā)育過程中都起作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，少數(shù)的基因的表達具有一定的組織特異性。特別是、、、四個基因在成熟葉中的表達量較高，表明它們可能參與調(diào)控營養(yǎng)生長向生殖生長過程的轉(zhuǎn)換。而僅在根部表達，可能調(diào)控根部的發(fā)育；、、只在莖部表達，在其他四個組織沒有表達，表明其與莖部的發(fā)育密切相關(guān)。有些基因的表達具有一定的規(guī)律性，如、隨著生長發(fā)育的進行表達量逐漸升高，在衰老葉片中表達量達到最高，而、只在衰老葉片中表達，據(jù)此可以推測它們可能參與調(diào)控葉片的衰老進程。

2.4 普通煙草RLP家族GO注釋分析

我們對普通煙草RLP蛋白序列從細胞組成（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和參與的生物學(xué)過程（Biological Process）三個方面進行GO注釋（圖4）。Go注釋結(jié)果表明，在細胞組成和分子功能方面，普通煙草的RLP蛋白在細胞表面發(fā)揮結(jié)合和轉(zhuǎn)運作用，這與RLP蛋白作為一類細胞表面受體的功能相吻合。RLP家族成員的生物學(xué)功能呈多樣化，主要參與細胞物質(zhì)代謝、酶代謝、多細胞組織形成、生長發(fā)育等過程。

圖 1 普通煙草RLP家族成員鄰接進化樹

注：T1，根；T2，莖；T3，幼葉；T4，成熟葉；T5，衰老葉。

3 討 論

RLP類受體蛋白廣泛參與植物生長發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、植物激素信號傳導(dǎo)等過程。擬南芥CLV2與CRN結(jié)合形成傳導(dǎo)CLV3信號受體復(fù)合體，調(diào)控擬南芥莖頂端分生組織發(fā)育[22],小麥受體類蛋白TaRLP1.1參與小麥抗條銹病響應(yīng)過程[20]。SOBIR1與LerR3、AtRLP30等蛋白相互作用，參與調(diào)控植物抗病過程[23-24]。

本研究從普通煙草基因組中鑒定出70個基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，普通煙草的家族成員被分成了個6亞家族。第IV亞組中，只有有內(nèi)含子，其余成員沒有內(nèi)含子；第VI亞組成員基因結(jié)構(gòu)差異較大。GO注釋表明，RLP在細胞表面發(fā)揮結(jié)合與轉(zhuǎn)運功能，這與其作為受體蛋白相吻合。WANG等[4]的研究表明可能參與調(diào)控擬南芥葉片衰老過程。我們利用Arabidposis eFP Broswer(http://bbc.botany.utoronto.ca)數(shù)據(jù)庫分析家族成員表達模式，發(fā)現(xiàn)、、等在衰老葉片中表達水平非常高，可能參與擬南芥葉片衰老調(diào)控過程。普通煙草基因表達模式分析發(fā)現(xiàn)，與同源的具有類似的衰老組織表達特異性，隨著葉片落黃其表達量顯著上調(diào)，衰老葉片中表達量達到最高，其可能參與普通煙草葉片衰老的調(diào)控過程。特別需要指出的是，，兩個基因只在衰老的葉片中表達，這表明他們同樣可能參與普通煙草葉片衰老的調(diào)控。本研究對普通煙草基因家族進行了全基因組鑒定、表達模式分析和功能注釋等分析，但其具體的生物學(xué)功能還有待于利用分子生物學(xué)方法進行進一步驗證。

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Genome-wide Identification and Expression Analysis of theGene Family in

LI Kui1,2, LI Xiaoxu1,2, LIU Cheng1,3, DUAN Qijia1, GUO Yongfeng1*

(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Qujing Tobacco Company of Yunnan, Qujing, Yunnan 655000, China)

Receptor-like proteins (RLPs) as an important class of cell surface receptors, are present in many plant species. RLPs have been implicated in multiple biological processes including plant development and stress responses. In this study, 70 RLP family genes were identified in. Phylogenetic analysis was performed using the neighbor-joining method and the results showed that thesefamily members could be classified into 6 subfamilies. Transcriptome analysis revealed that the expression patterns ofwere distinct in different tissue types and at different developmental stages, with a number of genes being up-regulated in senescing leaves. GO analysis suggested that the RLP family members could be potentially involved in a number of biological processes including developmental regulation and stress responses. The results of this study could be valuable resources for future investigation of the functions ofs in.

;family; bioinformatic analysis

S572.03

1007-5119（2017）02-0063-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.011

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費增量重點項目“煙草葉片衰老的分子調(diào)控機制研究”（2013ZL024）

李 奎（1989-），男，碩士研究生，研究方向：煙草分子育種，E-mail：lk928346616@126.com。

，E-mail：guoyongfeng@caas.cn

2016-11-17

2017-02-19