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    海人藻酸致急慢性癲癇模型中Nrf2的變化及其對神經(jīng)元的影響

    2017-05-10 06:02:00向紹杰李紀彤秦文艷劉小虎張冰冰
    中風與神經(jīng)疾病雜志 2017年4期
    關鍵詞:海馬癲癇神經(jīng)元

    齊 越, 向紹杰, 姜 鴻, 李紀彤, 秦文艷, 劉小虎, 韋 丹, 張冰冰, 賈 冬

    海人藻酸致急慢性癲癇模型中Nrf2的變化及其對神經(jīng)元的影響

    齊 越1, 向紹杰1, 姜 鴻1, 李紀彤3, 秦文艷1, 劉小虎1, 韋 丹2, 張冰冰2, 賈 冬2

    目的 探討海人藻酸致急慢性癲癇模型中Nrf2的變化及其對神經(jīng)元的影響。方法 大鼠海馬內(nèi)注射濃度為(1 μg/μl)海人藻酸(KA)1.0 μl后,隨機分為模型24 h組(急性模型組)及模型28 d組(慢性模型組),假手術組注射等體積的生理鹽水,每組10只。尼氏染色法觀察神經(jīng)元的變化;免疫組化及免疫印跡法測定Nrf2的表達。結果 尼氏染色結果顯示,與假手術組相比,模型24 h組與模型28 d組尼氏小體均減少,但以模型28 d組減少顯著;免疫組化及免疫印跡結果表明,模型24 h組的表達增加,模型28 d組表達則減少。結論 Nrf2在急性模型表達上調(diào),具有抗氧化作用,進而保護神經(jīng)元;慢性模型中則不具有抗氧化作用,神經(jīng)元受損。

    癲癇; 海人藻酸; Nrf2

    氧化應激是指體內(nèi)的氧化作用與抗氧化作用失衡所致,目前許多疾病的發(fā)生均與氧化應激有關,如:癲癇、多發(fā)性硬化、帕金森病及肌萎縮性側索硬化等。大量研究發(fā)現(xiàn),癲癇發(fā)生時常伴有非?;钴S的自由基活動[1~3]。因此,清除自由基成為阻斷癲癇發(fā)生的又一新領域。Nrf2-ARE通路是體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化的一條重要通路,Nrf2是參與調(diào)節(jié)機體抗氧化應激過程重要轉錄因子,研究證明,激活Nrf2-ARE信號通路可以有效地減輕氧化應激損傷從而保護神經(jīng)元。因此本實驗考察了Nrf2對海人藻酸致急慢性癲癇模型中神經(jīng)元的影響,為闡明癲癇的病理生理機制提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與試劑 選擇健康雄性SPF級Wistar大鼠40只,體重180~200 g,遼寧長生生物技術有限公司提供[動物許可證號:SCXK(遼)2010-0001]。動物于遼寧中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng),許可證號:SYXK(遼):2010-0003。飼養(yǎng)室溫度:20 ℃~23 ℃,飼養(yǎng)室濕度:50%~60%。海人藻酸(KA)(Sigma公司),一抗(Nrf2,北京博奧森生物試劑公司),免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術有限公司),甲苯胺藍,Nonident P40,EGTA,HEPES,DTT(Solarbio公司),EDTA(Amresco公司)。

    1.2 模型制備及分組 參考文獻并進行改進[4~6],大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后,固定于腦立體定位儀上,碘酒、酒精消毒,沿顱頂正中線做3~4 cm的手術切口,逐步分離骨膜,尋找囟門位置,以囟門為零點,向后5.7 mm,中線旁開4.6 mm,深約4.3 mm。牙科鉆刺破顱骨后,微量進樣器垂直進針,緩慢勻速地注射濃度為(1 μg/μl)KA 1.0 μl,留針5 min,待KA充分彌散后緩慢撤針(假手術組大鼠注射等體積的生理鹽水),碘伏酒精再次消毒后,縫合皮膚。從注入腦內(nèi)KA后的時間點算起,4 h內(nèi)大鼠達到Racine分級的Ⅳ以上為造模成功。判斷癲癇發(fā)作程度按照Racine[7]制定的分級法:0級:正常,無任何反應;Ⅰ級:面部出現(xiàn)抽搐、眨眼、咀嚼、哈欠、胡須顫抖;Ⅱ級:出現(xiàn)點頭動作、頸部肌肉抽動、頻繁的出現(xiàn)“濕狗樣動作”;Ⅲ級:出現(xiàn)一側前肢陣攣;Ⅳ級:出現(xiàn)雙側前肢陣攣、后肢站立;Ⅴ級:雙側前肢陣攣、后肢站立、失去平衡、跌倒。將造模成功的大鼠隨機分為急性模型組(模型成立后24 h)及慢性模型組(模型成立28 d后,每組10只,假手術組10只。

    1.3 標本制備 各組大鼠分別于模型成立24 h及28 d后,冰上取腦,快速分離出海馬,稱重,液氮冷凍后,用于免疫印跡檢測;余下大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)實施麻醉后,將其固定在手術臺上,暴露心臟,預冷的生理鹽水心臟灌流,待流出的血液呈無色澄清時,換成4%多聚甲醛進行灌流,直至大鼠身體變僵硬為止,取腦,放入4 ℃的4%多聚甲醛固定,用于HE染色、尼氏染色及免疫組化檢測。

    1.4 HE染色 按常規(guī)方法對腦組織標本進行HE染色。

    1.5 尼氏染色 將石蠟切片標本常規(guī)脫蠟至水后,浸入到10 g/L 的甲苯胺藍溶液中染色6 min,蒸餾水浸泡5 min,用于去除浮色,再依次放入70% 乙醇2 min,95%乙醇乙醇5 min,無水乙醇3 min;二甲苯透明兩次,每次5 min,中性樹膠封片[8]。顯微鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞尼氏小體的染色情況。

    1.6 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟,脫水后,按照DBA 試劑盒說明書進行免疫組化染色,顯微鏡下觀察大鼠海馬區(qū)的病理變化,并使用Image J 軟件對經(jīng)免疫組化染色的大腦切片海馬區(qū)40倍放大圖片進行灰度值分析。

    1.7 Western blot 印跡法檢測海馬Nrf2的表達 各組大鼠的海馬組織按照10 ml/g的比例加入全細胞裂解液,組織進行勻漿、超聲破碎后,加入400 μl Buffer A(1 mol HEPES 400 μl,pH 7.9;1 mol KCl 400 μl,0.1 mmol EDTA 40 μl;0.1 mmol EGTA 40 μl;加入去離子水39.12 ml。臨用前加入50 μl 10% NP-40,20 μl 0.1 mol DTT/1 ml buffer A和1× PMSF)液,移液器反復吹打混勻,冰上裂解15 min,震蕩10 s,12000 ×g,離心3 min,轉移上清(即胞漿蛋白),加入30 μl Buffer B(1 mol HEPES 800 μl,pH 7.9;5 mol NaCl 3.2 ml,0.1 mmol EDTA 400 μl;0.1 mmol EGTA 400 μl;加入去離子水35.2 ml。臨用前加入10 μl 0.1 mol DTT/1 ml buffer B和1× PMSF,3倍沉淀體積)液到沉淀中,重新懸浮細胞核,冰上裂解30 min,12000×g,離心15 min,取上清,即為核蛋白[9]。BCA 法蛋白定量,12% SDS-PAGE 凝膠電泳,轉膜到PVDF 膜。PVDF膜經(jīng)過5% 脫脂牛奶封閉2 h后,與Nrf2一抗( 1∶500)進行雜交反應,4 ℃過夜后,PBS漂洗3 次,每次10 min。加入相對應的二抗( 1∶3000),雜交反應2 h。Tris-Nacl 漂洗3 次,每次10 min,加入ECL 發(fā)光液,反應5 min,暗室內(nèi)進行X 線膠片曝光、顯影和定影。同一張PVDF 膜再次經(jīng)過一二抗去除液去除后,再與β-actin ( 1∶500 ) 進行雜交反應。Western blot 印跡條帶經(jīng)Gel-oc凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理。

    2 結 果

    2.1 HE染色 假手術組可見神經(jīng)元完整,細胞排列整齊且有層次,細胞核及核仁清晰,形態(tài)完整,與假手術組相比,模型24 h組可見,神經(jīng)元細胞排列較疏松,形態(tài)欠完整,層次感稍差;模型28 d組表現(xiàn)為神經(jīng)元細胞排列疏松無層次感,完整的神經(jīng)元細胞較少,呈空泡樣的神經(jīng)元細胞較多,核仁不清,固縮神經(jīng)元細胞較多,可見大量壞死神經(jīng)元細胞,細胞與細胞間的縫隙較大(見圖1)。

    2.2 尼氏染色 假手術組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞結構清晰、排列整齊,染色質分布均勻,可見豐富藍色顆粒狀的尼氏小體,與假手術組相比,模型24 h組可見,神經(jīng)元細胞排列稍松散,尼氏小體減少;模型28 d組可見,神經(jīng)元細胞結構明顯改變,數(shù)目減少,核內(nèi)染色質凝集,尼氏小體顯著減少(見圖2)。

    2.3 各組大鼠Nrf2免疫組織化學表達結果 Nrf2 免疫反應在大鼠腦內(nèi)錐體細胞的胞漿和胞核均可見其表達,可見棕黃色顆粒(見圖3)。對3組大鼠腦內(nèi) Nrf2 表達的平均光密度值(OD)測量,與假手術組相比,模型24 h組內(nèi)的Nrf2表達增加,模型28 d組Nrf2表達則顯著減少(P<0.05,見表1)。

    2.4 Nrf2免疫蛋白印跡 KA模型大鼠24 h組海馬組織胞核內(nèi)的 Nrf2 的表達明顯增強,而在假手術組和模型大鼠28 d組 Nrf2 表達相對較弱,且模型大鼠28 d組 Nrf2 表達更弱于假手術組(見圖4),Nrf2 與 β-action 免疫印跡條帶相對吸光度比值,假手術組比模型28 d組增加顯著,模型24 h組比假手術組明顯增加,具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.01,見表2)。

    表1 不同組別小鼠海馬組織Nrf2免疫組織化學 染色結果

    與對照組比較*P<0.05;與模型組比較#P<0.05

    表2 各組小鼠海馬組織Nrf2蛋白表達水平±s)

    與對照組比較*P<0.05;與模型24 h組比較#P<0.05

    A:假手術組;B:模型24 h 組;C:模型28 d組

    圖1 各組大鼠HE染色結果( ×10)

    A:假手術組;B:模型24 h 組;C:模型28 d組

    圖2 各組大鼠造模后海馬CA1區(qū)的尼氏染色(×20)

    A:假手術組;B:模型24 h組;C:模型28 d組

    圖3 各組大鼠造模后大腦皮質Nrf2免疫組織化學染色(×40)

    模型24 h組 假手術組 模型28 d組

    圖4 各組大鼠海馬組織Nrf2蛋白表達水平

    3 討 論

    研究發(fā)現(xiàn),癲癇大鼠海馬CA3區(qū)的鈣超載現(xiàn)象在癲癇發(fā)病機制中起到了重要的作用。CA3區(qū)鈣超載可破壞膜電位的穩(wěn)定性,從而導致病灶向周圍正常組織放電,如CA1區(qū),此發(fā)病機制與癲癇大發(fā)作的發(fā)病機制相同。此外,海馬 CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡也是海人藻酸顳葉癲癇模型的一個顯著的病理特點[10,11]。另外,我們前期的預實驗表明,濃度為(1 μg/μl)的KA 1.0 μl注入到海馬CA1區(qū)時可造成大鼠過半的致死量,而同樣劑量注入到海馬CA3區(qū)時致死量則大大降低,且癲癇發(fā)作程度與其無差異,因此,我們選用(1 μg/μl)的KA 1.0 μl單次注入海馬CA3區(qū),致癇潛伏期短,癲癇發(fā)作率高。

    中樞神經(jīng)系統(tǒng)在遭受外界藥物或內(nèi)毒素侵害時,其抗氧化系統(tǒng)就會發(fā)生紊亂,產(chǎn)生大量的活性氧。過多的活性氧可引起脂質過氧化并且造成DNA損傷,從而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,不斷發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病則有可能誘導其癇性發(fā)作。有文獻報道,大鼠海馬CA3區(qū)注射海人酸可導致其癇性發(fā)作,同時對其腦內(nèi)生化指標進行檢測時發(fā)現(xiàn)有大量的活性氧生成。另有研究表明,匹羅卡品制備的癲癇模型中發(fā)現(xiàn),大鼠腦內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應激損傷,有大量的氧自由基存在[12]。由此我們可知,氧化應激參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

    Nrf2-ARE信號通路可編碼的內(nèi)源性保護基因超過200個,分別起到抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。生理狀態(tài)下,Nrf2存在于細胞漿中與Keap1緊密結合,處于低活性狀態(tài),并且此復合物很容易被泛素蛋白酶迅速降解,當機體受到外界刺激和內(nèi)源性毒素侵害時,Nrf2與Keap1解離,解離后的Nrf2轉位進入細胞核,在細胞核中與Maf等小分子物質結合形成異二聚體,此異二聚體又可以與抗氧化元件ARE結合,誘導其下游的抗氧化蛋白及解毒酶的基因表達,以此來抵抗外界刺激和內(nèi)毒素的侵害[13,14]。激活Nrf2-ARE信號通路則可以有效地減輕氧化應激損傷從而保護神經(jīng)元。

    但是,目前關于Nrf2-ARF信號通路在癲癇發(fā)病過程中的表達改變尚未有明確相關報道。本研究結果顯示,急性癲癇(模型24 h組)發(fā)作后,海馬組織細胞核內(nèi)Nrf2表達明顯增加,說明急性癲癇發(fā)作激活了Nrf2信號通路;慢性癲癇(模型28 d組)發(fā)作則細胞核內(nèi)Nrf2表達顯著減少,說明Nrf2信號通路失活;與此同時,神經(jīng)元HE染色及尼氏染色結果表明,與假手術組比較,模型24 h組及模型28 d組的神經(jīng)元受損,尼氏小體減少,但以模型28 d組神經(jīng)元損傷較重,尼氏小體減少的更為突出。以上實驗結果說明,急性癲癇發(fā)作可激活Nrf2信號通路,進而發(fā)揮抗氧化作用,保護神經(jīng)元,減少海馬損傷;而慢性癲癇發(fā)作時,由于大量自由基的長期作用,可使Nrf2-ARE信號通路失活,無法發(fā)揮其抗氧化作用,從而誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡或壞死。

    因此,激活Nrf2-ARF信號通路,誘導其編碼的內(nèi)源性保護基因產(chǎn)物的生成,能夠有效減少癲癇后氧化應激損傷,可能是癲癇治療的潛在靶點。

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    Expression of Nrf2 on epileptic rat model induced by kianic acid and effect on neuron

    QIYue,XIANGShaojie,JIANGHong,etal.

    (LiaoningProvinceChineseMedicineResearchInstitute,Shenyang110034,China)

    Objective To investigate the expression of Nrf2 in epileptic rat model induced by kianic acid and its effect on neuron.Methods Rats were injected kianic acid (1 μg/μl)1.0 μl into hippocampal,and divided randomly into model 24 h (acute model group),model 28 d (chronic model group),sham group were inject equal volume saline,10 for each group.We observed the change of neuron by using Nissl staining; Immunohistochemistry and Western blotting were to measure the expression of Nrf2.Results Compared with sham,the results of Nissl staining suggested that Nissl bodies in nervous cells decreased in model 24 h group and model 28 d group,and especially in model 28 d group;the results of Immunohistochemistry and Western blotting demonstrated that the expression of Nrf2 increased in model 24 h group,decreased in model 28 d group.Conclusion Nrf2 had possible neuroprotective effect in acute kianic acid model and the mechanism was probably related to the upregulation the expression of Nrf2.

    Epilepsy; Kianic acid; Nrf2

    1003-2754(2017)04-0328-04

    2016-12-09;

    2017-03-30

    國家科技部“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”專項課題(2012ZX09102201-005);遼寧省科技廳基金資助項目(2004226010-6)作者單位:(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院,遼寧 沈陽 110034; 2.遼寧中醫(yī)藥大學,遼寧 沈陽 110847;3.遼寧中醫(yī)藥大學附屬第三醫(yī)院,遼寧 沈陽 110032)

    賈 冬,E-mail:jiadg2003@126.com

    R742.1

    A

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