香加皮對斑馬魚發(fā)育毒性及心臟毒性的影響

馮婭茹 趙崇軍 倪媛媛 田敬歡 夏青 張文婷 樊嬌嬌 馬志強(qiáng) 林瑞超

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·論著·

香加皮對斑馬魚發(fā)育毒性及心臟毒性的影響

馮婭茹 趙崇軍 倪媛媛 田敬歡 夏青 張文婷 樊嬌嬌 馬志強(qiáng) 林瑞超

目的 探討香加皮水提液對斑馬魚的發(fā)育毒性及不同暴露時(shí)間藥物對心臟毒性的影響。方法 參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織推薦的方法，將受精后6小時(shí)(6 hour-post-fertilization，6 hpf)胚胎暴露在含有不同濃度香加皮水溶液的24孔板中，分別在24、48、72、96 hpf階段測定胚胎/幼魚的自主抽動次數(shù)、心率、孵化率、死亡率等指標(biāo)。隨后，使用不同濃度的香加皮水溶液處理發(fā)育至48、72、96 hpf的斑馬魚24小時(shí)，通過死亡率確定不同暴露階段對斑馬魚心臟毒性的影響。結(jié)果 各暴露組24 hpf自主抽動次數(shù)增加、48 hpf心率以及72 hpf孵化率顯著降低，與正常對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)；24 hpf低濃度給藥組胚胎發(fā)育遲緩、眼點(diǎn)未發(fā)育、頭部偏小或未發(fā)育，高濃度組發(fā)育畸形或停留在體節(jié)期；48 hpf胚胎卵黃囊畸形、黑色素生成抑制、尾芽未脫落；72 hpf 幼魚出現(xiàn)身體彎曲、心包水腫、卵黃囊畸形等中毒癥狀。不同發(fā)育階段斑馬魚急性毒性暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：香加皮對48、72、96 hpf斑馬魚的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為：0.866 mg/mL、0.693 mg/mL和0.843 mg/mL。結(jié)論 香加皮對斑馬魚具有明顯的發(fā)育毒性和心臟毒性，且48 hpf斑馬魚非常適合進(jìn)行心臟毒性藥物篩選。

香加皮； 發(fā)育毒性； 心臟毒性； 斑馬魚

香加皮Cortex Periplocae亦稱北五加皮，為蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumPunge的干燥根皮，有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功效，常用于治療風(fēng)寒濕痹，腰膝酸軟，心悸氣短，下肢浮腫[1]。香加皮為藥典規(guī)定的有毒藥，誤用、劑量過大以及長期服用皆可引起機(jī)體出現(xiàn)心率減慢、早搏、房室傳導(dǎo)阻滯等心臟中毒癥狀，甚至致死[2]，但其并非孕婦禁忌藥，有關(guān)發(fā)育毒性的研究也未見報(bào)道。

作為一種脊椎動物模型，斑馬魚與人類基因相似度高達(dá)87%，具有完整的組織器官。斑馬魚胚胎母體外發(fā)育，發(fā)育時(shí)間短，數(shù)量大，早期胚胎透明，可直接在顯微鏡下觀察各組織臟器形態(tài)變化及血液流動情況[3]，能夠極大地彌補(bǔ)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)之間的間隙。最重要的是，斑馬魚胚胎及幼魚對大多數(shù)藥物的反應(yīng)與人類臨床反應(yīng)相似[4-5]。因此斑馬魚可作為評價(jià)藥物潛在發(fā)育毒性及器官毒性的理想模型。

本實(shí)驗(yàn)通過斑馬魚模型初步探討香加皮對斑馬魚的發(fā)育毒性以及不同發(fā)育階段給藥對斑馬魚心臟毒性的影響，以期為臨床安全用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

斑馬魚(AB-type)由本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)飼養(yǎng)提供，循環(huán)養(yǎng)殖水根據(jù)Brand等[6-7]的方法配制。水溫控制在(28±0.5)℃，pH值7.0～7.2，電導(dǎo)率450～550 μS/cm，光照/黑暗周期為14小時(shí)/10小時(shí)。成年斑馬魚每日喂食3次人工孵化的豐年蟲幼體。實(shí)驗(yàn)前一晚暗周期開始之前，將成年雌雄斑馬魚按1∶2或1∶1配對，放入帶隔板的產(chǎn)卵盒中，第2天早晨給予光照，抽掉隔板。產(chǎn)卵完成后，緩緩晃動產(chǎn)卵盒，以便讓魚卵更好地受精，隨后用吸管將魚卵收集于含有孵化水的干凈無菌培養(yǎng)皿中，用培養(yǎng)液清洗魚卵數(shù)次以除去未受精卵、糞便等雜物，將發(fā)育完整受精卵放于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器與材料

香加皮為安國圣山藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為蘿藦科植物杠柳PeriplocasepiumPunge的干燥成熟種子，斑馬魚循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技公司)；TE-2000-S光學(xué)倒置顯微鏡(NIKON)；NaCl、KCl、Na2HPO4、K2HPO4、MgSO4、NaHCO3、CaCl2，(分析純，北京化工)；1 mL，5 mL移液器(eppendorf)；胰蛋白酶(Protease from Streptomyces griseus,sigma,P6911)；恒溫培養(yǎng)箱LRH-250Z(廣州瑞明儀器有限公司)；真空干燥箱DZF-6050B(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；旋蒸儀R-1001-VN(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)。

1.3 香加皮樣品制備

香加皮水提液：取香加皮飲片，粉碎后過40目篩，稱取50 g香加皮粉末，加入10倍量的水提取2次，每次2小時(shí)，過濾后濃縮，真空干燥。

斑馬魚胚胎培養(yǎng)液：按照Zebrafish Book標(biāo)準(zhǔn)配制NaCl 0.137 mol/L、KCl 5.4 mol/L、Na2HPO40.25 mol/L、K2HPO40.44 mol/L、CaCl21.3 mol/L、MgSO41.0 mol/L、NaHCO34.2 mol/L的水溶液。

香加皮儲備液的配制：精密稱取0.2 g香加皮提取物粉末，溶于50 mL的養(yǎng)殖水中，超聲30分鐘，配置成4 mg/mL的母液。

1.4 發(fā)育毒性的評價(jià)

1.4.1 香加皮樣品溶液的配制 在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用胚胎培養(yǎng)液將母液稀釋至0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mg/mL六個(gè)濃度梯度。

1.4.2 香加皮樣品溶液處理斑馬魚胚胎 在顯微鏡下選取受精后6小時(shí)左右(hour-post-fertilization，6 hpf～8 hpf)且發(fā)育正常的胚胎，并將其隨機(jī)轉(zhuǎn)入含有不同濃度香加皮溶液的24孔板，每板設(shè)置5個(gè)藥物濃度，一個(gè)空白組，每孔5枚胚胎。28.5℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24小時(shí)更換香加皮樣品溶液1次，以保證溶液中各參數(shù)穩(wěn)定。取不同親本的胚胎重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.4.3 香加皮對斑馬魚胚胎發(fā)育影響的觀測 以培養(yǎng)液中發(fā)育的胚胎為正常對照組，通過倒置光學(xué)顯微鏡于24、48、72和96 hpf時(shí)間點(diǎn)觀察染毒后胚胎的發(fā)育情況與形態(tài)變化并詳細(xì)拍照記錄，統(tǒng)計(jì)胚胎發(fā)育全過程的死亡數(shù)及畸形數(shù)、計(jì)算LC50。

1.4.4 斑馬魚胚胎24 hpf自主抽動的測定 胚胎發(fā)育至24 hpf時(shí)尾部表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抽動。記錄24 hpf時(shí)每個(gè)濃度下1分鐘內(nèi)胚胎的自主抽動次數(shù)，每一個(gè)濃度下取7枚胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(n=7)。

1.4.5 斑馬魚胚胎48 hpf心率的測定 斑馬魚胚胎在48 hpf時(shí)心臟已基本發(fā)育完全，即出現(xiàn)規(guī)律的心跳，實(shí)驗(yàn)中記錄了48 hpf時(shí)每個(gè)濃度下胚胎10秒內(nèi)心率，每一個(gè)濃度取7枚胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(n=7)。

1.4.6 斑馬魚孵化率的測定 統(tǒng)計(jì)不同濃度處理組中斑馬魚胚胎的孵化率(孵化率=已孵化胚胎/總胚胎個(gè)數(shù)×100%)。由于胚胎在48 hpf時(shí)開始孵化，直到96 hpf時(shí)完成孵化，因此，分別選擇72、96 hpf統(tǒng)計(jì)胚胎的孵化率。

1.5 不同發(fā)育階段(48、72、96 hpf)斑馬魚心臟毒性評價(jià)

為了進(jìn)一步探究香加皮對不同發(fā)育階段斑馬魚心臟毒性的影響，在顯微鏡下選取形態(tài)發(fā)育正常的48、72、96 hpf的斑馬魚胚胎及幼魚(48 hpf胚胎需用胰蛋白酶脫去卵膜)轉(zhuǎn)入含有不同濃度香加皮溶液的12孔板處理24小時(shí)，通過死亡率來評價(jià)香加皮對不同時(shí)間段斑馬魚心臟毒性的的影響。取不同親本的胚胎及幼魚重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 香加皮水溶液對不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎發(fā)育表型的影響

24 hpf胚胎發(fā)育畸形情況如圖1所示：相比于正常對照組，低濃度給藥組胚胎發(fā)育遲緩，眼點(diǎn)未發(fā)育，頭部偏小或未發(fā)育，見圖B、C。高濃度組發(fā)育畸形，見圖D或停留在體節(jié)期，自主運(yùn)動缺失，見圖E。

48 hpf胚胎發(fā)育畸形情況如圖2所示：卵黃囊畸形，見圖B。黑色素生成抑制，見圖C～E。尾芽未脫落，見圖B～E。高濃度組發(fā)育受到抑制。

72 hpf幼魚發(fā)育畸形情況如圖3所示：卵黃囊畸形，見圖B～D。心包水腫，見圖B、C。黑色素生成抑制，見圖D。

注：A：對照組；B：1.25 mg/mL香加皮水總提取物；C：1.5 mg/mL香加皮水總提取物；D：2 mg/mL香加皮水總提取物；E：3 mg/mL香加皮水總提取物

圖1 香加皮對24 hpf斑馬魚形態(tài)發(fā)育的影響(×10)

注：A：對照組；B：0.15 mg/mL香加皮水總提取物；C：1mg/mL香加皮水總提取物；D：1.5 mg/mL香加皮水總提取物；E：3mg/mL香加皮水總提取物(紅色箭頭標(biāo)注表示尾節(jié)未脫落，黃色箭頭標(biāo)注表示卵黃囊畸形)

圖2 香加皮對48 hpf斑馬魚形態(tài)發(fā)育的影響(×10)

注：A：對照組；B：0.75 mg/mL香加皮水總提取物；C：1.25 mg/mL香加皮水總提取物；D：1.25 mg/mL香加皮水總提取物

(紅色箭頭標(biāo)注表示心包水腫，黃色箭頭標(biāo)注表示卵黃囊畸形)

圖3 香加皮對72 hpf斑馬魚形態(tài)發(fā)育的影響(×10)

2.2 香加皮對斑馬魚24 hpf自主抽動的影響

倒置顯微鏡下觀察并記錄24 hpf斑馬魚1分鐘內(nèi)的自主抽動次數(shù)。方差分析結(jié)果表明各給藥組與正常對照組之間具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表1。

表1 香加皮對24 hpf胚胎自主抽動的影響

注： 與對照組相比，aP<0.01。

2.3 香加皮對48 hpf斑馬魚心率的影響

倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)斑馬魚10秒內(nèi)心臟跳動次數(shù)。方差分析結(jié)果顯示各給藥組與正常對照組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見表2。

表2 香加皮對48 hpf心率的影響

注： 與對照組相比，aP<0.01。

2.4 香加皮對斑馬魚孵化率的影響

48 hpf胚胎進(jìn)入孵化期，但48 hpf時(shí)所有給藥組的胚胎均無孵化，故48 hpf未做統(tǒng)計(jì)。72 hpf大部分胚胎孵化完全，方差分析結(jié)果顯示0.9 mg/mL及其以上濃度組與正常對照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，見表3。

2.5 香加皮對各個(gè)發(fā)育階段斑馬魚心臟毒性

48、72、96 hpf的斑馬魚暴露24小時(shí)后，心臟毒性明顯，通過死亡率-濃度曲線計(jì)算的半數(shù)致死濃度(LC50)分別為：0.866、0.693、0.843 mg/mL，見圖4。

結(jié)果顯示，72 hpf斑馬魚對香加皮較為敏感，48 hpf斑馬魚的LC50與96 hpf相似，表明48 hpf斑馬魚適合進(jìn)行藥物心臟毒性研究。

表3 香加皮水總提取物對72 hpf胚胎孵化率的影響

注： 與對照組相比，aP<0.01。

3 討論

香加皮中含有十幾種杠柳苷及苷元，該化學(xué)成分能夠?qū)C(jī)體產(chǎn)生明顯的強(qiáng)心作用，同時(shí)也可能會抑制心肌細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶而產(chǎn)生心臟毒性[8-9]。

傳統(tǒng)的發(fā)育毒性評價(jià)一般以嚙齒類動物鼠及非嚙齒類動物兔為模型進(jìn)行研究[10]，成本較高且相關(guān)測試不能覆蓋胚胎發(fā)育的全過程[11]。斑馬魚作為一種新的動物模型，繁殖能力強(qiáng)，生命周期短，成本低，早期胚胎透明，在顯微鏡下可直接觀察到體內(nèi)各器官的發(fā)育過程及藥物對器官發(fā)育的致畸效應(yīng)[12]，而且它的毒性特征與哺乳動物非常類似[13]。

此外，斑馬魚可以不依賴于完整的心血管系統(tǒng)，甚至在整個(gè)心血管循環(huán)缺失的情況下仍然能生存一段時(shí)間，逐步成為了研究心臟毒性藥物篩選的可替代動物模型[14-16]。總之，斑馬魚模型將體外動物模型和體內(nèi)細(xì)胞模型的優(yōu)勢進(jìn)行有效結(jié)合，越來越多的應(yīng)用于臨床候選藥物的安全性及有效性評估。

注： A：48 hpf；B：72 hpf；C：96 hpf

圖4 不同發(fā)育階段斑馬魚毒效曲線

本實(shí)驗(yàn)以斑馬魚為模型，通過對胚胎自主抽動、心率、孵化率、死亡率的研究來評估香加皮對斑馬魚發(fā)育的影響。斑馬魚自主抽動是運(yùn)動神經(jīng)系統(tǒng)功能發(fā)育的一種表現(xiàn)[17]。本實(shí)驗(yàn)中，正常對照組斑馬魚在24 hpf自主抽動數(shù)為5.5次/分鐘，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[18]。與對照組相比，低濃度處理組即出現(xiàn)差別，且隨濃度增加抽動次數(shù)增加。此外，高濃度處理組(3 mg/mL)中胚胎發(fā)育停留在體節(jié)期。綜上表明香加皮可抑制早期胚胎發(fā)育，有一定的神經(jīng)毒性。

胚胎發(fā)育過程中心臟是最早發(fā)生并發(fā)揮功能的器官，完整的心臟功能對于胚胎的正常發(fā)育起著關(guān)鍵作用，斑馬魚胚胎發(fā)育至48 hpf心率基本趨于穩(wěn)定[19-20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明香加皮會導(dǎo)致48 hpf斑馬魚胚胎的心臟出現(xiàn)表型和功能異常，如心包水腫，心率降低等并呈現(xiàn)劑量相關(guān)性，這與文獻(xiàn)報(bào)道香加皮臨床中毒癥狀相符合[2]。此外，香加皮能夠抑制斑馬魚的孵化過程，處理組與對照組之間具有顯著性差異。結(jié)果表明，香加皮對斑馬魚具有明顯的發(fā)育毒性。

24 hpf斑馬魚心臟開始出現(xiàn)心率，48 hpf斑馬魚心臟發(fā)育完全[6]并發(fā)揮完全功能。因此，針對香加皮的心臟毒性，筆者選定不同發(fā)育階段(48、72、96 hpf)的斑馬魚染毒24小時(shí)后統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，計(jì)算LC50值，進(jìn)而評價(jià)香加皮對不同發(fā)育階段斑馬魚心臟毒性的影響。急性毒性試驗(yàn)表明，香加皮對48 hpf、96 hpf斑馬魚的毒性大小相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了48 hpf斑馬魚適合作為心臟毒性研究的開始階段，但是72 hpf斑馬魚對香加皮較為敏感，這可能是由于香加皮影響了斑馬魚的某一臟器發(fā)育，例如肝臟或者腸道發(fā)育，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

香加皮雖為《中國人民共和國藥典》2015版明確規(guī)定的有毒藥，但并非孕婦禁忌藥。而本次實(shí)驗(yàn)表明香加皮具有明顯的發(fā)育毒性及心臟毒性，以期能為臨床安全、合理用藥提供依據(jù)，為今后有關(guān)香加皮毒性機(jī)制的研究做參考。

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(本文編輯： 禹佳)

Effects of Cortex Periplocae on zebrafish developmental toxicity and cardiac toxicity

FENGYaru,ZHAOChongjun，NIYuanyuan,etal.

SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102，China

LINRuichao，E-mail:linrch307@sina.com.cn

Objective To study the toxic effects of Cortex Periplocae on zebrafish embryo development, and the effects of different exposure duration on the heart toxicity. Methods The methods recommended by Organization for Economic Co-operation and Development was refered, zebrafish embryos of 6 hour-post-fertilization were exposed to 24-well plates with aqueous extraction of Cortex Periplocae of various concentrations. Spontaneous movements, heart rate, hatching rate, mortality rate in 24 hpf and 48 hpf were used to assess the effects of Cortex Periplocae on the zebrafish development under the microscope. Zebrafish at 48 hpf, 72 hpf, 96 hpf were treated with aqueous extraction of cortex periplocae with various concentrations for 24h to determine the effects of different exposure duration on the heart toxicity. Results Compared with the normal control group, the number of spontaneous movements of 24 hpf, heart rate of 48 hpf and the hatching rate of 72 hpf were significantly lower in the exposed group,the results had significant difference (P<0.05). Embryos of 24 hpf exposed to low concentration showed immature development of head and eyes spot, and embryos in high concentration group were malformed or stayed in the segmentation period. Embryos of 48 hpf showed malformation of visceral yolk sac, inhibition of melanin and tail bud was not fallen off. After 72 hpf, the abnormality of zebrafish was observed for curved body, pericardial edema, yolk sac edema. Experimental result of acute toxicity exposure at different developmental stages of zebrafish showed that the median lethal concentration(LC50) were 0.866 mg/mL, 0.693 mg/mL, 0.843 mg/mL respectively. Conclusion Cortex Periplocae had significant toxic effect on the development of zebrafish embryos and heart. Moreover, 48hpf zebrafish is well suited for drug screening of cardiac toxicity.

Zebrafish; Cortex Periplocae; Developmental toxicity; Cardiac toxicity

北京市科學(xué)研究與研究生培養(yǎng)共建項(xiàng)目(2050205)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 中藥品質(zhì)評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室[馮婭茹(碩士研究生)、趙崇軍、倪媛媛、田敬歡、夏青、樊嬌嬌、張文婷、馬志強(qiáng)、林瑞超]

馮婭茹(1993- )，女，2015級在讀碩士研究生。研究方向：中藥毒性成分研究。E-mail:1043742239@qq.com

林瑞超(1954- )，博士，教授，研究員，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥質(zhì)量控制與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail:linrch307@sina.com.cn

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.006

2016-04-22)