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    一測多評法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用及關(guān)鍵問題

    2017-05-09 15:53:58陳楊徐光臨徐德生劉力
    環(huán)球中醫(yī)藥 2017年5期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)標波長組分

    陳楊 徐光臨 徐德生 劉力

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    一測多評法在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用及關(guān)鍵問題

    陳楊 徐光臨 徐德生 劉力

    中藥多成分、多靶點的特性決定了中藥質(zhì)量控制模式必須是多成分定量和多指標監(jiān)控,但中藥對照品難以獲得阻礙了該模式的應(yīng)用,限制了中藥現(xiàn)代化的發(fā)展。一測多評法是運用一種中藥對照品來實現(xiàn)對多個待測組分進行分析的方法。本文就一測多評法的原理以及研究進展進行概述,并就其在研究過程中存在的關(guān)鍵問題進行討論。

    一測多評法; 中藥; 質(zhì)量控制

    中藥成分的復(fù)雜多樣性決定了單一成分無法準確實現(xiàn)對中藥的質(zhì)量控制[1],將化學(xué)藥物單一活性成分的研究方式直接應(yīng)用于中藥,不僅完全背離了中醫(yī)“方—證—效”的治療理念,也忽視了中藥多靶點、多途徑的整體調(diào)節(jié)作用[2],由此提出了中藥多成分的質(zhì)量控制模式。傳統(tǒng)多指標同步質(zhì)量控制需要多種中藥對照品。中藥對照品分離難度大、貨源緊缺及價格高昂[3],王智民等[4]提出了一種新的多成分定量方法,即“一測多評”法(quantitative analysis of multi-components by single-marker, QAMS),該方法基于中藥各成分間存在對應(yīng)的函數(shù)關(guān)系,運用一種價廉易得的對照品,實現(xiàn)對其他多個難以獲得對照品的成分的定量分析。

    一測多評法相較于傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法,具有經(jīng)濟、高效、簡單的優(yōu)勢。從2006年對單味藥中同一類化學(xué)成分的研究開始,到2016年出現(xiàn)對單味藥、中藥復(fù)方、中藥保健品中同一類或不同類化學(xué)成分的研究論文近1000篇。早在2010年版中國藥典一部[5]中,已經(jīng)收錄運用QAMS法測定黃連中小檗堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀、藥根堿等成分的含量。在2015年版中國藥典一部[6]中,新增了運用QAMS法測定丹參中丹參酮Ⅱ A、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量以及生姜中6-姜辣素、8-姜酚、10-姜酚的含量。

    本文在查閱總結(jié)文獻的基礎(chǔ)上,就一測多評法在單味中藥及中藥復(fù)方研究過程中的進展、疑難點進行概述,并展望了其應(yīng)用前景。

    1 “一測多評”法基本原理

    “一測多評”法借鑒內(nèi)標法、校正因子法、主成分自身對照法等研究方法,依據(jù)在一定范圍內(nèi)檢測成分的量與檢測器響應(yīng)成正比的原理,引入相對校正因子(relative correction factor,RCF)的概念[4]。在多指標質(zhì)量評價時,以藥材中相對易得的公認的有效成分為內(nèi)標物,建立內(nèi)標物與其他待測成分的RCF,通過RCF計算其他成分的含量。按下式計算[7]。

    假設(shè)某樣品中含有i個組分:

    式中Ai為組分峰面積;Wi為組分濃度;fi為組分i(i=1,2,...,k,...,m)的相對校正因子。

    選取其中一組分k為內(nèi)標, 建立組分k與其他組分m之間的相對校正因子fkm。轉(zhuǎn)換得到定量計算公式:

    式中Ak為內(nèi)標物峰面積,Wk為內(nèi)標物濃度。Am為其他組分m峰面積,Wm為其他組分m濃度。然后進行方法學(xué)驗證、方法耐用性、系統(tǒng)適用性研究,并且運用合理的方法評價實測值與計算值之間有沒有統(tǒng)計學(xué)差異。

    2 “一測多評”法的研究進展

    自王智民等[4]提出一測多評法的概念以來,一測多評法在單味中藥及中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制研究工作中得到越來越多的應(yīng)用[8]。

    2.1 一測多評法在單味中藥中的應(yīng)用

    目前運用QAMS進行研究的單味藥或其炮制品已經(jīng)達到六十多種,涉及的化合物類型包括:木脂素類[9]、皂苷類[10-11]、生物堿類[12-13]、多酚類[14]、香豆素類[15-16]、單萜類[17-18]、黃銅醇類[19]、萘醌類[20]、蒽醌類[21-22]。由于同一類化合物的結(jié)構(gòu)相似,紫外吸收接近,因此目前大部分研究都是針對有相似母核的化合物,例如大黃蒽醌[21]、人參皂苷[11]等。也有一部分是針對母核不同的化合物,例如魚腥草中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸屬于苯丙素類化合物,蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷等屬于黃酮類化合物[23]。

    在進行成分分析時,高效液相色譜法以其靈敏度高、分離選擇性高、效率高的特點被廣泛使用。張文生等[18]采用內(nèi)標法和外標法同時測定白芍中5種成分的含量,實驗結(jié)果表明:以芍藥苷為內(nèi)標物的一測多評法測得的5種成分的含量與外標法實測值相對偏差在5%以內(nèi),一測多評法可作為白芍藥材的質(zhì)量評價方法。王曉燕等[24]采用高效液相色譜法,以馬錢苷為內(nèi)標,建立酒山萸肉中5個環(huán)烯醚萜苷成分的含量測定方法,并以外標法確定了在缺乏對照品的條件下該一測多評法的可行性。

    基于有效成分的不同理化性質(zhì),新技術(shù)如高效液相色譜—質(zhì)譜—電霧式檢測法也已被引入使用。趙鑫等[9]采用高效液相色譜—質(zhì)譜—電霧式檢測法測定辛夷提取物中4種木脂素成分的含量,此聯(lián)用技術(shù)相較于一般單純使用高效液相色譜儀的方法,在針對紫外吸收中吸光度較小的成分,準確度更高。其原因可能在于該法的檢測信號不依賴于化學(xué)結(jié)構(gòu),具有通用性。鑒于各研究的研究方法與思路基本相同或相似,故將所涉及的研究品種、化學(xué)成分類別、內(nèi)標物和待測成分歸納總結(jié)于表1。

    目前發(fā)表的文獻中,運用QAMS法進行不同類別化學(xué)成分的研究仍然只占中藥品種的極少部分,大部分結(jié)構(gòu)差異懸殊、色譜保留性質(zhì)相差巨大的成分以及在單味藥中含量太少的有效成分,都達不到QAMS法的應(yīng)用條件。除了應(yīng)用條件的限定外,待測組分色譜峰的定位、對照品純度、檢測波長的選擇、色譜系統(tǒng)不同帶來的誤差都是目前QAMS法研究過程中的難點,需要進一步思考。

    2.2 一測多評法在中藥復(fù)方制劑中的應(yīng)用

    目前,QAMS法在中藥制劑的質(zhì)量控制研究中已經(jīng)涉及到多種劑型,包括片劑、顆粒劑、丸劑、膠囊、滴丸、注射液等,其中片劑、顆粒劑較多,例如紫龍金片[28]、清清顆粒[29]、參芎養(yǎng)心顆粒[30]等。藥物組成從一味(例如銀杏葉膠囊)到十七味(例如大敗毒膠囊)不等。

    QAMS法在中藥復(fù)方制劑中的應(yīng)用與在單味藥中的應(yīng)用相似,選擇復(fù)方中具有代表性的容易獲得的有效成分作為內(nèi)標物,例如銀翹解毒系列制劑中選擇綠原酸作為內(nèi)標物[31],香連制劑中選擇小檗堿作為內(nèi)標物[32],建立起內(nèi)標物與待測組分之間的RCF,將此RCF作為常數(shù)來計算待測組分的含量。任德飛等[33]采用高效液相色譜法測定苦碟子注射液中4種有機酸類成分的含量,選擇菊苣酸為內(nèi)標物,測定菊苣酸與咖啡酸、綠原酸、單咖啡酰基酒石酸的相對較正因子,進而計算注射液中有機酸的含量。并將測得的數(shù)值與外標法測得的實測值進行評價,驗證了一測多評法的準確性。

    為了更加完善地反應(yīng)中藥復(fù)方的內(nèi)在質(zhì)量,新技術(shù)如超高效液相色譜也已被引入。崔璐等[34]采用高效液相色法和超高效液相色譜法兩種色譜系統(tǒng),以新橙皮苷為內(nèi)標物,分別測定朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、虎杖苷、淫羊藿苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的含量。針對QAMS法研究中檢測波長的選擇難點,應(yīng)用了全時段多波長融合技術(shù),以更全面的對前列癃閉通片進行質(zhì)量評價。結(jié)果表明:相較于高效液相色法和超高效液相色譜法具有分離效果好、靈敏度高、流動相用量少等優(yōu)勢,選擇超高效液相色譜法可以更方便、快速地完成前列癃閉通片的含量測定?;谘芯克悸返南嗨菩?,故將已開展QAMS研究的中藥復(fù)方的研究情況歸納總結(jié)于表2。

    表1 已開展QAMS研究的單味中藥

    表2 已開展QAMS研究的中藥復(fù)方

    中藥復(fù)方制劑具有多成分、多靶點的特性,采用一測多評法可以更全面、科學(xué)地控制中藥質(zhì)量標準,建立適合的定量分析方法。然而該方法同樣有局限性,目前尚未有中藥制劑中多味藥材不同組分能夠同時進行定量分析的研究報道,這也是目前QAMS研究中急需突破的瓶頸。

    3 “一測多評”法研究過程中存在的關(guān)鍵問題

    一測多評法是中藥多組分同步監(jiān)測的發(fā)展方向,也是2015年版中國藥典[6]修訂中重點推廣的技術(shù)。目前其研究范圍涉及了多種中藥材及飲片、中藥復(fù)方制劑、中藥提取物等,但是收錄于藥典得到認同的仍局限于幾個品種,其研究過程中存在一些疑難點及關(guān)鍵問題需要引起關(guān)注。

    3.1 待測組分色譜峰定位方式的選擇

    目前對于待測組分色譜峰的定位方式大致分為兩類。第一類是比較普遍的相對保留時間差值定位和相對保留值定位。相對保留時間差值定位,即在參考紫外圖譜的同時,運用待測組分與內(nèi)標物保留時間之差進行定位,此方法是王智民等[4]第一次提出QAMS方法時運用的定位方式,后來的學(xué)者在此基礎(chǔ)上提出了相對保留值定位方法,即在參考紫外圖譜的同時,運用待測組分與內(nèi)標物的保留時間的比值進行定位。在目前發(fā)表的文獻中,運用相對保留值進行定位的比重較大。

    第二類是在不同色譜柱帶來的誤差較大的情況下,基于在相同的分析條件下,采用不同的色譜柱,組分的保留時間存在簡單的線性關(guān)系的理論,運用不同色譜柱下組分對應(yīng)的不同的保留時間推導(dǎo)出校正方程,從而得出理論出峰時間進行定位。例如在魚腥草的質(zhì)量控制研究中[23],采用綠原酸(內(nèi)標物)和最后一個容易辨認的色譜峰(槲皮苷)兩點校正,分別以不同色譜柱分離的綠原酸和槲皮素的保留時間為X、Y,推導(dǎo)出校正方程,將待測各組分的保留時間帶入,即可得到理論出峰時間,從而完成快速定位[19]。目前此方法的應(yīng)用較少,需要進一步完善。

    待測組分色譜峰定位方式的選擇直接影響檢測器響應(yīng)值的準確性,也是一測多評法研究過程中一直存在的爭論點,研究者可以根據(jù)自身不同的實驗條件,選擇一種或兩種定位方法進行考察,選擇相對偏差較小的方法進行實驗,以保證實驗的嚴密性。3.2 對照品純度的標定問題

    目前筆者未見國內(nèi)文獻報道關(guān)于自制對照品純度的嚴格的標定方法,需要引起重視。QAMS法的應(yīng)用中,待測組分的對照品大部分為缺乏供應(yīng)或者價格昂貴的產(chǎn)品。此類對照品大部分需要實驗室自制,再經(jīng)過基于光譜數(shù)據(jù)的結(jié)構(gòu)鑒定和高效液相面積歸一化法的純度檢查,然而由于檢測器適用范圍的限制,很有可能導(dǎo)致純度低于98%從而影響實驗結(jié)果。Wang CQ等[10]運用三七藥材中六種成分(人參皂苷R1、Rg1、Rg2、Rb1、Rd、三七皂苷R4)作為內(nèi)標來研究化合物的結(jié)構(gòu)、待測組分的濃度、對照品的純度對QAMS法準確性的影響,結(jié)果顯示,待測組分的濃度是主要影響QAMS法準確性的因素,其他因素對準確性的影響很小。

    針對此疑難點,筆者考慮可以采用兩種以上不同分離機理或者不同色譜條件進行驗證比較,同時盡量減少外界因素(實驗室、操作人員、儀器等)的干擾,去除離群值后進行可信限的計算。

    3.3 檢測波長的選擇方式

    目前QAMS法最常用的檢測器是紫外檢測器,大部分常見的有機物和部分無機物都具有紫外吸收,然而單一波長不能全面、客觀地反映藥材或制劑的內(nèi)在質(zhì)量,針對不同結(jié)構(gòu)的化合物,檢測波長的選擇方式也是不同的。

    針對具有相同母核的化合物,為了得到高靈敏度,一般選擇待測物具有最大吸收峰處作為檢測波長,例如玳玳果黃酮滴丸中四種黃酮類成分柚皮苷、 新橙皮苷、 橙皮內(nèi)酯水合物、枳屬苷,選取最大吸收處284 nm[41]。

    針對具有不同母核的化合物,有兩種檢測波長的選擇方式是目前常用的。第一種是分段變波長測定,例如清清顆粒中同時測定多種指標成分時,在0分鐘~18分鐘時,選擇沒食子酸、白芍苷和芍藥苷的最大吸收237 nm;在18分鐘~ 24分鐘,選擇甘草苷的最大吸收237 nm;24分鐘~ 32分鐘,選擇黃芩苷的最大吸收280 nm;32分鐘~ 34分鐘,選擇小檗堿的最大吸收345 nm;34分鐘~ 40.4分鐘,選擇漢黃芩苷、黃芩素的最大吸收280 nm[29]。第二種是選擇待測物之間共有的吸收波長區(qū)。例如玄參飲片中肉桂酸是有機酸類化合物,最大吸收波長為268 nm;哈巴俄苷、哈巴苷屬于環(huán)烯醚萜類化合物,前者最大吸收波長為278 nm,后者最大吸收波長為202 nm,綜合三者共有的平坦吸收區(qū),最終選擇290 nm作為檢測波長[39]。

    這些常用的檢測波長選擇方式各有利弊,目前有研究者采用新技術(shù),如全時段多波長融合技術(shù)運用于檢測波長的選擇[34],通過DAD全波長掃描,確定采樣波長,并利用Matlab編程軟件對各波長進行融合,以全面反應(yīng)該藥中各類成分的信息。該方法較傳統(tǒng)方法更加全面、完善地反映所有化學(xué)成分的信息,但是對研究者的編程能力和實驗條件提出了更高的要求。

    3.4 色譜系統(tǒng)不同產(chǎn)生的誤差

    在QAMS中,所有引起檢測器響應(yīng)值變化的因素都可能引發(fā)誤差,從而導(dǎo)致試驗數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏移。因此在運用QAMS法時,必須對該方法的耐用性和系統(tǒng)適應(yīng)性進行評價。Qiao Fx等[42]在用QAMS法對川芎進行質(zhì)量控制的研究過程中,考察了不同儀器、不同色譜柱、不同流速和柱溫對RCF的影響,結(jié)果顯示,測定條件的微小改變對RCF影響不大,RCF重現(xiàn)性良好。目前已經(jīng)發(fā)表的文獻中,待測成分RCF的耐用性考察普遍采用此類方法,如果不同條件下的RCF偏移較大,則應(yīng)增加限定,從而減少誤差。

    4 結(jié)語

    QAMS法實現(xiàn)了中藥多成分的定量,符合傳統(tǒng)中醫(yī)理論的整體觀,同時解決了中藥對照品缺乏所引起的質(zhì)量控制難題,彌補了中藥指紋圖譜技術(shù)模糊性的缺點,大幅降低了中藥質(zhì)量檢測的時間和成本。目前的中藥質(zhì)量控制方法主要有化學(xué)模式識別法、中藥指紋圖譜技術(shù)、有效成分與藥效相結(jié)合、QAMS法及其類似等方法,可以考慮將這些方法結(jié)合起來,綜合運用,建立更加完善的中藥質(zhì)量控制模式。

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    (本文編輯: 韓虹娟)

    Application and key problems of QAMS for quality control of traditional Chinese medicine

    CHENYang,XUGuanglin,XUDesheng,etal.

    DepartmentofPharmacy,AffiliatedShuguangHospital,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai200021,China

    LIULi,E-mail:liuli2750@163.com

    The characters of traditional Chinese medicine(TCM) are multicomponent and multitargeted, which decide the mode of quality control of TCM must be multi component and multi index. However, it is difficult to obtain the reference substance of traditional Chinese medicine, which hinders the development of the mode, and also restricts the development of the modernization of TCM. QAMS is an analytical method to use one reference substance of TCM to calculate multi-components. In this article, the principle and the research progress of QAMS are summarized, and the key problems in the process of the research are also discussed.

    Quantitative analysis of multi-components by single-marker; Traditional Chinese medicine; Quality control

    2013年國家臨床重點專科(中醫(yī)專業(yè))臨床藥學(xué)建設(shè)項目(財社[2013]239號);上海市科技專項計劃項目(12401901401)

    200021 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥劑科[陳楊(碩士研究生)、徐光臨(博士研究生)、徐德生、劉力]

    陳楊(1992- ),女,2014級在讀碩士研究生。研究方向:藥劑學(xué)。E-mail:chenyang4231@163.com

    劉力(1961- ),女,碩士,教授。研究方向:新藥制劑研究。E-mail:liuli2750@163.com

    R284.1

    A

    10.3969/j.issn.1674-1749.2017.05.037

    2016-08-21)

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