卒中后抑郁大鼠血清同型半胱氨酸與葉酸水平的表達(dá)變

黃小睿 趙曉月 李雪斌 王潔

【摘要】目的觀察卒中后抑郁（PSD）大鼠血清中同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）與葉酸（Folic acid，F(xiàn)A）水平的表達(dá)變化。

方法將48只雄性SpragueDawley（SD）大鼠隨機(jī)分成正常組、抑郁組、卒中組、PSD組，每組12只。卒中組應(yīng)用線栓法制成局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞模型；抑郁組應(yīng)用慢性不可測(cè)的溫和刺激結(jié)合孤養(yǎng)法制成抑郁模型；PSD組先應(yīng)用線栓法制備局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞模型，后結(jié)合慢性不可測(cè)的溫和刺激及孤養(yǎng)法制成PSD模型。ELISA 法檢測(cè)血清中Hcy與FA水平。

結(jié)果PSD組與其他各組相比較，血清中Hcy水平明顯升高，而血清中FA水平則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；抑郁組及卒中組分別與正常組相比較，血清中Hcy水平均明顯升高，而FA水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；卒中組血清中FA水平明顯低于抑郁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而抑郁組與卒中組血清中Hcy水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論卒中后抑郁大鼠模型的血清Hcy水平升高以及FA水平降低，有可能與卒中后抑郁的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】卒中后抑郁；大鼠；同型半胱氨酸；葉酸

中圖分類號(hào)：R749.4+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.01.003

Expression changes of Hcy and FA levels in rats models with poststroke depression

[HJ1*2][HJ]

HUANG Xiaorui1，ZHAO Xiaoyue2，LI Xuebin3▲，WANG Jie4

（1.Graduate School，2.Nephrology Department of Affiliated Southwest Hospital，3.Neurology Department of Affiliated Hospital，4.Nephrology Department of Affiliated Hospital，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

[HJ2][HJ]

【Abstract】ObjectiveTo explore expression changes of Homocysteine（Hcy） and Folic acid（FA） levels in rats with poststroke depression（PSD）.

Methods48 adult male SpragueDawley（SD） rats were randomly divided into normal group， depression group， stroke group and PSD group， with 12 cases in each group. Focal cerebral ischemia models established by intraluminal suture method were used in the stroke group. In the depression group， depression models were made by chronic unpredictable mild stimulation combined with separate breeding. In the PSD group， focal cerebral ischemia models established by intraluminal suture method were used at first， and then PSD rat models established by chronic unpredictable mild stimulation combined with separate breeding were applied. ELISA was used to detect the levels of Hcy and FA in serum.

ResultsCompared with the other 3 groups， serum Hcy levels in the PSD group were significantly higher， but FA levels were significantly lower， difference was statistically significant（P<0.01）. Compared with the normal group， serum Hcy levels in the depression group and the stroke group were significantly higher， but FA levels of both groups were significantly lower， difference was statistically significant（P<0.01）. The serum FA levels of the depression group was significantly higher than that of the stroke group， difference was statistically significant（P<0.05）， whereas there was no statistically significant difference between serum Hcy levels of the depression group and the stroke group（P>0.05）.

ConclusionIncrease of serum Hcy levels and decrease of serum FA levels of PSD rats models may be related with the pathogenesis of PSD.

【Key words】PSD； rats； Hcy； FA

腦卒中作為威脅我國(guó)中老年人群生命健康的常見疾病之一，目前其已成為我國(guó)排名前兩位的致死病因，也是單病種致殘率最高的疾病[1]。卒中后抑郁（poststroke depression，PSD）是腦卒中后的常見神經(jīng)精神并發(fā)癥，不僅是導(dǎo)致腦卒中患者生活質(zhì)量降低的重要因素，同時(shí)還嚴(yán)重影響了患者神經(jīng)功能的恢復(fù)，增加了致殘率、發(fā)病率和病死率[2～3]。近年來，有研究表明高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）不僅是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，并且與腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切關(guān)聯(lián)[4～5]。同樣，Zappacosta等[6]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性能通過影響血漿同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）水平并參與PSD的發(fā)病，提示Hcy與PSD的發(fā)生關(guān)系密切。Hcy是蛋氨酸在脫甲基后產(chǎn)生的一類含硫氨基酸，其代謝過程需蛋氨酸合成酶（Methionine synthase，Ms）、維生素B12（Vitamin B12，VB12）與葉酸（Folic acid，F(xiàn)A）等作為輔助因子。在正常生物體內(nèi)Hcy的產(chǎn)生與代謝維持著動(dòng)態(tài)平衡，在各種因素共同作用下引起的酶代謝障礙或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏，導(dǎo)致Hcy在體內(nèi)積聚并最終發(fā)生HHcy。由于目前PSD的生物學(xué)發(fā)病機(jī)制尚未明確，且有關(guān)PSD大鼠模型與Hcy及FA水平間是否存在關(guān)聯(lián)性的文獻(xiàn)報(bào)道較少，因此本研究旨在探討PSD模型大鼠血清中Hcy與FA水平的表達(dá)變化在PSD發(fā)病機(jī)制中的作用，對(duì)進(jìn)一步了解PSD的發(fā)病機(jī)理及相關(guān)危險(xiǎn)因素具有重要的意義，并期望能為PSD的預(yù)防、診斷及治療提供新的思路和方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SpragueDawley（SD）大鼠48只，體重250～300 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心（許可證號(hào)： SCXK 桂2012-0003）提供；Hcy與FA的ELISA試劑盒購(gòu)自云克隆科技股份有限公司（美國(guó)進(jìn)口），操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合右江民族醫(yī)學(xué)院關(guān)于使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組

將48只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（Normal group）、抑郁組（Depression group）、卒中組（Stroke group）、PSD組（PSD group），共4組。正常組12只：置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水；抑郁組12只：每籠1只單獨(dú)飼養(yǎng)，采用慢性不可測(cè)的溫和應(yīng)激刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法制備抑郁模型；卒中組12只：采用線栓法制備局灶性大腦中動(dòng)脈閉塞 （middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，制備后置于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，正常飲食、飲水；PSD組12只：采用MCAO術(shù)后1周結(jié)合CUMS及孤養(yǎng)方法制備PSD模型。

1.2.2動(dòng)物模型建立

（1）MCAO模型建立：參考Su等[7]的方法，采用插線法局灶性腦缺血/再灌注模型。（2）CUMS模型建立：參考Willner等[8]的改良方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行21天的CUMS處理，刺激因素包括24 h禁食禁水、4℃冰水游泳、45℃熱水游泳、夾尾5 min、24 h潮濕墊料、傾斜45°、晝夜顛倒、搖晃飼養(yǎng)籠、24 h擁擠飼養(yǎng)等9種。（3）孤養(yǎng)法：將抑郁組和PSD組大鼠單籠飼養(yǎng)。各組均在相互隔離的環(huán)境下飼養(yǎng)。（4）模型評(píng)價(jià)：MCAO術(shù)后采用Longa[9]5分法和水平木棒實(shí)驗(yàn)測(cè)試腦卒中模型大鼠神經(jīng)功能缺損程度；在首次CUMS后行蔗糖水消耗（Sucrose preference test）試驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)（Openfield test）等行為學(xué)試驗(yàn)，結(jié)合利用體重、快感、自發(fā)活動(dòng)和究性活動(dòng)減少程度檢測(cè)大鼠抑郁癥狀的程度，從而證實(shí)造模是否成功。

1.2.3Hcy及FA水平檢測(cè)

各組大鼠斷頭處死后取血，將血樣品置于0℃冰上2 h，得到上層血清；血清中的Hcy及FA水平檢測(cè)嚴(yán)格按照試劑盒所配說明書進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差（OneWay ANOVA）分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2結(jié)果

各組Hcy、FA水平比較，與正常組、抑郁組和卒中組相比較，PSD組大鼠血清中Hcy水平明顯升高，而FA水平則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與正常組相比較，抑郁組與卒中組大鼠血清中Hcy水平均明顯升高，而FA水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；卒中組大鼠血清中FA水平明顯低于抑郁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而卒中組與抑郁組大鼠血清中Hcy水平相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表1。

表1各組大鼠血清中Hcy及FA水平比較（n=12，ng/ml，±s）

組別HcyFA

正常組83.95±23.171065.20±95.85

抑郁組279.67±50.47a315.58±14.43a

卒中組252.80±50.06a217.48±9.52ab

PSD組423.22±21.27abd169.17±9.09abc

F153.76884.88

P<0.001<0.001

注：與正常組比較，aP<0.01；與抑郁組比較，bP<0.01；與卒中組比較，cP<0.05，dP<0.01。

3討論

近年的研究報(bào)道顯示，約1/3的卒中患者遭受著不同程度的卒中后抑郁及其相關(guān)癥狀的影響[10]。有關(guān)PSD的發(fā)生率，國(guó)外有文獻(xiàn)[11]報(bào)道了腦卒中患者中至少有30%～60%出現(xiàn)過抑郁癥狀。而國(guó)內(nèi)則有相關(guān)研究表明急性缺血性卒中患者185例中共75例患有抑郁，總的發(fā)病率為40.54%[12]。由此可見PSD不僅是腦卒中的常見并發(fā)癥之一，而且發(fā)病率較高，更有可能導(dǎo)致卒中患者神經(jīng)功能損害的進(jìn)一步惡化、認(rèn)知障礙的加重和更高病死率[13]。

Hcy是蛋氨酸脫甲基后產(chǎn)生的重要產(chǎn)物，它不僅參與體內(nèi)的多種甲基化反應(yīng)，還參與體內(nèi)的能量代謝。Hcy的代謝通過蛋氨酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)：Hcy由蛋氨酸合成酶（Methionine synthase，Ms）催化，5甲基四氫葉酸（5methyltetrahydrofolicacid，5MTHF）提供甲基，生成蛋氨酸和四氫葉酸（tetrahydrofolate，THF），該過程需要有輔酶FA與VB12的參與；而后蛋氨酸與ATP結(jié)合生成S腺苷蛋氨酸（Sadenosyl methionine，SAM）。SAM作為甲基供體，在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下供出甲基，變?yōu)镾腺苷高半胱氨酸（Sadenosyl homocysteine，SAH），SAH最后水解再生成Hcy和腺苷。而FA既是一種水溶性B族維生素，又是生物體內(nèi)重要的微量營(yíng)養(yǎng)素。進(jìn)入體內(nèi)的FA主要是以5MTHF的活性形式存在，在細(xì)胞一碳單位代謝反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)Hcy蓄積過多導(dǎo)致HHcy時(shí)，其導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)毒性作用機(jī)制可能有：（1）氧化應(yīng)激反應(yīng)，Hcy代謝過程中產(chǎn)生多種自由基，促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)展，并且自由基還能攻擊和破壞腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的氧化還原信號(hào)通路，進(jìn)而使得神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙；（2）谷氨酸受體激動(dòng)反應(yīng)，在HHcy狀態(tài)下，由于Hcy與N甲基D天冬氨酸（NmethylDaspartate，NMDA）受體具有高親和性[14]，故而大量Hcy與NMDA受體結(jié)合并激動(dòng)NMDA產(chǎn)生興奮性毒性，同時(shí)還抑制體內(nèi)的甲基化反應(yīng)過程，最終結(jié)果是誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡；（3）神經(jīng)遞質(zhì)合成減少，Hcy代謝過程中的輔酶，如FA的缺乏或亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR） 等關(guān)鍵酶基因發(fā)生突變所導(dǎo)致的蛋氨酸循環(huán)不能進(jìn)行，Hcy在體內(nèi)濃度升高而HHcy出現(xiàn)。若蛋氨酸循環(huán)途徑發(fā)生障礙，則腦內(nèi)神經(jīng)中樞的甲基供體SAM生成則減少，使得單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如多巴胺（Dopamine，DA）、5羥色胺（5hydroxytryptamine，5HT）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）等的生成和代謝發(fā)生紊亂，而上述這些神經(jīng)遞質(zhì)在PSD的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。因此，研究血清中Hcy與FA水平的表達(dá)變化在PSD發(fā)病中的作用，既有助于改善卒中患者的預(yù)后，更可為研究PSD的發(fā)病機(jī)制及治療途徑提供新思路。

HHcy是目前許多疾病發(fā)生的一個(gè)危險(xiǎn)因素，其中也包括了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病[15]。已有較多的研究報(bào)道了Hcy與帕金森?。≒arkinsons disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease，AD）以及認(rèn)知障礙等多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展存在一定的聯(lián)系。Narayan等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HHcy能促進(jìn)PD患者抑郁的發(fā)生發(fā)展，與抑郁嚴(yán)重程度具有相關(guān)性。Nazef等[17]研究報(bào)道了AD患者的血Hcy水平明顯高于健康人群。亦有研究表明Hcy與PSD的發(fā)生關(guān)系密切，Pascoe 等[18]通過隊(duì)列研究了罹患中風(fēng)后1年半的瑞典老年患者，發(fā)現(xiàn)Hcy與患者的抑郁癥狀顯著相關(guān)。一項(xiàng)來自韓國(guó)的研究則表明[19]，HHcy常見于患者發(fā)生中風(fēng)后，并且與營(yíng)養(yǎng)不良、酗酒、低血清FA水平以及維生素B12水平相關(guān)，這與本研究所得結(jié)果相一致。田丹丹等[20]通過臨床對(duì)照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，具有高血壓病史、冠心病病史及MTHFR rs1801133位點(diǎn)的患者對(duì)葉酸治療HHcy的療效具有交互作用，表明口服葉酸治療HHcy存在一定的依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，PSD組大鼠血清Hcy水平均高于正常組、抑郁組與卒中組，而FA水平均低于正常組、抑郁組及卒中組；同時(shí)，卒中組及抑郁組的血清Hcy水平均高于正常組，而FA水平均低于正常組，提示Hcy與FA在PSD的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮著重要作用。本課題組推測(cè)其機(jī)制可能是卒中病灶與抑郁障礙的共同作用導(dǎo)致了大鼠體內(nèi)Hcy合成的增多而發(fā)生HHcy，同時(shí)輔因子FA消耗過多，加速了神經(jīng)元的變性和凋亡，最終導(dǎo)致了PSD的發(fā)生。

綜上所述，血清Hcy水平升高及血清FA水平降低可能參與了PSD發(fā)病，因此在預(yù)防、診斷及治療PSD的過程中血清Hcy與FA水平值得關(guān)注。

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（收稿日期：2016-12-10修回日期：2017-02-07）