HPLC法測定傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量

劉承清 趙應(yīng)紅 李曉幸

(1.西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，云南 西雙版納 666100; 2.西雙版納職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 西雙版納 666100)

楠果緬(栘木衣樹皮)為薔薇科植物云南栘木衣Docynia delavayi(Franch.)Schneid.的干燥樹皮，于初春剝?nèi)淦ぃ衅?，干燥。傣藥材為塊片或條狀，略彎曲。外表面常呈鱗片狀脫落，外表皮顏色成黃棕色或棕褐色，表面粗糙，有時表皮附有白色地衣斑；切面皮部黃棕色至黃褐色，纖維性，呈層片狀，體重，質(zhì)硬，斷面不整齊。分布于云南省思茅、西雙版納等地區(qū)。生長于海拔400～1800m的山野坡地向陽處。傣藥稱為“楠果緬”，常備當(dāng)?shù)卮鲎迦嗣袷褂谩ｉ?栘木衣樹皮)苦、澀、涼。入水、風(fēng)、土塔。主要功效有清熱解毒，收斂治瘡，除風(fēng)止痛，續(xù)筋接骨，風(fēng)濕骨痛。用于燒、燙傷；疔瘡膿腫；皮癬，麻疹，水痘，風(fēng)疹，濕疹，疥瘡出現(xiàn)的皮膚瘙癢；跌打損傷，骨折；風(fēng)濕病肢體關(guān)節(jié)腫痛。楠果緬(栘木衣樹皮)主要含白楊素、槲皮素、廣寄生苷等主要成分[1-3]。目前關(guān)于楠果緬(栘木衣樹皮)化學(xué)成分研究及含量測定的研究報告很少，只有對楠果緬(栘木衣樹皮)中的白楊素含量測定。筆者通過采用HPLC法測定傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量，為控制此傣藥材的質(zhì)量具有重要意義，對下一步研究楠果緬(栘木衣樹皮)質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(帶自動進(jìn)樣器、 二極管陳列檢測器、 LC solution 色譜工作站、)；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津)；JA2003N電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；LQ-A10002型電子天平(瑞安市樂祺貿(mào)易有限公司)；KDM型調(diào)溫電熱套(山東省鄄城振興儀器廠)；TA-816型光波爐(中山市天倚電器有限公司)；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海試驗(yàn)儀器廠)等。

1.2 試藥：槲皮素對照品(中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，批號：100081-201610)；娃哈哈純凈水；甲醇、磷酸為色譜純，鹽酸為分析純。傣藥材栘木衣樹皮(批號：20161019)由西雙版納州版納藥業(yè)所提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備: 取槲皮素對照品在電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫105℃，恒溫干燥2小時，放冷，精密稱定槲皮素對照品4.4mg，置于100mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻、定容，即為對照品溶液(每1mL含槲皮素對照品0.044mg)即得。

2.2 陰性溶液的制備： 量取適量的甲醇(色譜純)置燒杯中，用0.45μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 供試品溶液的制備： 稱取栘木衣樹皮粉末(過3號篩)約1g,精密稱定，置于150mL圓底燒瓶中，精密量取80%甲醇溶液50mL加入圓底燒瓶中,精密稱定重量。加熱回流1.5h，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液20mL置于100mL三角錐形瓶中，精密加入25%鹽酸溶液7mL，置85℃水浴鍋中水解30min，取出，迅速冷卻，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm微孔濾膜濾過，即得[3]。

2.4 檢測波長的選擇：精密稱取槲皮素對照品一定量，配置成一定濃度的溶液，在200 ～ 700nm處進(jìn)行波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在370nm處吸收峰最大，干擾最少，所以選擇370nm為測量吸收峰。

2.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn): 色譜柱：Kromasil C18柱(4.6×150mm，5μm)；流動相：甲醇-0.5%磷酸(49:51)；柱溫：35℃；流速：0.8mL·min-1；檢測波長：370nm[5-7]。分別精密吸取對照品溶液、陰性溶液、供試品溶液各10μL注入高效液相色譜儀中,理論板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算不應(yīng)低于3500。供試品中槲皮素的色譜峰與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察:分別精密量取“2.1”項(xiàng)下的槲皮素對照品溶液1mL，2mL，4mL，6mL，8mL，10mL，分別置于10mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，將以上6個不同質(zhì)量濃度對照品溶液分別進(jìn)樣10μL，照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定含量。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，槲皮素對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到線性回歸方程：Y=49006X-54.918，r=0.9997(n=6)，結(jié)果顯示，槲皮素對照品溶液進(jìn)樣量在4.4～44μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，見圖2。

2.6.2 精密度試驗(yàn):精密吸取“2.1”項(xiàng)下制備的槲皮素對照品溶液10μL，照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定含量，連續(xù)進(jìn)樣6針。結(jié)果槲皮素的峰面積RSD為0.07%(n=6)。表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗(yàn): 取同一批傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)樣品約1g,按照供試品溶液制備方法,制備6份供試品溶液,照“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行槲皮素含量測定。結(jié)果槲皮素峰面積的RSD為0.59%(n=6),結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn):取重復(fù)性試驗(yàn)中的一份樣品溶液，照“2.5”項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時進(jìn)樣10μL測定其峰面積，按照峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果RSD值為0.92%。顯示供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn): 稱取已知含量的栘木衣樹皮樣品粉末9份,每份約 1g,精密稱定,分別精密加入不同的濃度槲皮素(4.12599mg/mL5.15749mg/mL、6.18899mg/mL)對照品溶液1mL，照“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，用0.45μm微孔濾膜過濾后，在“2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，測定其峰面積，計(jì)算含量和加樣回收率。結(jié)果見表1，楠果緬(栘木衣樹皮)槲皮素的平均加樣回收率為100.19%，RSD為1.31%。

注：與對照組比較，P<0.05

3 樣品含量測定

稱3批傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)粉末樣品(過三號篩)，每批2份，每份約1g，精密稱定，照“2.3”項(xiàng)下制成供試品溶液。精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10μL，照“2.5”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀中，用外標(biāo)法計(jì)算楠果緬(栘木衣樹皮)中的槲皮素含量。結(jié)果3批楠果緬(栘木衣樹皮)樣品(批號： 161104、170101、170306中槲皮素平均含量分別為5.3306mg/g、5.1001mg/g 5.2507mg/g。

4 討論

4.1 此次試驗(yàn)對提取方法時，根據(jù)文獻(xiàn)報道提取方法有超聲提取法[8]、加熱回流提取法進(jìn)行提取[9]，提取時間為1.5h后進(jìn)行比較，結(jié)果表明加熱回流提取法提取出的槲皮素的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于超聲提取法所提取的。

4.2 通過UV-2450紫外可見分光光度計(jì)對槲皮素的波長測定，發(fā)現(xiàn)槲皮素在檢測波長為254nm、370nm處有最大吸收值，同時在254nm處雜質(zhì)吸收值大，干擾性強(qiáng)，不適合檢測。所以選擇在370nm處做為HPLC的檢測波長。

4.3 流動相的考察時，選擇用甲醇：水；乙腈：水；甲醇：(0.3%、0.4%、0.5%、0.6%)磷酸溶液做流動相的考察系統(tǒng)，確定使用甲醇：0.5%磷酸溶液做為流動相，考察流動相比例50：50、49:51、51:49。最終確定流動相為甲醇：0.5%磷酸溶液(49:51)，進(jìn)樣速度為0.8 mL/min，檢測波長為370 nm柱溫為35℃條件下進(jìn)行楠果緬(栘木衣樹皮)含量測定，表明槲皮素可分離，并且分離度高，槲皮素峰形達(dá)到基線分離，峰形對稱。

4.4 槲皮素在傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)中含量普遍較高，在西雙版納州資源豐富，傣族人民使用廣泛，因此槲皮素可適用于傣藥材楠果緬(栘木衣樹皮)的含量測定及質(zhì)量控制，同時可作為西雙版納州傣醫(yī)院處方制劑中質(zhì)量控制成分及其應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

[1]鄭進(jìn),林艷芳.傣藥學(xué)[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2007，94.

[2]林艷芳，依專，趙應(yīng)紅.中國傣醫(yī)藥彩色圖譜[M].昆明:云南民族出版社，2003:545.

[3]云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn).第三冊.傣族藥[S].昆明:云南科技出版社，2005,291-303.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(四部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.127.

[6]謝紫薇，李強(qiáng)，劉珊.高效液相色譜法同時測定芒果葉中蘆丁與槲皮素含量[J].中國藥業(yè)，2016，25(21)：35.

[7]尹玲，馮蕓，吳珊，等.HPLC法測定菝葜提取物中槲皮素的含量[J].中國藥房，2010,21(35)：3313.

[8]宋偉峰，羅淑媛，李瑞明，梁耀榮.HPLC測定柚寄生中槲皮素的含量[J].藥品鑒定，2012,19(28)：65-68.

[9]陳健.高效液相色譜法測定金錢草片中的槲皮素和山奈素含量[J].中國藥業(yè)，2016，25(6)：62-63.