高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損效果觀察

席立成，李宏宇，趙子星，郁少林，劉搏宇(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021)

高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損效果觀察

席立成，李宏宇，趙子星，郁少林，劉搏宇
(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530021)

目的 觀察用高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損的效果。 方法 選用新西蘭大白兔80只制作兔骨缺損模型，隨機(jī)分為A、B、C、D組，A組給予高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療、B組給予高壓氧治療、C組給予仙桃草飼喂治療，D組為正常對照不用藥。分別于治療后第2、4、8、12周分批處死各組兔，在電鏡、光鏡下計(jì)數(shù)新生骨痂成骨細(xì)胞數(shù)及新生骨小梁面積比，電鏡下觀察成骨細(xì)胞和骨股原纖維形態(tài)。 結(jié)果 光鏡下治療后2、4、8、12周A組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比和成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)高于B、C、D組(P均<0.05)，B、C組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比和成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)高于D組(P均<0.05)。電鏡下觀察，與B、C、D組比較，A組成骨細(xì)胞細(xì)胞器最發(fā)達(dá)，骨膠原纖維排列整齊, 分布均勻。 結(jié)論 高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，可明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖分化及成骨能力,加快骨小梁生成，促進(jìn)骨缺損的愈合，效果強(qiáng)于單用高壓氧或者仙桃草者。

高壓氧；仙桃草；骨缺損；成骨細(xì)胞；骨小梁；動物實(shí)驗(yàn)

目前臨床上常用的骨缺損治療方法主要有自體骨移植、同種異體骨移植、人工骨移植等，但均存在不足。尋找一種有效的常規(guī)保守治療骨缺損的方法非常重要。高壓氧能促進(jìn)骨折愈合，縮短骨折愈合時(shí)間。仙桃草又名接骨草，中醫(yī)認(rèn)為仙桃草有“接骨”功效。本研究用高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，觀察模型兔新生骨痂中骨小梁和成骨細(xì)胞生長情況。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)新西蘭大白兔80只，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，兔齡5～6個(gè)月，雌雄不拘。動物高壓氧艙(型號03-Y900-001，中國煙臺)，光學(xué)顯微鏡(型號Olympus BX40，日本)，電子顯微鏡(型號日立H-7650，日本)，電子天平，解剖工具。

1.2 兔骨缺損模型制作、分組及治療方法 采用文獻(xiàn)方法于兔左橈骨中段制作長約1.5 cm骨缺損，切除骨膜，縫合包扎。術(shù)后3 d內(nèi)每日注射硫酸慶大霉素注射液1次，16萬U/次。均造模成功。隨機(jī)分為A、B、C、D組，各20只。A組予高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療；B組予高壓氧治療；C組行仙桃草飼喂治療；D組為對照組。高壓氧治療壓力0.25 MPa (2.5 個(gè)大氣壓)，加壓時(shí)間25～30 min，穩(wěn)壓時(shí)間60～70 min，減壓時(shí)間31～35 min，1次/d，9次為1個(gè)療程。每個(gè)療程后休息2～3 d，然后繼續(xù)治療4個(gè)療程。A、C組兔從造模后第1天起每日每只兔給含仙桃草精飼料65 g，含生藥1.2 g；C、D組給等量精飼料。治療后第2、4、8、12周各組分批處死5只兔。取出骨缺損間隙的骨痂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比測算方法 將骨痂置入10%甲醛中固定24 h，依次行EDTA脫鈣，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，HE染色，4 μm連續(xù)切片，封片后光學(xué)顯微鏡下組織學(xué)觀察。新生骨小梁鏡下面積比檢測采用Lane-Sandhu骨移植物組織學(xué)評分法。選取每個(gè)標(biāo)本中無明顯組織分離、相同深度的 5 張切片進(jìn)行骨形態(tài)計(jì)量分析，在放大100 倍條件下，每張切片上隨機(jī)選取 5 個(gè)視野，測定兩組各時(shí)間點(diǎn)新生骨小梁面積占鏡下修復(fù)區(qū)面積的比值(新生骨小梁鏡下面積比)。

1.4 各組兔骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 將骨痂用多聚甲醛固定，EDTA 脫鈣，常規(guī)脫水，石蠟浸潤包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，采用免疫組化法進(jìn)行堿性磷酸酶(ALP)染色，成骨細(xì)胞胞質(zhì)藍(lán)染，在低倍鏡下找到骨小梁位置，然后換成40倍鏡，依照上下、左右的順序，選取5個(gè)骨小梁區(qū)域進(jìn)行成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.5 各組兔電鏡下成骨細(xì)胞和骨膠原纖維形態(tài)觀察方法 截取1 mm×2 mm大小的骨痂標(biāo)本，投入4 ℃的3%戊二醛、1.5%多聚甲醛液固定后，用5.5%EDTA、1%戊二醛、二甲胂酸鈉液(pH值7.2)4 ℃脫鈣，漂洗后用1%四氧化鋨固定，再漂洗后逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋。經(jīng)半薄切片定位，超薄切片70 nm，染色后電子顯微鏡下觀察成骨細(xì)胞和骨膠原纖維形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比比較 治療后各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比逐漸升高。治療后第2周時(shí)，A組骨小梁排列不規(guī)則，數(shù)量不多，B、C組骨小梁量更少，D組骨小梁少，且密度稀疏、體積細(xì)??；第4周時(shí)，A組骨小梁周圍大量成骨細(xì)胞圍繞，骨小梁體積粗大，部分連接成網(wǎng)絡(luò)，B、C組骨小梁數(shù)量較多，但未見鏈接成網(wǎng)絡(luò)，骨小梁周圍較多成骨細(xì)胞，D組骨小梁增多，排列不規(guī)則；第8及12周時(shí)，A組骨小梁全成網(wǎng)絡(luò)狀，B、C組骨小梁部分成網(wǎng)絡(luò)狀，D組骨小梁排列欠規(guī)則。各時(shí)點(diǎn)各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比見表1。治療后2、4、8、12周A組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比高于B、C、D組(P均<0.05)，B、C組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比高于D組(P均<0.05)。

表1 各時(shí)點(diǎn)各組兔骨痂新生骨小梁鏡下面積比比較±s)

注：與B組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；與D組相比，▲P<0.05。

2.2 各組兔骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較 治療后各組兔骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)逐漸升高，至治療后8周達(dá)到高峰，然后下降。治療后2、4、8、12周各組兔骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)見表2。

表2 各時(shí)點(diǎn)各組兔骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較±s)

注：與B組相比，*P<0.05；與C組相比，#P<0.05；與D組相比，▲P<0.05。

2.3 各組兔骨痂電鏡下成骨細(xì)胞及骨膠原纖維形態(tài) 電鏡下觀察，第2周時(shí)A組成骨細(xì)胞較其他三組明顯多，并可見排列紊亂的骨膠原纖維，B、C組膠原纖維少，成骨細(xì)胞數(shù)量和體積均小，D組骨膠原纖維細(xì)小且連續(xù)性差。第4周時(shí)，A組成骨細(xì)胞體積較大，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體較多，膠原纖維膠致密，分布均勻，B、C組成骨細(xì)胞體積相對小，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體不發(fā)達(dá)，骨膠原纖維排列較亂，D組成骨細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體少見，膠原纖維粗細(xì)不一。第8周及12周時(shí)，A、B、C三組可見膠原纖維與骨小梁并行排列，可見周期性橫紋，且A組成骨細(xì)胞及細(xì)胞核體積大，核膜完整；B、C組細(xì)胞器較A組欠豐富，D組膠原纖維較多，直徑較粗。

3 討論

成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，并參與骨基質(zhì)及骨鈣的代謝，其增殖能產(chǎn)生豐富的膠原，是骨形成過程中的主要功能細(xì)胞[1]。骨小梁的結(jié)構(gòu)和骨強(qiáng)度密切相關(guān)，骨小梁的生成量與排列結(jié)構(gòu)是判斷骨折愈合與否的重要參考指標(biāo)。研究表明[2]，骨小梁的微觀結(jié)構(gòu)決定骨強(qiáng)度。本研究觀察了模型兔骨缺損區(qū)新生骨痂成骨細(xì)胞數(shù)量、微觀結(jié)構(gòu)及骨小梁的體積、排列，上述指標(biāo)可以很好的反映缺損區(qū)骨組織的新生能力以及骨折愈合情況。

高壓氧治療是指在比大氣壓高的氣壓環(huán)境下吸入純氧，增加血液中的溶解氧量，進(jìn)而改善癥狀和治療疾病。高壓氧治療骨缺損的主要機(jī)制有：①高壓氧通過增加血氧含量，改善骨折端組織的缺氧狀態(tài)。②高壓氧治療能促進(jìn)新生毛細(xì)血管的生成，降低全血黏度及血漿黏度，增加缺損區(qū)血液供應(yīng)，從而促進(jìn)骨組織的生長[3]。③高壓氧還可以通過增強(qiáng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分裂，加速骨膜下骨樣組織的生長從而促進(jìn)骨再生[4]。④此外，高壓氧還可以通過誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞分化來治療骨缺損[4]。

仙桃草又名接骨草。是一種廣泛應(yīng)用于骨科領(lǐng)域的中草藥，其主要有效成份包括木犀草素、金圣草素、原兒茶酸、香草酸、甘露醇、綠原酸等[5,6]。木犀草素對抗氧自由基的活性與表達(dá)，能明顯促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)，在骨組織修復(fù)過程中可能起著重要作用[7，8]。香草酸及其受體對骨代謝及成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)蛋白中起著重要的調(diào)控作用[9,10]。原兒茶酸不僅具有較強(qiáng)的抗氧化功能，而且能促進(jìn)人脂肪干細(xì)胞體外增殖分化為成骨細(xì)胞[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，高壓氧聯(lián)合仙桃草飼喂治療兔骨缺損，與單用高壓氧和仙桃草飼喂者相比，新生骨痂成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)高，骨小梁生長快。高壓氧能促進(jìn)新生毛細(xì)血管的生成，但新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育并不成熟，細(xì)胞通透性高，液體滲出較多，可影響和壓迫局部的血運(yùn)和抑制骨細(xì)胞生長，而仙桃草中的主要成分之一木犀草素不僅能緩解高壓引起的血運(yùn)障礙，而且能促進(jìn)血管的成熟。此外，仙桃草中還含有一定含量的甘露醇[5,6]，甘露醇具有明顯的脫水作用，可減輕高壓氧治療所引起新生毛細(xì)血管周圍的高滲高壓狀態(tài)，減輕水腫對血管的壓力，從而改善微循環(huán)血流量。研究[12]發(fā)現(xiàn)，仙桃草中的原兒茶酸分子結(jié)構(gòu)中的鄰二酚羥基為體外清除自由基的活性部位，同時(shí)有羧基時(shí)能明顯增強(qiáng)促血管新生的活性，而高壓氧可通過提高血氧含量，促進(jìn)原兒茶酸分子羥基向羧基的轉(zhuǎn)化。因此，仙桃草飼喂除了本身的藥物治療作用以外，還能彌補(bǔ)高壓氧治療時(shí)所存在的不足。另外高壓氧能提高組織內(nèi)氧含量，增強(qiáng)細(xì)胞活性，因而有利于仙桃草中的有效成分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并在胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)。此外，高壓氧可以降低由激素引起的全血粘度及血漿黏度，使血流通暢，這將有利于仙桃草中的有效成分迅速到達(dá)骨缺損部位，從而使藥物發(fā)揮其最大作用。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

[1] Al-Hadi H, Smerdon GR, Fox SW. Hyperbaric Oxygen therapy accelerates osteoblast differentiation and promotes bone formation[J]. J Dent, 2015,43(3):382-388.

[2] Liu XS, Wang J, Zhou B, et al. Fast trabecular bone strength predictions of HR-pQCT and individual trabeculae segmentation-based plate and rod finite element model discriminate postmenopausal vertebral fractures[J]. J Bone Miner Res, 2013,28(7):1666-1678.

[3] Grassmann JP, Schneppendahl J, Hakimi AR, et al. Hyperbaric Oxygen therapy improves angiogenesis and bone formation in critical sized diaphyseal defects[J]. J Orthop Res, 2015,33(4):513-520.

[4] Lin SS, Ueng SW, Niu CC, et al. Hyperbaric Oxygen promotes osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells by regulating Wnt3a/β-catenin signaling--an in vitro and in vivo study[J]. Stem Cell Res, 2014,12(1):260-274.

[5] 林峰．仙桃草的顯微鑒別[J]．海峽藥學(xué)，2001，13(2)：44-45．

[6] 李勝華，李愛民，伍賢進(jìn)．接骨草化學(xué)成分研究[J]．中草藥，2011，42(8)：1502-1504．

[7] Olsen EK,Hansen E,Isaksson J, et al. Cellular antioxidant effect of four bromophenols from the red algae, Vertebrata lanosa[J]. Mar Drugs, 2013,11(8):2769-2784.

[8] Chen D, Bi A, Dong X, et al. Luteolin exhibits anti-inflammatory effects by blocking the activity of heat shock protein 90 in macrophages[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014,443(1):326-332.

[9] Van Der Eerden BC, Hoenderop JG, De Vries TJ, et al. The epithelial Ca2+channel TRPV5 is essential for proper osteoclastic bone resorption[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(48):17507-17512.

[10] Hoenderop JG, Van Leeuwen JP, Van Der Eerden BC, et al. Renal Ca2+wasting, hyperabsorption, and reduced bone thickness in mice lacking TRPV5[J]. J Clin Invest, 2003,112(12):1906-1914.

[11] Kang SN, Lee JS, Park JH, et al. In vitro anti-osteoporosis properties of diverse Korean Drynariae rhizoma phenolic extracts[J]. Nutrients, 2014,6(4):1737-1751.

[12] 李取勝，王偉，韓秋俊，等．原兒茶酸衍生物的合成及活性研究[J]．中國中藥雜志，2013，38(2)：208-211．

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2016-08-25)