雷帕霉素對(duì)缺血再灌注損傷大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)層厚度的影響及其機(jī)制

黃逸慧，黃志輝，黃敏麗(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

雷帕霉素對(duì)缺血再灌注損傷大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)層厚度的影響及其機(jī)制

黃逸慧，黃志輝，黃敏麗
(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧530021)

目的 觀察雷帕霉素對(duì)缺血再灌注損傷(RIRI)大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、內(nèi)層厚度的影響，并探討其機(jī)制。方法 將65只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組5只、模型組30只和觀察組30只。模型組和觀察組采用前房灌注法制備RIRI大鼠模型，觀察組大鼠造模前2 h腹腔注射雷帕霉素(2 mg/kg)，模型組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。對(duì)照組不作任何處理。造模后0、2、6、12、24、48 h模型組、治療組分別處死5只大鼠，對(duì)照組5只大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死,摘除眼球制成石蠟切片。HE染色光鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)，測量視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度；用免疫組化法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜組織中的Caspase-7、Calpain-1表達(dá)的平均光密度(AOD)。結(jié)果 模型組大鼠造模后早期視網(wǎng)膜水腫增厚，晚期各層細(xì)胞排列疏松，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少,發(fā)生空泡樣變性。觀察組大鼠視網(wǎng)膜損傷程度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞空泡變性程度均低于模型組相同時(shí)點(diǎn)。造模后0、2 h觀察組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度小于模型組(P均<0.05)，造模后6、12、24、48 h觀察組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度大于模型組(P均<0.05)。造模后各時(shí)點(diǎn)觀察組視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時(shí)點(diǎn)(P均<0.05)，但均高于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論 雷帕霉素可以減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度，其機(jī)制可能與其降低視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1表達(dá)有關(guān)。

雷帕霉素;視網(wǎng)膜；缺血再灌注損傷;半胱氨酸蛋白酶7；鈣蛋白酶1； 細(xì)胞凋亡

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(RIRI)臨床常見于視網(wǎng)膜動(dòng)靜脈阻塞、糖尿病視網(wǎng)膜病變、青光眼以及影響視網(wǎng)膜血供的眼科術(shù)后患者，可導(dǎo)致患者視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡、視功能不可逆性損害。國內(nèi)外研究表明，RIRI過程中存在細(xì)胞凋亡[1]。半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族介導(dǎo)的蛋白水解酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生，Caspase-7是一種效應(yīng)凋亡蛋白酶，近期研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-7在神經(jīng)系統(tǒng)損傷中扮演著重要角色[2～3]。鈣蛋白酶家族(Calpains)是一類依賴鈣離子激活的中性半胱氨酸酶, Calpain-1是其中較常見的一種。有研究表明視網(wǎng)膜RIRI過程中鈣蛋白酶激活[4～5]。雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有抗菌、免疫抑制、調(diào)節(jié)自噬等作用，可抑制腦細(xì)胞凋亡[6，7]，但未見將雷帕霉素用于治療RIRI的報(bào)道。本研究觀察雷帕霉素對(duì)RIRI模型大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)、視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1表達(dá)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD大鼠65只，體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。雷帕霉素(美國Gene Operation公司)，Caspase-7單克隆抗體(英國Abcam公司)，Calpain-1單克隆抗體(美國OriGen公司)，PV-9000免疫組化試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 大鼠分組、RIRI模型建立及雷帕霉素應(yīng)用方法 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組5只、模型組30只和觀察組30只。模型組和觀察組均制備RIRI模型。觀察組大鼠造模前2 h腹腔注射雷帕霉素2 mg/kg，模型組腹腔注射等量的DMSO和生理鹽水。RIRI模型制作方法：以20 g/L戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉，均選取右眼造模。使用鹽酸利多卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。將連接生理鹽水輸液管的4.5號(hào)頭皮針沿顳側(cè)角鞏膜緣穿刺入大鼠右眼前房。緩慢勻速調(diào)整生理鹽水瓶液面高度，使其與大鼠實(shí)驗(yàn)眼垂直距離在150 cm處,此時(shí)眼壓達(dá)110 mmHg，可觀察到球結(jié)膜及虹膜顏色迅速變白，視網(wǎng)膜水腫呈蒼白色。前房灌注加壓持續(xù)60 min后逐漸降低輸液瓶高度至大鼠眼水平?？梢娗蚪Y(jié)膜與虹膜顏色迅速恢復(fù)正常, 視網(wǎng)膜血供恢復(fù)呈橘紅色,拔出穿刺針頭[8]。對(duì)照組不作任何處理。模型組和觀察組造模后0、2、6、12、24、48 h分別用戊巴比妥鈉腹腔過量麻醉法處死大鼠，摘除右側(cè)眼球，保留視神經(jīng)2 mm?；旌瞎潭ㄒ篬9]固定24 h后，剔除晶狀體等眼球內(nèi)容物，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后浸蠟，將標(biāo)本前端以角膜、后端以視神經(jīng)根定位，石蠟包埋，視網(wǎng)膜全層連續(xù)切片，厚度4 μm，置于防脫載玻片上，于55 ℃恒溫箱烤片3 h備用。

1.3 各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察 取切片進(jìn)行HE染色，倒置顯微鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)并拍照。

1.4 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度測定 在400倍物鏡放大下,用圖像分析系統(tǒng)采集數(shù)碼圖像，并以同等條件采集標(biāo)尺圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行測定。測量范圍在距離視乳頭200 μm處四周100 μm范圍內(nèi)，隨機(jī)選取4點(diǎn)測量厚度，取其平均數(shù)，每個(gè)標(biāo)本取3張切片測定,將所測像素值轉(zhuǎn)化為微米數(shù)。

1.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、Calpain-1檢測 采用免疫組化PV-9000二步法染色。操作按試劑盒說明進(jìn)行。Caspase-7與Calpain-1的一抗工作液濃度分別按1∶200和1∶500。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，每只眼球隨機(jī)取3張切片，每張切片在相同倍數(shù)下(400×)隨機(jī)采集4個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色產(chǎn)物進(jìn)行分析，得出平均光密度值(AOD)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)比較 對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊。模型組大鼠造模后0 h視網(wǎng)膜組織水腫，其中神經(jīng)纖維層與內(nèi)叢狀層表現(xiàn)顯著，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可見空泡樣變性;造模后2 h細(xì)胞腫脹，可見多個(gè)空泡樣變的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；造模后6 h視網(wǎng)膜水腫減輕，各細(xì)胞層排列疏松；造模后12 h，水腫已明顯減輕，神經(jīng)纖維層扁平，內(nèi)核層變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列較稀疏；造模后24 h，視網(wǎng)膜水腫基本消失，主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞變性，神經(jīng)纖維層明顯變薄，內(nèi)核層排列紊亂、輕度變薄，外核層變化不明顯；造模后48 h視網(wǎng)膜內(nèi)層明顯變薄，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有較多缺失。觀察組大鼠視網(wǎng)膜損傷程度和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞空泡變性程度均低于模型組相同時(shí)點(diǎn)。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度比較 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度見表1。造模后0、2 h觀察組視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度小于模型組(P均<0.05)，造模后6、12、24、48 h觀察組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度大于模型組(P均<0.05)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD比較 各組大鼠視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD見表1。觀察組造模后各時(shí)點(diǎn)視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時(shí)點(diǎn)(P均<0.05)，但均高于對(duì)照組(P均<0.05)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度及Caspase-7、Calpain-1表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組比較，＊P<0.05；與同時(shí)間點(diǎn)模型組比較，△P<0.05。

3 討論

RIRI可通過多種途徑，如細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、興奮性毒性物質(zhì)釋放、自由基氧化作用及神經(jīng)營養(yǎng)因子剝奪等[10,11]，引起視網(wǎng)膜細(xì)胞死亡，早期主要發(fā)生在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層，具有典型的細(xì)胞凋亡特征。Caspase家族是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡多條通路的集合點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[12]。Caspase是一類具有特異天冬氨酸酶切位點(diǎn)的半胱氨酸蛋白酶，正常情況下以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中。凋亡過程一旦觸發(fā)，Caspase通過自我活化、相互激活等多種形式，作用于特異性底物，呈現(xiàn)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、DNA斷裂損傷，引起細(xì)胞死亡。

Caspase-7是一種凋亡效應(yīng)分子，位于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)下游。Caspase-7與Caspase-3有53%的同源性，共同享有多個(gè)作用底物，且均能在凋亡過程中被Caspase-8、Caspase-9凋亡啟動(dòng)分子激活，因此Caspase-7長期被認(rèn)為只是對(duì)Caspase-3功能的一個(gè)補(bǔ)充。然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-7與Caspase-3有著顯著的差異，兩者雖然存在部分功能重疊，但并不完全一致，面對(duì)不同的細(xì)胞類型及刺激物時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)不同的表現(xiàn)[13,14]。Lakhani等[15]發(fā)現(xiàn)，Caspase-7基因敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，相比較于Caspase-3基因敲除而言，對(duì)Fas/FasL和紫外線誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡更具有抵抗力。Hermel等[16]研究顯示，Caspase-7蛋白表達(dá)增多與神經(jīng)細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Choudhury等[17]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，小鼠視神經(jīng)擠壓模型中，敲除Caspase-7基因可以有效地保護(hù)視神經(jīng)，減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞細(xì)胞凋亡。因此，Caspase-7在細(xì)胞凋亡中具有重要意義。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載在凋亡早期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與凋亡執(zhí)行中發(fā)揮重要作用[18]。Calpains是一類由鈣離子激活的中性半胱氨酸蛋白酶，參與細(xì)胞骨架重構(gòu)、胚胎發(fā)育、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞自噬等過程。Calpain-1是其中最具有代表性的成員之一，幾乎分布于所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通常以酶原形式存在?；罨笸ㄟ^直接或間接與Caspases相互作用，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。鈣蛋白酶的作用底物有許多，例如α-胞襯蛋白，促凋亡蛋白Bax、p53、pro-caspase-3、pro-caspase-12、c-Jun氨基末端激酶(JNK)以及多聚ADP核糖聚合酶(PARP)等[19～21]?？梢?，Calpains與Caspases有共同作用底物，在細(xì)胞凋亡過程中相互交錯(cuò)作用。在許多細(xì)胞凋亡模型中，依賴于鈣離子的Calpain激活作用發(fā)生在Caspases上游[22,23]。Juliette G等[24]在皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，Calpain-1可以裂解并激活Caspase-7，其小片段產(chǎn)物活性程度遠(yuǎn)高于Caspases途徑裂解Caspase-7所產(chǎn)生的活性片段。據(jù)此推測Caspase-7很有可能是鈣離子失衡的傳感器，在Calpain-1激活過程中被活化，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡。

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，早期研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素具有免疫抑制作用,目前已作為免疫抑制劑在臨床使用。近年來研究表明，雷帕霉素還具有調(diào)節(jié)自噬、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用[25,26]。自噬是真核細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)等大分子和老化細(xì)胞器主動(dòng)清除的一種方式，是一種自噬性程序性細(xì)胞死亡，與細(xì)胞凋亡相互作用，共同維持機(jī)體平衡。雷帕霉素通過誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生，可以減少神經(jīng)變性疾病過程中異常蛋白質(zhì)蓄積，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Pan等[27]研究表明,通過雷帕霉素增強(qiáng)自噬可逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞損傷。Rubinsztein等[28]發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)變性疾病及感染疾病中，可以通過誘導(dǎo)自噬對(duì)Calpain產(chǎn)生抑制作用從而得到改善。Okamoto等[29]通過建立小鼠視網(wǎng)膜炎模型，證實(shí)腹腔注射雷帕霉素可以改善視網(wǎng)膜炎模型中光感受器功能障礙，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

本研究結(jié)果顯示，模型組再灌注后即刻(0 h)可見視網(wǎng)膜組織水腫，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可見空泡樣變性，再灌注后24 h時(shí)觀察到視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少、細(xì)胞層排列紊亂等明顯的視網(wǎng)膜病理改變；相同時(shí)間點(diǎn)觀察組在水腫程度、空泡樣變性等方面均較模型組有不同程度的改善。免疫組化染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜可觀察到微量的Caspase-7陽性細(xì)胞和Calpain-1陽性細(xì)胞，主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層。造模后各時(shí)點(diǎn)觀察組視網(wǎng)膜組織Caspase-7、 Calpain-1的AOD均低于模型組相同時(shí)點(diǎn)，但均高于對(duì)照組。表明觀察組預(yù)先給予雷帕霉素處理，能夠下調(diào)Caspase-7、Calpain-1表達(dá)，促進(jìn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的存活。

綜上所述，雷帕霉素可以減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度，其機(jī)制可能與其降低Caspase-7、Calpain-1表達(dá)有關(guān)。由于RIRI后細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，多條信號(hào)通路相互交錯(cuò),雷帕霉素減輕RIRI大鼠視網(wǎng)膜損傷程度的具體機(jī)制需進(jìn)一步探討。

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廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFAA118273);廣西教育廳高?？蒲许?xiàng)目(YB2014072)。

黃敏麗(E-mail: nnhml@163.com)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.0110

R774

A

1002-266X(2017)11-0033-04

2016-08-15)