腹腔注射雷帕霉素的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化及其機制

謝陽， 黃遠帥， 楊元， 李作孝(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

·基礎(chǔ)研究·

腹腔注射雷帕霉素的實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化及其機制

謝陽， 黃遠帥， 楊元， 李作孝
(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目的 觀察腹腔注射雷帕霉素的實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化，并探討其機制。方法 將45只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組和觀察組，各15只。對照組不作任何處理。模型組和觀察組制備EAE模型。觀察組小鼠腹腔注射雷帕霉素0.75 mg/(kg·d)，2 d后再注射百日咳菌稀釋液0.5 mL，滿18 d后處死。取脊髓組織行尼氏染色，光鏡下觀察病理變化。采用DCF化學熒光法檢測脊髓組織勻漿活性氧簇(ROS)水平。 采用Western blotting法檢測各組小鼠自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Akt/mTOR/P70s6k信號通路蛋白p-Akt、p-mTOR。結(jié)果 光鏡下觀察模型組小鼠脊髓神經(jīng)元尼氏小體體積變小、數(shù)量減少及顏色變淺，排列松散，胞體與軸突輪廓模糊。與模型組相比，觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)排列較整齊，尼氏小體數(shù)量及體積均增多，胞體與軸突輪廓模糊現(xiàn)象少見。對照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量分別為(43.34±2.67)、(84.22±3.15)、(64.10±3.59)U/mgprot。模型組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量高于對照組(P<0.05)；觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS含量高于對照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。對照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值分別為0.486±0.021、0.251±0.032、0.566±0.054。小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值觀察組高于模型組，模型組低于對照組，P均<0.05。模型組小鼠小鼠脊髓組織p-Akt、p-mTOR條帶光密度值高于對照組，P均<0.05；觀察組小鼠小鼠脊髓組織p-Akt、p-mTOR條帶光密度值低于對照組和模型組，P均<0.05。結(jié)論 腹腔注射雷帕霉素的EAE小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化程度減輕。這可能是由于雷帕霉素可抑制AKT/mTOR/P70s6k通路激活自噬活性，清除ROS抑制氧化應激。

雷帕霉素；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；細胞自噬；氧化應激；PI3K-AKT-mTOR通路

多發(fā)性硬化(MS)是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)慢性炎性脫髓鞘病變?yōu)橹饕攸c的神經(jīng)退行性疾病，免疫失衡在其中發(fā)揮重要作用?；钚匝醮?ROS)是需氧細胞在代謝過程中產(chǎn)生的一系列活性氧族，在生理狀態(tài)下與抗氧化機制共同維系細胞的穩(wěn)態(tài)[1]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧耗量大，且抗氧化物質(zhì)相對于外周血中濃度偏低[2]，導致氧化與抗氧化作用失衡，可產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物ROS，它通過氧化損傷神經(jīng)元細胞中的蛋白質(zhì)、DNA及脂質(zhì)成分，并介導脂質(zhì)過氧化反應等引起神經(jīng)元退行性變性[3]。雷帕霉素是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，近年來有關(guān)雷帕霉素作為自噬誘導劑用于腫瘤及神經(jīng)退行性疾病治療的研究屢見不鮮，主要通過對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)特異性抑制，以及選擇性的抑制mTOR下游P70S6激酶的磷酸化與功能活化，誘導自噬進而加強對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的清除，減少聚集體的形成并抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的死亡[4]。雷帕霉素作為自噬誘導劑在MS及其動物模型EAE中是否可以對神經(jīng)元起到保護作用及其機制尚不明確。為此， 本研究觀察了腹腔注射雷帕霉素的EAE小鼠脊髓神經(jīng)元細胞病理改變程度的變化，并探討氧化應激、細胞自噬和AKT/mTOR/P70s6k通路在其中的作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 45只實驗用C57BL/6雌性小鼠(6～8周，17～20 g)購于成都達碩實驗動物有限公司，飼養(yǎng)于西南西科大學忠山校區(qū)動物房中，飼養(yǎng)室溫(24±2)℃，每12 h明暗交替一次，給予足夠的食料與飲水。實驗過程符合《實驗室動物飼養(yǎng)和操作條例》。MOG35-55 (北京中科亞光生物技術(shù)公司)，結(jié)核桿菌H37Ra(Difco 公司)，百日咳毒素(美國Sigma公司產(chǎn)品)，福氏完全佐劑(美國Sigma公司)，雷帕霉素(武漢凱通精細化工有限公司)，兔抗小鼠多克隆微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)B(CST公司)，兔抗GAPDH抗體(Abcam公司)，山羊抗兔HRP(KPL公司)，兔抗小鼠AKT、P-AKT抗體(CST公司)，兔抗小鼠P70s6k、P-P70s6k抗體(CST公司)，ROS檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Tunel染色試劑盒(拜意爾生物)。

1.2 小鼠分組、EAE模型制作及雷帕霉素應用方法 將45只小鼠隨機分為對照組、模型組和觀察組，每組15只。模型組和觀察組制備EAE模型。將抗原MOG35-55用PBS液稀釋成3 mg/mL，用等體積福氏完全佐劑混勻至乳濁液，按0.2 mL/只的劑量于小鼠脊柱段兩側(cè)任選2點處進行皮下注射，腹腔注射百日咳菌稀釋液0.5 mL。觀察組小鼠腹腔注射雷帕霉素0.75 mg/(kg·d)，2 d后再注射百日咳菌稀釋液0.5 mL，滿18 d后處死進行后續(xù)實驗。

1.3 各組小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化觀察 水合氯醛麻醉，灌注針從左心室深入升主動脈，小心剪開右心耳，用生理鹽水快速灌注直至肝臟發(fā)白,然后用4%多聚甲醛灌流約30 min后取出脊髓組織，常規(guī)石蠟包埋并切片，在脊髓腰膨大處連續(xù)切片，切片厚5 μm，行脊髓神經(jīng)元尼氏染色。光鏡下觀察脊髓神經(jīng)元病理形態(tài)。

1.4 各組小鼠脊髓勻漿ROS水平檢測 在冰盤上經(jīng)水合氯醛麻醉后，去眼球放血處死并快速斷頭，在冰上迅速取出脊髓組織，快速剪碎脊髓組織，加生理鹽水稀釋10倍，用玻璃勻漿器在冰上研磨，制成脊髓組織勻漿，然后離心(3 000 r/min離心15 min)，取上清液進行超濾離心，最后取上清液，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆貌捎肈CF化學熒光法檢測脊髓組織勻漿ROS水平。DCFH-DA試劑和PBS按照1∶9的比例配制DCFH-DA工作液。先在測試孔和對照孔中均加入上清液190 μL,然后在測試孔中加入1 mmol/L的DCFH-DA工作液10 μL，在對照孔中加入PBS液10 μL，用移液器吸打使之充分混勻，37 ℃孵育30 min，最佳激發(fā)波長為500 nm，最佳發(fā)射波長為525 nm，測定其熒光強度。

1.5 各組小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ檢測 采用Western blotting法。將分離出的脊髓腰膨大用RIPA裂解液裂解后提取總蛋白，用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度，經(jīng)過SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、室溫下封閉處理后加入1∶1 000稀釋的LC3B和GAPDH一抗，并在4 ℃中孵育過夜，用TBST洗滌3次回收的一抗稀釋液，再加入二抗(山羊抗兔HRP抗體)室溫孵育1 h，滴加ECL混合液于暗室中曝光，通過調(diào)整光強度顯影，最后用Alpha Ease FC軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值即蛋白表達水平。

1.6 各組小鼠脊髓組織AKT/mTOR通路蛋白檢測 采用Western blotting法。一抗為AKT/P-AKT、mTOR/P-mTOR。其余同上。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠脊髓神經(jīng)元病理變化 光鏡下觀察，對照組小鼠脊髓神經(jīng)元細胞形態(tài)及分布未見異常，神經(jīng)元胞體與軸突界限清晰，尼氏小體深染區(qū)與胞核淡染區(qū)輪廓清晰，尼氏小體豐富呈虎斑樣分布。模型組小鼠脊髓神經(jīng)元尼氏小體體積變小、數(shù)量減少及顏色變淺，排列松散，胞體與軸突輪廓模糊。與模型組相比，觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元內(nèi)排列較整齊，尼氏小體數(shù)量及體積均增多，胞體與軸突輪廓模糊現(xiàn)象少見。

2.2 各組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平比較 對照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平分別為(43.34±2.67)、(84.22±3.15)、(64.10±3.59)U/mgprot。模型組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平高于對照組(P<0.05)；觀察組小鼠脊髓組織勻漿ROS水平高于對照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。

2.3 各組小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值比較 對照組、模型組、觀察組小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值分別為0.486±0.021、0.251±0.032、0.566±0.054。小鼠脊髓組織自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ條帶光密度值觀察組高于模型組，模型組低于對照組，P均<0.05。

2.4 各組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值比較 各組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值見表1。模型組小鼠小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值高于對照組，P均<0.05；觀察組小鼠小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值低于對照組和模型組，P均<0.05。

表1 三組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR表達量比較

注：與對照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

MS發(fā)病機制至今尚未明確，在過去的研究中已經(jīng)證實炎性細胞浸潤和免疫失衡參與其中[6]。隨著對其研究的深入，在MS病灶中還可以發(fā)現(xiàn)髓鞘脫失、軸索損傷、神經(jīng)元變性及血腦屏障破壞等病理改變，而這些病理損傷都與氧化應激有著密切的聯(lián)系[7]。這與中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧耗量大，抗氧化能力低，氧化與抗氧化作用失衡時產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物ROS而遭受氧化應激損傷有關(guān)[8]。已有研究證實在MS急性期發(fā)病中,活化的巨噬細胞與小膠質(zhì)細胞大量釋放活性氧而造成氧化應激,它可以直接損傷細胞器的脂膜、DNA及蛋白質(zhì)，而受損的細胞器及異常的蛋白質(zhì)大量積聚于胞內(nèi)破壞細胞的平衡與穩(wěn)態(tài)[9]。并且Dasgupta等[10]在EAE小鼠脊髓束的大部分細胞中發(fā)現(xiàn)有不同程度的碳素化蛋白質(zhì)積聚，并且此機制貫穿EAE整個病情進展始末。自噬作為正常真核細胞清除蛋白質(zhì)和細胞器的主要途徑，是由單層或多層膜結(jié)構(gòu)包裹對受損細胞器等形成自噬小體，然后運送至溶酶體中形成自噬溶酶體并降解消化其內(nèi)容物的過程[11]，在真核細胞中，當發(fā)生氧化應激損傷時，機體啟動相關(guān)防御機制，可通過自噬對受損細胞器及異常的蛋白質(zhì)進行降解而抵抗氧化應激反應，從而維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)及細胞器的更新[12]。已有研究表明由于谷胱甘肽的缺陷及蛋白酶體抑制可以引起氧化應激的發(fā)生及碳素化蛋白質(zhì)的大量積聚，導致神經(jīng)元細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞死亡[13]。

mTOR作為經(jīng)典的調(diào)節(jié)自噬的蛋白激酶，在自噬的信號轉(zhuǎn)導通路中，mTOR是被發(fā)現(xiàn)參與其中的第一個分子，Ⅰ類PI3K/AKT信號通路是mTOR參與自噬的一條經(jīng)典的信號途徑，在它的下游信號中，絲/蘇氨酸激酶P70s6k可通過調(diào)控核糖體蛋白S6的磷酸化而抑制自噬的發(fā)生[14]。作為mTOR特異性抑制劑的雷帕霉素在1977年就被Martel發(fā)現(xiàn)它對EAE動物模型的病情進展進行完全的阻遏，并在慢性EAE小鼠模型中也證實了雷帕霉素可以延緩EAE臨床癥狀的出現(xiàn)及降低嚴重程度[16]。雷帕霉素可與FK506結(jié)合蛋白(FKBP12)相結(jié)合而形成Rapa-FKBP12復合物，并在靠近mTOR的C末端激酶結(jié)構(gòu)域上游與該復合物的結(jié)合位點(FRB)結(jié)合對mTOR特異性抑制，并且可以選擇性的抑制P70s6激酶的磷酸化與功能活化，從而誘導自噬的發(fā)生，被抑制的mTOR通過增加對溶酶體的生物合成，從而促進自噬溶酶體的形成，加強對細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的清除，減少聚集體的形成并抑制神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的死亡。雷帕霉素作為免疫抑制劑在EAE及MS發(fā)病機制中的作用已被證實，但其作為自噬誘導劑在EAE中神經(jīng)元保護作用的機制尚無報道，所以筆者設(shè)計了該實驗初步探討雷帕霉素在EAE中神經(jīng)保護作用機制。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比較，模型組小鼠脊髓神經(jīng)元中尼氏小體數(shù)量及體積減少，神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊，損傷嚴重；觀察組小鼠脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰，尼氏小體數(shù)量及體積介于對照組與EAE模型組之間。模型組小鼠脊髓勻漿ROS水平升高，自噬相關(guān)標記物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ降低；觀察組小鼠脊髓勻漿ROS水平低于模型組，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高。表明雷帕霉素可以保護受到損傷的小鼠脊髓神經(jīng)元，降低氧化應激，提高自噬水平。Shringarpure等[19]在EAE小鼠研究中發(fā)現(xiàn)大量積聚于神經(jīng)元細胞核及細胞質(zhì)的蛋白質(zhì)中含有許多被氧化的蛋白酶。有研究證實雷帕霉素可以通過誘導自噬減輕聚集蛋白質(zhì)的毒性作用從而減緩神經(jīng)退行性變。我們推測EAE發(fā)病高峰期ROS大量釋放誘發(fā)氧化應激，造成細胞器及蛋白質(zhì)等損害，而EAE發(fā)病高峰期中存在自噬缺陷，使大量的受損細胞器及蛋白質(zhì)無法得到有效清除而積聚于胞內(nèi)，大量積聚的已破壞的細胞器及蛋白質(zhì)等可正反饋促進ROS釋放，持續(xù)遭受攻擊損害致病情進行性加重。雷帕霉素可通過對自噬誘導，加強對受損細胞器和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的清除，對氧化應激產(chǎn)生抑制效應而使ROS水平降低，減輕神經(jīng)元損傷，從而起保護作用。為進一步驗證我們的推測，我們對自噬通路中AKT/P70s6蛋白磷酸化水平進行檢測，結(jié)果顯示模型組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值高于對照組，觀察組小鼠脊髓組織p-AKT、p-mTOR條帶光密度值低于對照組和模型組。提示模型組小鼠因磷酸化AKT及P70s6高表達而對自噬產(chǎn)生抑制效應，從而出現(xiàn)自噬缺陷。雷帕霉素可對mTOR信號通路中上下游磷酸化AKT及P70s6蛋白激酶的抑制而誘導自噬的發(fā)生，并對胞內(nèi)大量積聚的受損細胞器及異常蛋白質(zhì)進行有效的清除，從而使氧化/抗氧化作用得以平衡，抑制了氧化應激的進展，限制ROS對脊髓神經(jīng)元的損傷破壞，從而對EAE小鼠脊髓神經(jīng)元細胞起保護作用。

[1] Ohl K, Tenbrock K, Kipp M. Oxidative stress in multiple sclerosis: central and peripheral mode of action[J]. Exp Neurol，2016，277:58-67.

[2] Miller E, Mrowicka M, Zolynski K, et al. Oxidative stress in multiple sclerosis[J]. Polski Merkur Lek，2009，27(162):499-502.

[3] Gandhi S, Abramov AY. Mechanism of oxidative stress in neurodegneration[J]. Oxid Med Cell Long，2012，2012(3):428010-428010.

[4] Ravikumar B, Duden R, Rubinsztein DC. Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy[J]. Hum Mol Gen，2002，11(9):1107-1117.

[5] Bergamini E.Autophagy: a cell repair mechanism that retards ageing and age-associated diseases and can be intensified pharmacologically[J]. Mol Aspects Med，2006，27(5-6):403-410.

[6] Nakajima H, Fukuda K, Doi Y, et al. Expression of TH1/TH2-related chemokine receptors on peripheral T cells and correlation with clinical disease activity in patients with multiple sclerosis[J]. Eur Neurol，2004，52(3):162-168.

[7] Gonsette RE. Neurodegeneration in multiple sclerosis: the role of oxidative stress and excitotoxicity[J]. J Neurol Sci，2008，274(1-2):48-53.

[8] Miller E, Walczak A, Saluk J, et al. Oxidative modification of patient's plasma proteins and its role in pathogenesis of multiple sclerosis[J]. Clinical Biochemistry, 2012, 45(1-2):26-30.

[9] Qi X, Lewin AS, Sun L, et al. Mitochondrial protein nitration primes neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. Biol Chem， 2006，281(42):31950-31962.

[10] Dasgupta A, Zheng J, Perrone-Bizzozero NI, et al. Increased carbonylation, protein aggregation and apoptosis in the spinal cord of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis[J]. ASN Neuro，2013，5(2):111.

[11] Kiffin R, Bandyopadhyay U, Cuervo AM. Oxidative stress and autophagy[J]. Antioxid Redox Signal，2006，8(1-2):152-162.

[12] He LQ, Lu JH, Yue ZY. Autophagy in ageing and ageing-associated diseases[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2013，34(5):605-611.

[13] Divald A,Powell SR. Proteasome mediates removal of proteins oxidized during myocardial ischemia[J]. Free Radic Biol Med, 2006,40(1):156-164.

[14] Kumar S, Patel R, Moore S, et al. Estrogen receptor beta ligand therapy activates PI3K/Akt/mTOR signaling in oligodendrocytes and promotes remyelination in a mouse model of multiple sclerosis[J]. Neurobiol Dis, 2013,56(4):131-144.

Pathological changes of spinal cord neurons in EAE mice with intraperitoneal injection of rapamycin

XIEYang,HUANGYuanshuai,YANGYuan,LIZuoxiao

(TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

Objective To investigate the pathological changes of spinal cord neurons in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice with intraperitoneal injection of rapamycin and the mechanisms underlying it.Methods C57BL/6 mice were randomly divided into the control group, model group and observation group, 15 mice in each group. In the model group and observation group, we prepared the EAE models. The mice in the observation group were injected with rapamycin 0.75 mg/(kg·d) intraperitoneally and were injected with 0.5 mL of the pertussis bacteria dilution after 2 days and killed after 18 days. Collecting the spinal tissues to observe pathological changes with nissl staining, detecting the content of ROS with DCF chemical fluorescence, the expression of autophagy markers LC3-II/LC3-I and mTOR, Akt proteins in Akt/mTOR signaling pathway with Western blotting. Results Compared with the control group, the nissl bodies had smaller volumes, less number and fuzzy boundaries in spinal cord neurons of mice in the model group. Compared with the model group, the spinal cord neurons were neatly arranged, the number and the volume of the nissl bodies were increased, fuzzy boundaries phenomenons were rare in the observation group. The content of ROS in the control group, model group and observation group were (43.34±2.67), (84.22±3.15) and (64.10±3.59) U/mgprot, respectively. The content of ROS in the model group was higher than that of the control group (P<0.05). The content of ROS in the observation group was higher than that in the control group (P<0.05), which was lower than that in the model group (P<0.05). The autophagy marker LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰstrip optical density (OD) values in the spinal cord tissues of three groups were 0.486±0.021, 0.251±0.032 and 0.566±0.054, respectively; the observation group was higher than the model group, and the model group was lower than the control group (all P<0.05). Meanwhile, the OD values of p-Akt and p-mTOR proteins in the model group were higher than those of the control group (bothP<0.05), and the OD values of p-Akt and p-mTOR proteins in the observation group were lower than those of the control group and model group (allP<0.05). Conclusions Intraperitoneal injection of rapamycin reduces the pathological changes of spinal cord neurons in EAE mice. This may be due to the fact that rapamycin inhibits autophagic activity of AKT/mTOR/P70S6 pathway, removes ROS and inhibits oxidative stress.rapamycin can inhibit the mTOR signaling pathways to activate the autophagy activities, and reduce the ROS levels to inhibit the oxidative stress ,thus protecting the spinal cord neurons in EAE mice.

rapamycin; experimental autoimmune encephalomyelitis; cell autophagy; oxidative stress; PI3K-AKT-mTOR signaling pathways

四川省衛(wèi)生廳科研基金資助項目(120336)。

謝陽(1992-)，男，碩士研究生，醫(yī)師，主要研究方向為神經(jīng)免疫學。E-mail： 464418617@qq.com

李作孝(1964-)，男，碩士，教授，主要研究方向為神經(jīng)免疫學。E-mail： lzx3235@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.11.008

R744.5

A

1002-266X(2017)11-0026-04

2016-09-22)