聚對(duì)二氧環(huán)己酮體外降解產(chǎn)物的研究

張良 郎潔 陳陽 趙凱華 邸偉慶 薛雁 遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司 （遼寧 沈陽 110171）

聚對(duì)二氧環(huán)己酮體外降解產(chǎn)物的研究

張良 郎潔 陳陽 趙凱華 邸偉慶 薛雁 遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司 （遼寧 沈陽 110171）

目的：對(duì)聚對(duì)二氧環(huán)己酮體外降解行為進(jìn)行研究，建立檢測(cè)方法，確定降解產(chǎn)物。方法：將聚對(duì)二氧環(huán)己酮（PPDO）在磷酸鹽緩沖溶液中進(jìn)行降解，建立高效液相色譜分析方法對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行研究。結(jié)果：利用自制的（2-羥基乙氧基）乙酸鈉，確認(rèn)聚對(duì)二氧環(huán)己酮的體外降解產(chǎn)物為（2-羥基乙氧基）乙酸，建立了定性測(cè)定（2-羥基乙氧基）乙酸的高效液相色譜方法，該方法專屬性、耐用性良好，檢出限10.6ng。結(jié)論：適用于聚對(duì)二氧環(huán)己酮微量體外降解產(chǎn)物的定性檢查。

聚對(duì)二氧環(huán)己酮 體外降解產(chǎn)物 （2-羥基乙氧基）乙酸

1.前言

聚對(duì)二氧環(huán)己酮（Poly （p-dioxanone），PPDO），屬于脂肪族聚醚酯，具有優(yōu)良的生物相容性和生物降解性[1]。由于分子中醚鍵的存在，該材料具有優(yōu)良的柔韌性和抗張強(qiáng)度，作為醫(yī)用可降解材料備受矚目，可用來制造單絲手術(shù)縫合線、止血紗布、醫(yī)用敷料、各種醫(yī)用補(bǔ)片、以及手術(shù)后用于防止手術(shù)部位粘連的防粘黏膜等[2]。

以往就PPDO體外降解行為的研究，大多采用以PPDO為材料的手術(shù)縫合線為研究對(duì)象，集中關(guān)注在吸水率、質(zhì)量損失以及特性黏數(shù)的變化[3]，對(duì)降解產(chǎn)物的研究較少，不能指導(dǎo)PPDO產(chǎn)品的臨床使用。為更好的研究PPDO的性質(zhì)，并深入了解PPDO的穩(wěn)定性，需要對(duì)體外降解行為進(jìn)行研究。

體外降解試驗(yàn)選取模擬人體內(nèi)pH值的降解液，人血液的pH值為7.35～7.45，而人體內(nèi)主要的緩沖體系主要有三種：蛋白質(zhì)（7.4）；碳酸鹽（6.1）；磷酸鹽（7.2），考慮人體pH值和緩沖體系兩方面因素，選取磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.44）作為PPDO的體外降解環(huán)境。

2.實(shí)驗(yàn)操作

PPDO屬于脂肪族聚酯化合物，在體外水溶液環(huán)境中的降解行為以酯鍵斷裂為主。因此，以二氧環(huán)己酮為起始物料，合成了（2-羥基乙氧基）乙酸鈉（相比于（2-羥基乙氧基）乙酸可以穩(wěn)定存在），對(duì)降解產(chǎn)物進(jìn)行了定性研究。2.1（2-羥基乙氧基）乙酸鈉的制備[4]

向配有冷凝管的500mL的反應(yīng)瓶中加入20g對(duì)二氧環(huán)己酮，50mL甲醇，攪拌下滴加4mol/L NaOH溶液75mL，滴畢，40?C攪拌3h，停止加熱，冷卻至室溫后，攪拌下緩慢加入無水乙醇200mL，攪拌30min后，過濾，無水乙醇洗滌濾餅（10mL×3），干燥后得白色固體14.1g，收率50.0%。1HNMR(DMSO) δ3.97(2H,s)、δ3.64(2H, t, J=4.8Hz)、δ3.74(2H, t, J=4.8Hz)、δ6.96(1H,s)；MS(ESI):168[M+Na]+、143[M+H]+。

2.2 PPDO降解液的制備

取PPDO粉料約200mg，精密稱定，置20mL瓶中，加入10mLPBS緩沖液（磷酸二氫鉀和氫氧化鈉，pH 7.44），密封，置60?C水浴加熱，7天后取出。

圖1.(2-羥基乙氧基)乙酸的合成路線

3.儀器與試劑

3.1 儀器

日本島津LC-20A型高效液相色譜儀，含LCsolution工作站、LC-20A泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-20A型紫外檢測(cè)器、BT 25S型分析天平（賽多利斯，感量0.01mg）。

3.2 試劑

（2-羥基乙氧基）乙酸鈉（遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司）、PPDO粉料（遼寧遠(yuǎn)大諾康生物制藥有限公司）、乙腈（色譜純、Fisher）、蒸餾水（屈臣氏）、磷酸二氫鉀（分析純），磷酸（分析純）。

4.方法與結(jié)果

4.1 色譜條件

色譜柱：Thermo HyPURITY C18（5μm，250mm×4.6mm）；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（10mmol/L磷酸二氫鉀，磷酸調(diào)節(jié)pH2.50）-乙腈（95:5）；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；流速0.9mL/ min；柱溫：25?C；進(jìn)樣量：20μL。

4.2 溶液的制備

4.2.1 對(duì)照溶液：取自制（2-羥基乙氧基）乙酸鈉約25mg，精密稱定，至25mL量瓶中，加入0.1mol/L HCl溶液2mL，振搖使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照溶液。

4.2.2 供試品溶液：精密量取PPDO降解液1mL，置10mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得供試品溶液。

4.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)與專屬性考察

按“4.1”項(xiàng)下色譜條件，精密量取對(duì)照溶液、供試品溶液、空白溶液（流動(dòng)相）各20μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。對(duì)照溶液色譜圖中，（2-羥基乙氧基）乙酸的保留時(shí)間為4.407min，理論塔板數(shù)為7131，拖尾因子1.054。供試品溶液色譜圖中，在與對(duì)照溶液主峰色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同的色譜峰，主峰與相鄰峰的最小分離度為4.461；空白溶液色譜圖在與對(duì)照溶液主峰保留時(shí)間處無相應(yīng)色譜峰，說明空白溶液無干擾，本方法專屬性強(qiáng)。典型色譜圖見圖2。

4.4 精密度考察

精密量取“4.2.1”項(xiàng)下對(duì)照溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得（2-羥基乙氧基）乙酸保留時(shí)間的RSD為0.070%，精密度良好。精密度考察數(shù)據(jù)見表1。

4.5 檢出限考察

精密量取“4.2.1”項(xiàng)下對(duì)照溶液適量，用流動(dòng)相稀釋，按“4.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，當(dāng)主峰的響應(yīng)值約為噪音水平的3倍時(shí)，其檢出限為10.6ng。

4.6 耐用性考察

精密量取“4.2.1”項(xiàng)下對(duì)照溶液、供試品溶液、空白溶液（流動(dòng)相）各20μL，按照選定的色譜條件，即不同流速（0.8～1.0mL/min），不同比例流動(dòng)相（乙腈3%～7%），

表1.精密度考察結(jié)果

圖2.PPDO降解產(chǎn)物高效液相色譜圖

不同pH值（2.45～2.55），不同波長(zhǎng)（213～217nm），不同品牌色譜柱（Thermo Hyperity C18，Kromasil C18）條件下，進(jìn)樣記錄色譜圖，分別考察不同因素變化條件下的分離度和拖尾因子的變化情況。除流動(dòng)相比例變化外，在各微小變動(dòng)下，拖尾因子和分離度均符合要求，方法耐用性較好，但對(duì)流動(dòng)相比例應(yīng)嚴(yán)格控制。

5.結(jié)論

利用對(duì)羥基環(huán)己酮為起始原料合成了PPDO的體外降解產(chǎn)物（2-羥基乙氧基）乙酸的鈉鹽，并建立了高效液相色譜方法，進(jìn)行PPDO體外降解產(chǎn)物的定性檢查，方法專屬性良好，靈敏度高。

6.討論

6.1 檢測(cè)器的選擇

（2-羥基乙氧基）乙酸結(jié)構(gòu)中僅有羧基一個(gè)發(fā)色基團(tuán)，沒有共軛結(jié)構(gòu)，在紫外和可見光區(qū)域（190～800nm）范圍內(nèi)吸收弱，最初考慮采用ELSD檢測(cè)器檢測(cè)，但降解液中含有磷酸鹽，造成基線波動(dòng)，干擾檢測(cè)，且采用ELSD檢測(cè)器方法的檢出限為80ng，靈敏度低，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)微量降解產(chǎn)物的檢測(cè)。進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，（2-羥基乙氧基）乙酸最大吸收接近末端吸收，隨波長(zhǎng)變成吸收逐漸降低，結(jié)合使用流動(dòng)相的截止波長(zhǎng)，最終選定215nm作為本實(shí)驗(yàn)的紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。

6.2 流動(dòng)相的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道[4]，（2-羥基乙氧基）乙酸的pKa=3.31±0.02，且化合物本身極性大，為獲得較好的保留，流動(dòng)相pH值應(yīng)低于其pKa，且需要在流動(dòng)相中添加緩沖鹽，以獲得良好峰形，參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]，結(jié)合pH要求和酸性化合物的分析經(jīng)驗(yàn)，選擇磷酸二氫鉀作為緩沖鹽，考慮到磷酸鹽緩沖液的緩沖能力和C18柱的耐受能力，最終確定流動(dòng)相pH值2.50±0.05。

6.3 方法適用性

本方法采用常規(guī)檢測(cè)器和常見色譜柱，流動(dòng)相也為常用體系，對(duì)檢測(cè)設(shè)備要求低；方法檢出限低，可以靈敏地檢測(cè)出微量的降解產(chǎn)物，應(yīng)用范圍廣泛。

[1] 徐向奎, 馮亞凱, 薛燕.對(duì)二氧環(huán)己酮及其聚合物的研究進(jìn)展[J].化學(xué)工業(yè)與工程, 2008,21(3):259-263.

[2] 曲樂, 曹江, 黃新苗.可降解聚對(duì)二氧環(huán)己酮材料的臨床應(yīng)用[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2011,15(3):527-530.

[3] 白威, 陳棟梁, 李慶, 等.高分子量聚對(duì)二氧環(huán)己酮體外降解研究[J].高分子學(xué)報(bào), 2009, 53(1)78-83.

[4] Niangoran Koissi, Niti H.Shah, Brandon Ginevan, William S.Eck, Bill D.Roebuck, and James C.Fishbein = Chemical Research in Toxicology.2012,25(5), 1022-1028

[5] 鄭誼豐, 周華, 王麗燕, 等.高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中聚蘋果酸方法的建立[J].食品科技, 2010, 36(4):243-246.

The Degradation of PPDO In-vitro

ZHANG Liang LANG Jie CHEN Yang ZHAO Kai-hua DI Wei-qing XUE Yan Liaoning Grand NuoKang Biopharmaceutical CO, LTD.(Liaoning Shenyang 110171)

Objective: To study the degradation of Poly (p-dioxanone) (PPDO) in-vitro and establish a method for the qualitative determination.Method: The degradation of Poly (p-dioxanone) (PPDO) in PBS is studied by a high performance liquid chromatography method.Result: Taking the self-made sodium 2-hydroxy ethoxy acetic acid as reference substance, the degradation product of (PPDO) in PBS, is determined to be ((2-hydroxy)ethoxy) acetic acid by the HPLC method, which is specifc, good robustness, and the detection limit is 10.6 ng.Conclusion: It is suitable for qualitative examination of in-vitro degradation products of Poly (p - dioxanone).

poly (p-dioxanone), in-vitro degradation product, (2-hydroxyethoxy) acetic acid

1006-6586(2017)04-0006-02

R318.08

A