侯彬彬++宋江濤+馬驍+陳福欣+周安寧

摘要：采用NaOH、乙醇復(fù)合溶劑對葵花稈進(jìn)行預(yù)處理，通過單因素試驗研究了反應(yīng)時間、溫度、固液比、溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)及復(fù)合溶劑比例對葵花稈木質(zhì)素去除率的影響，然后利用正交試驗法對預(yù)處理條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳預(yù)處理條件為溫度170 ℃，2% NaOH和70%乙醇的復(fù)合溶劑體積比為2 ∶[KG-*3]1，固液比1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），反應(yīng)時間1 h，該條件下木質(zhì)素去除率為53.75%。酶解試驗表明，木質(zhì)素去除率越高，葡萄糖產(chǎn)率越高。最后通過紅外光譜、掃描電鏡對預(yù)處理前后的葵花稈進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后的葵花稈結(jié)構(gòu)遭到破壞，出現(xiàn)不規(guī)則的裂痕，木質(zhì)素與半纖維素之間的結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出更多的纖維素和半纖維素。

關(guān)鍵詞：葵花稈；預(yù)處理；復(fù)合溶劑；酶解；木質(zhì)素

中圖分類號：TS721+.1；TQ914.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2017）03-0136-05

收稿日期：2016-04-28

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：51174279）；教育部博士學(xué)科專項基金（編號：20116121110005）。

作者簡介：侯彬彬（1991—），男，陜西榆林人，碩士研究生，主要從事煤炭基精細(xì)化學(xué)品合成及有機合成研究。E-mail：774716071@qq.com。

通信作者：周安寧，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事煤及生物質(zhì)多聯(lián)產(chǎn)轉(zhuǎn)化與功能材料制備研究。E-mail：psu564@139.com。

中國作為傳統(tǒng)的農(nóng)業(yè)大國，每年葵花稈產(chǎn)量約7億多t[1]。葵花稈作為一種重要的生物綜合利用資源，在農(nóng)村多數(shù)被就地焚燒或棄置腐爛，不僅浪費資源，也污染環(huán)境?？ǘ挼闹饕煞譃槟举|(zhì)素、纖維素等，可作為生產(chǎn)生物質(zhì)能源的重要原料[2]。在制備生物乙醇方面，關(guān)鍵步驟是將纖維素、半纖維素水解為單糖，而在自然狀態(tài)下，木質(zhì)素像保護(hù)層一樣包圍在纖維素和半纖維素之間，且有很高的結(jié)晶度[3]，導(dǎo)致纖維素酶對其水解能力變?nèi)?，所以有必要對葵花桿進(jìn)行木質(zhì)素脫除。對秸稈木質(zhì)素進(jìn)行預(yù)處理的方法較多，較早的方法是機械處理法[4]，但成本高；蒸汽爆破處理法[5-6]木質(zhì)素轉(zhuǎn)化及半纖維素溶解效果好，但易產(chǎn)生有毒物質(zhì)；微波加熱法速率快，所需能量少[7]，可以破壞纖維素的結(jié)晶區(qū)，降低表皮木質(zhì)素含量[8]，但對酶水解促進(jìn)作用??；生物法主要利用白腐菌、褐腐菌、軟腐菌、木腐菌對秸稈木質(zhì)素進(jìn)行預(yù)處理[9-12]，其優(yōu)點是條件溫和，環(huán)境友好，但缺點是受菌種及其分泌酶狀況的影響，且處理周期長，水解得率較低；堿法可以發(fā)生溶劑化、皂化作用，導(dǎo)致生物質(zhì)膨脹，可有效脫除木質(zhì)素，與酸法比較，對纖維素、半纖維素的破壞程度較輕，而且會導(dǎo)致纖維素變得比天然纖維素更致密、穩(wěn)定[13-14]。Mathew等開展了NaOH預(yù)處理油菜秸稈用于評價葡萄糖產(chǎn)率的研究，發(fā)現(xiàn)堿預(yù)處理比酸預(yù)處理效果好，堿預(yù)處理下產(chǎn)率為44%左右[15]。有機溶劑能斷裂秸稈內(nèi)部木質(zhì)素與纖維素之間的酯鍵，增大葡萄糖產(chǎn)率[16]，還可通過減壓蒸餾進(jìn)行回收，降低成本，且提取的木質(zhì)素純度高，可避免阻礙微生物生長、酶法水解和發(fā)酵的化合物生成[17]。Neilson等使用乙醇預(yù)處理來脫除木質(zhì)素，可以提高木材的酶解率[18]。雖然各種預(yù)處理方法各有優(yōu)勢，但單一的預(yù)處理方式有局限性，文獻(xiàn)中也多次報道組合試劑法，Dai等采用NaOH、尿素對水稻秸稈預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其有協(xié)同效應(yīng)，明顯提高了糖產(chǎn)率[19]。He等用離子液體 1-丁基-3-甲基咪唑氯鹽與NaOH處理玉米秸稈，酶促水解 2 d，生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成還原糖的產(chǎn)率為95.1%[20]。基于溶劑法和堿法的各自優(yōu)勢，嘗試選用復(fù)合溶劑法進(jìn)行葵花稈的預(yù)處理。本研究選用NaOH、乙醇復(fù)合溶劑對葵花稈進(jìn)行預(yù)處理，研究預(yù)處理時間、溫度、固液比、堿醇比以及堿和乙醇濃度對木質(zhì)素去除率的影響，并通過正交試驗確定最佳條件，比較復(fù)合溶劑與單溶劑預(yù)處理對葵花稈酶解制糖的影響，以期提高木質(zhì)素的去除率，進(jìn)一步提高酶解制糖產(chǎn)率。

1材料與方法

1.1材料及儀器

材料：葵花稈取自陜西省神木縣，用粉碎機粉碎后過 40～80目篩，主要成分如下：水分12.51%、綜纖維素4884%、木質(zhì)素13.26%、灰分4.24%；纖維素酶來源于黑曲霉（載體為淀粉），粉末，購自于阿拉丁公司；氫氧化鈉、無水乙醇、葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸、檸檬酸鈉、檸檬酸、鹽酸、丙酮、硫酸均為分析純。

儀器：恒溫油浴鍋（DF-101S型），離心機（SK-1型），恒溫水浴振蕩器（DKZ系列），鼓風(fēng)干燥箱（101-3型），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000B型），電子天平（FA-2004型），雙光束紫外可見分光光度計（TU-1901型），馬弗爐（XSI-25-1200型），傅里葉紅外光譜儀（EQUINOX55型），掃描電鏡（JSM 6460 LV型）。

1.2葵花稈預(yù)處理

取一定量葵花稈，在鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量。取2 g葵花稈置于三口燒瓶中，加入預(yù)處理液，在一定溫度下反應(yīng)一段時間。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫后抽濾，用超純水將濾餅洗滌至中性，收集濾液、濾餅。濾餅在105 ℃下烘干至恒質(zhì)量。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸餾，回收乙醇，然后在濾液中加入濃硫酸使木質(zhì)素析出沉淀，最后回收木質(zhì)素，木質(zhì)素去除率計算方法如下：

[JZ（]木質(zhì)素去除率=[JB（（]1-[SX（]溶劑法處理后木質(zhì)素質(zhì)量葵花稈中木質(zhì)素質(zhì)量[SX）][JB））]×100%。[JZ）][JY]（1）

1.3濾紙酶活力的測定

參照QB 2583—2003《纖維素酶制劑》的方法配制DNS試劑、檸檬酸緩沖液、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（10 mg/mL）及葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。參照QB 2583—2003《纖維素酶制劑》的方法，制備待測酶樣和濾紙條，利用下式計算濾紙酶活力：

[JZ（]X1=A×1/0.5×n。[JZ）][JY]（2）

式中：X1為濾紙酶活力（FPA）；A為由測得吸光度計算的還原糖量；1/0.5為酶液的稀釋倍數(shù)。

1.4酶解試驗

分別取50 mg未經(jīng)處理的葵花稈、經(jīng)2% NaOH溶液處理、經(jīng)70%乙醇溶液處理、經(jīng)2% NaOH溶液和70%乙醇溶液協(xié)同處理的葵花稈各4組，共16組于試管內(nèi)，對其進(jìn)行編號。在每只試管中加入一定量檸檬酸緩沖液和90 U/g的纖維素酶，混勻，蓋塞，置于50 ℃的恒溫水浴振蕩器中酶解，每隔 12 h 各取4種原料中的1支試管，加入DNS試劑，在沸水浴中加熱10 min使酶失活。然后在冷水浴中使其降到室溫，加水至25 mL混勻，使用雙光束紫外可見分光光度計測定溶液在波長540 nm下的吸光度，將該吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線的線性回歸方程，計算出葡萄糖產(chǎn)量。

2結(jié)果與分析

2.1各因素對葵花稈木質(zhì)素去除率的影響

2.1.1水解溫度、水解時間對木質(zhì)素去除率的影響

水解溫度選擇：稱取2 g葵花稈，加入90%乙醇、2% NaOH復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，分別在140、150、160、170 ℃下水解 1 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖1-a所示，隨著溫度升高，木質(zhì)素去除率不斷提高，但是當(dāng)溫度進(jìn)一步提高時，木質(zhì)素去除率上升緩慢。說明隨著溫度升高，預(yù)處理反應(yīng)越來越劇烈，溫度到160 ℃時反應(yīng)劇烈程度趨于飽和，所以木質(zhì)素去除率的上升速率變慢。

水解時間選擇：稱取2 g葵花稈，加入90%乙醇、2% NaOH復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下，分別水解0.5、1.0、1.5、2.0 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖1-b所示，隨著處理時間延長，木質(zhì)素去除率呈現(xiàn)迅速增大而后趨于平緩增長的趨勢。處理時間越長，木質(zhì)素去除率越高。當(dāng)處理時間超過1.5 h后，反應(yīng)液中的木質(zhì)素含量趨于飽和，時間過長可能會阻止木質(zhì)素的繼續(xù)溶出。

2.1.2溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)、體積分?jǐn)?shù)對木質(zhì)素去除率的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入60%、70%、80%、90%乙醇和2% NaOH的復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖2-a所示，隨著乙醇濃度增大，木質(zhì)素去除率先升高后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，木質(zhì)素去除率最高。這與有機溶劑乙醇破壞了木質(zhì)素之間的連接鍵、半纖維素之間的糖苷鍵以及木質(zhì)素和半纖維素之間的醚鍵、4-O-甲基葡萄糖醛酸酯鍵，加速木質(zhì)素的溶出有關(guān)，所以乙醇體積分?jǐn)?shù)不宜過高或過低，結(jié)合實際生產(chǎn)成本，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

[JP+1]NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇和0.5%、1.0%、2.0%、3.0% NaOH的復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1） 40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖2-b所示，隨著NaOH濃度增大，木質(zhì)素去除率不斷上升，但是上升趨勢不斷減緩。氫氧化鈉導(dǎo)致木質(zhì)素膨脹、纖維素內(nèi)表面積增加以及聚合度和結(jié)晶度降低，從而引發(fā)木質(zhì)素結(jié)構(gòu)的斷裂，考慮到實際成本，選擇NaOH溶液濃度為2.0%。

2.1.3固液比和復(fù)合溶劑體積比對木質(zhì)素去除率的影響

固液比選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇、2% NaOH復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]1）30、40、50、60 mL，在160 ℃下水解 1 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖3-a所示，隨著固液比的增加，木質(zhì)素去除率先升高后緩緩下降。由于乙醇可以溶解木質(zhì)素，因此增大固液比有利于木質(zhì)素的溶出，但到一定程度就會飽和。當(dāng)固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）時，木質(zhì)素去除率最高。

乙醇與NaOH體積比的選擇：稱取2 g葵花稈，分別加入70%乙醇、2% NaOH復(fù)合溶劑（V ∶[KG-*3]V=1 ∶[KG-*3]0、2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2、0 ∶[KG-*3]1）40 mL，在160 ℃下水解1 h，測其木質(zhì)素去除率。如圖3-b所示，單獨用2種溶液進(jìn)行預(yù)處理時，木質(zhì)素去除率很低；當(dāng)2種溶液進(jìn)行復(fù)合處理時，木質(zhì)素去除率有較大提升，說明復(fù)合溶劑有協(xié)同作用，當(dāng)乙醇溶液與NaOH溶液體積比為1 ∶[KG-*3]2時，木質(zhì)素去除率最高。

2.1.4正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，分別將NaOH濃度、乙醇濃度確定為2%、70%，將考察因素定為溫度、時間、復(fù)合溶劑（2% NaOH、70%乙醇）比例、固液比，采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗，因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，4個因素對葵花稈木質(zhì)素去除率影響大小次序為時間>復(fù)合溶劑體積比>固液比>溫度。優(yōu)化得到的最佳條件為A3B2C1D1，即加熱溫度170 ℃，時間1 h，2% NaOH、[JP2]70%乙醇體積比2 ∶[KG-*3]1，固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL）。使用該最優(yōu)條件進(jìn)行試驗驗證，得到的木質(zhì)素去除率為 53.75%，高于表2中所有結(jié)果，驗證了正交試驗結(jié)果的正確性。

2.2葵花稈預(yù)處理前后的結(jié)構(gòu)變化

2.2.1紅外光譜分析

從圖4可以看出，水解前后的葵花稈紅外譜圖基本相似，3 370 cm-1為分子內(nèi)羥基O—H伸縮振動譜帶，2 920 cm-1為—CH、—CH2伸縮振動的吸收峰，波數(shù) 1 720～1 733 cm-1處的吸收峰表征與木質(zhì)素或半纖維素有關(guān)的非共軛酮基、羰基及酯鍵的C[FY=，1]O伸縮振動[21]，1 650 cm-1處的吸收峰由木質(zhì)素中共軛羰基伸縮振動所導(dǎo)致[22]。經(jīng)預(yù)處理后，發(fā)現(xiàn)其特征吸收峰基本消失不見，說明木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)被破壞，1 510 cm-1為木質(zhì)素苯環(huán)骨架振動的特征吸收峰，經(jīng)預(yù)處理后也基本消失，說明脫出了木質(zhì)素。1 250 cm-1愈創(chuàng)木基的苯環(huán)伸縮振動引起，1 060～1 062 cm-1為葵花稈的中纖維素與半纖維素的特征光譜帶，897 cm-1為纖維素中 β-D-葡萄糖苷的特征峰[23-24]，預(yù)處理的特征峰與原樣品相比有了更明顯的變化，這可能是因為經(jīng)過堿和有機溶劑協(xié)同預(yù)處理，斷裂了木質(zhì)素與半纖維素間的連接鍵，使部分木質(zhì)素得以去除。消除了木質(zhì)素的包裹，纖維素和半纖維素暴露出來的部分越來越多，所以其特征峰更加明顯。

2.2.2掃描電鏡分析

在植物細(xì)胞壁中，纖維素被木質(zhì)素伸展蛋白、半纖維素、果膠質(zhì)組成的基質(zhì)所包埋，這樣可以增強植物細(xì)胞壁的抗拉強度和機械性能，所以在圖5-a中所看到的葵花稈結(jié)構(gòu)致密，纖維素緊密排列在一起，高度有序。如圖5-b所示，經(jīng)過氫氧化鈉、乙醇復(fù)合溶劑預(yù)處理后，葵花稈結(jié)構(gòu)被破壞，表面出現(xiàn)不規(guī)則的裂痕和孔洞、褶皺，大量木質(zhì)素被降解，木質(zhì)素與半纖維素之間的空間立體交聯(lián)結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)部纖維素骨架顯現(xiàn)，暴露出更多纖維素[25]，比表面積增大，纖維素酶與纖維素的接觸面增加，增大了酶解制糖的產(chǎn)率。

2.3不同預(yù)處理方法對葵花稈酶解制糖的影響

以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6），回歸方程為y=0.229 2x+0.009 6，線性回歸系[CM（25]數(shù)為r2=0.999[KG*3]01。通過測定分析得出，本試驗所用的纖維素濾紙酶活力為546 U/g。

以未處理的葵花稈、經(jīng)過2% NaOH預(yù)處理的葵花稈、70%乙醇預(yù)處理的葵花稈、2% NaOH和70%乙醇協(xié)同預(yù)處理的的葵花稈為原料進(jìn)行酶解試驗。由圖7可知，所有曲線都呈上升趨勢，并且上升速率越來越小。未經(jīng)過預(yù)處理的葵花稈相關(guān)曲線上升幅度和速率都最小，可能是由于木質(zhì)素的阻擋，酶與纖維素接觸受阻，酶解率也低。對于單溶劑來說，利用2% NaOH處理的葵花稈，其葡萄糖產(chǎn)率比70%乙醇處理的葵花稈稍高一些，這是由于2% NaOH預(yù)處理葵花稈時，其木質(zhì)素脫除率略高于70%乙醇溶劑。用2% NaOH、70%乙醇共同預(yù)處理葵花稈，其葡萄糖產(chǎn)率明顯比單一溶劑預(yù)處理的效果好，這是由于用混合溶劑預(yù)處理葵花稈時，木質(zhì)素的脫除率最高。

[FK（W13][TPHBB7.tif][FK）]

3結(jié)論

本研究表明，2% NaOH、70%乙醇復(fù)合溶劑預(yù)處理葵花稈時，木質(zhì)素去除率顯著高于2%氫氧化鈉或70%乙醇溶劑單獨處理；通過正交試驗優(yōu)化后的最佳預(yù)處理條件是：加熱溫度170 ℃，時間1 h，2% NaOH溶液、70%乙醇體積比為2 ∶[KG-*3]1，固液比為1 ∶[KG-*3]25（g ∶[KG-*3]mL），該條件下木質(zhì)素去除率為 53.75%；葵花稈預(yù)處理后，其木質(zhì)素去除率越高，酶解后葡萄糖的產(chǎn)率越高。

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