培養(yǎng)條件對(duì)三七愈傷組織生長(zhǎng)和皂苷積累的影響

摘要： 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，改變激素配比、氮源和光照等因素，以分光光度法和HPLC法分析三七愈傷組織培養(yǎng)過(guò)程中皂苷含量的變化。結(jié)果表明：培養(yǎng)條件對(duì)三七愈傷組織中皂苷積累有一定影響，激素配比對(duì)愈傷組織中皂苷含量的影響最大，在0.5 mg·L1 2，4D+1.0 mg·L1 6BA 組合下，培養(yǎng)物中總皂苷含量最多，達(dá)到4.72%±0.29%；在總氮量為60 mmol·L1條件下，45 mmol·L1 KNO3+7.5 mmol·L1 NH4NO3（NO3-/NH4+=7∶1）時(shí)，愈傷組織皂苷含量最多，達(dá)到4.71% ± 0.17%；分別在1 000 lx和500 lx光強(qiáng)下每天光照12 h的愈傷組織，皂苷含量均低于黑暗培養(yǎng)的愈傷組織，三者皂苷含量分別為1.94% ± 0.31%、2.38% ± 0.12%和3.57% ± 0.27%，光照引起愈傷組織表面變綠及細(xì)胞分化，可能是抑制愈傷組織中皂苷合成與積累的主要原因；HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，三七愈傷組織和根中均含有Rg1、Re、Rb1及Rd四種皂苷，但栽培三七根含有R1皂苷，而三七愈傷組織中未檢測(cè)到R1，其原因需要進(jìn)一步研究。該研究結(jié)果為未來(lái)愈傷組織培養(yǎng)成為部分代替人工栽培生產(chǎn)三七天然產(chǎn)物的潛在途徑提供了研究基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 激素配比， 三七， 愈傷組織， 皂苷， 組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： Q945文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）08103508

Abstract： It is well known that the growth and secondary metabolites accumulation of plant cells cultured in vitro are determined by many factors， such as culture conditions， nutrients supply， phytohormone application， etc. This study aims to explore the affecting factors during Panax notoginseng callus culture. On the basis of MS， modulations of phytohormone combination， nitrogen resource and illumination strength were carried out， and then the changes in saponins content during culture of P. notoginseng callus were measured and analyzed with spectrophotometry and HPLC. The results showed that the culture conditions had an considerable effect on the saponin accumulation in Panax notoginseng callus， in detail， combination of phytohormone had significant effects on saponin content with a peak of 4.72% ± 0.29% from the callus cultured on MS supplemented with 0.5 mg·L1 2，4D+1.0 mg·L1 6BA； The total N source concentration was maintained at 60 mmol·L1， the saponin accumulated at the highest level of 4.71% ± 0.17% in the callus under the ratio of NO3-/NH4+=7∶1 （45 mmol·L1 KNO3+7.5 mmol·L1 NH4NO3）； When cultures grown in the light （1 000 lx and 500 lx for 12 h·d1， respectively） versus dark， their saponin content were calculated as 1.94% ± 0.31%， 2.38% ± 0.12% and 3.57% ± 0.27%， respectively. In addition， greening and cell differentiation were observed on the surface of callus under light， might be the main cause resulting in the inhibition of saponins synthesis and accumulation in callus. Saponins of P. notoginseng have been acknowledged to be the major compounds functioning in medical treatment of diseases， herein they are employed as the indicator of callus evaluation. Four kinds of saponins including Rg1， Re， Rb1 and Rd were identified from both the P. notoginseng callus and root by HPLC， and R1 could not be detected in the former， however， presence in the latter， the reason for which needs to be further investigated. The above results are likely to provide technical support for the production of natural compounds through callus culture in large scale instead of field cultivation partly in the future， furthermore， which would also be a potential alternative to wild medicinal plant resources for its merits of sustainable and rational exploitation.

Key words： ratio of phytohormones， Panax notoginseng， callus， saponins， tissue culture

三七（Panax notoginseng）系五加科人參屬植物，在我國(guó)已有400多年的栽培歷史，是傳統(tǒng)名貴中藥材（Liu et al，2011；Guo et al，2010）。三七的藥理作用主要體現(xiàn)在對(duì)血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)等的影響（Zhang et al，2013；Lei Chiou，1986；Yu et al，2012）。三七的主要藥理活性成分為三七總皂苷，具有降血脂、清除自由基、抗炎、抗氧化等藥理作用（Kim，2012；Konoshima et al，1999；Liu et al，1994）。三七藥材市場(chǎng)供應(yīng)主要靠人工栽培，從種子萌發(fā)到收獲入藥周期需3～5 a，時(shí)間和勞動(dòng)力成本高，生長(zhǎng)期間還需使用大量農(nóng)藥防治病蟲(chóng)害而污染環(huán)境，且由于環(huán)境污染等原因?qū)е氯咚幉闹兄亟饘贇埩?。因此，采用生物工程技術(shù)規(guī)?；囵B(yǎng)三七愈傷組織，以提取其天然產(chǎn)物代替或部分代替人工栽培三七，將是未來(lái)解決三七藥材存在問(wèn)題的潛在技術(shù)（李云芳等，2014）。與傳統(tǒng)栽培相比，利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)三七的替代品可以不受土地、環(huán)境、氣候等因素影響，且產(chǎn)品質(zhì)量均一，具有很大的優(yōu)勢(shì)（田蕾等，2015）。然而，利用細(xì)胞培養(yǎng)也存在一些生物學(xué)問(wèn)題需要解決，如目的化合物含量低、在未分化細(xì)胞中檢測(cè)不到目的產(chǎn)物等，培養(yǎng)效率低、成本高，限制了該技術(shù)的商業(yè)化應(yīng)用（Zhang et al，2013）。近年來(lái)，通過(guò)添加誘導(dǎo)子、改變培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式等手段可調(diào)控藥用植物細(xì)胞中次生代謝產(chǎn)物的途徑，通過(guò)優(yōu)化和改進(jìn)藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可促進(jìn)細(xì)胞離體培養(yǎng)過(guò)程中次生代謝產(chǎn)物的生物合成，如人參、紅豆杉、雷公藤等（Oh et al，2014；Cusido et al，2014；Miao et al，2013）。

目前，對(duì)于三七細(xì)胞培養(yǎng)中皂苷積累規(guī)律的研究較少，而愈傷組織培養(yǎng)是進(jìn)行細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)的前提。本研究對(duì)影響愈傷組織中皂苷積累的因素進(jìn)行了研究，獲得的數(shù)據(jù)為后續(xù)建立細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)體系提供了參考，為三七細(xì)胞工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1 植物材料

以大連工業(yè)大學(xué)珍稀瀕危藥用植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室用云南文山三七種子制備的無(wú)菌苗為外植體，誘導(dǎo)出愈傷組織、繼代培養(yǎng)；挑選質(zhì)地均一、生長(zhǎng)快、顏色鮮黃的三七愈傷組織，具體操作參考Zhang et al（2014）的方法進(jìn)行。對(duì)照材料取自云南文山栽培3 a的三七根，干燥、粉碎，備用。

1.2 方法

1.2.1 激素配制MS+30 g·L1蔗糖+6 g·L1瓊脂粉，pH值5.8，培養(yǎng)基中需要添加的激素組合與配比按照表1進(jìn)行配制。愈傷組織在（25 ± 1） ℃下暗培養(yǎng)3個(gè)月后進(jìn)行皂苷含量的測(cè)定與分析，并與人工栽培三七根進(jìn)行比較。

1.2.2 NO3-/NH4+影響皂苷含量的試驗(yàn)基本配方為MS+2.0 mg·L1 2，4D+0.5 mg·L1 6BA+30 g·L1蔗糖+6 g·L1瓊脂粉（不含MS基本培養(yǎng)基中的N源），pH5.8；氮源總量為60 mmol·L1，培養(yǎng)基中需要添加的NO3-/NH4+按照表2進(jìn)行配制。將愈傷組織在（25 ± 1） ℃下暗培養(yǎng)3個(gè)月后進(jìn)行皂苷含量的測(cè)定和分析，并與對(duì)照材料進(jìn)行比較。

1.2.3 光照處理方法培養(yǎng)基配方為MS+2.0 mg·L1 2，4D+0.5 mg·L1 6BA+30 g·L1蔗糖+6 g·L1瓊脂粉，pH 5.8。挑選生長(zhǎng)均一的三七愈傷組織分為三組，每組60瓶，分別置于1 000、500及0 lx（黑暗）光強(qiáng)下培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h·d1， 在（25±1）℃下培養(yǎng)3個(gè)月后進(jìn)行皂苷含量的測(cè)定與分析，并與三七對(duì)照材料進(jìn)行比較。

1.2.4 總皂苷提取與分光光度法分析標(biāo)準(zhǔn)曲線制作參考Zhang et al（2014）的方法。準(zhǔn)確稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品5 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇定容；吸取10、20、40、60、80和100 μL標(biāo)準(zhǔn)液分別置于10 mL具塞試管中，水浴揮干溶劑；各自加入0.2 mL新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸于60 ℃水浴恒溫15 min，立即置于冰水中冷卻5 min，加入冰醋酸5 mL搖勻，放置10 min，迅速在545 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品Re質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品總皂苷提?。簩⒂鷤M織在60 ℃下烘干至恒重，研碎后過(guò)65目篩，準(zhǔn)確稱取1 g于燒杯中，加入50 mL甲醇，室溫下放置過(guò)夜，然后置于80 ℃水浴上保溫2 h，冷卻至室溫，然后用容量瓶定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 SymbolmA@m尼龍濾膜過(guò)濾，收取濾液，備用。

取100 μL樣品總皂苷提取液分別置于具塞試管中，其余操作與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作一致。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行，取平均值，根據(jù)回歸方程計(jì)算總皂苷的含量。

1.2.5 三七總皂苷的HPLC分析使用LC2000液相色譜儀，LC2130紫外可見(jiàn)檢測(cè)器及T2100P色譜工作站對(duì)總皂苷進(jìn)行檢測(cè)分析。色譜條件：Kromasil 1005C18色譜柱（250 mm × 4.6 mm）。流動(dòng)相∶乙腈（A）∶水（B）；0～20 min，20% A等度；20～30 min，20% A～32% A線性梯度；30～40 min，32% A～43% A線性梯度；40～70 min，43% A～100% A線性

2結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以試劑空白作參比于545 nm處測(cè)定不同濃度Re溶液的吸光度，以對(duì)照品質(zhì)量（mg）為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=8.96X-0.013 6，R2=0.999 3。

為了評(píng)價(jià)愈傷組織中皂苷水平，按照1.2.4方法，同時(shí)測(cè)定了栽培三七根中總皂苷含量。生長(zhǎng)3年的三七根（0.6 g）總皂苷提取液的OD值為0.743，根據(jù)回歸方程可得其總皂苷含量為7.04%±0.13%，在后續(xù)研究中均以此值為參考，與愈傷組織皂苷含量進(jìn)行比較分析。

2.2 激素配比對(duì)愈傷組織中皂苷積累的影響

植物激素是植物組織培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝的常用手段（Collin，2001；Dicosmo Misawa，1995）。本研究發(fā)現(xiàn)激素配比對(duì)三七愈傷組織的生長(zhǎng)和皂苷含量有很大影響，當(dāng)培養(yǎng)基中激素組合為0.5 mg·L1 2，4D+1.0 mg·L1 6BA 時(shí)，愈傷組織中皂苷含量最高，達(dá)到4.72%±0.29%；當(dāng)激素組合為2.0 mg·L1 2，4D+2.0 mg·L1 6BA 時(shí)，愈傷組織中皂苷含量最少（圖1）。從愈傷組織在各種激素組合下生長(zhǎng)25 d時(shí)的狀態(tài)（圖2）可以看出，當(dāng)激素組合為2.0 mg·L1 2，4D+2.0 mg·L1 6BA時(shí)，愈傷組織體積最大，表明其生長(zhǎng)最快，但是皂苷含量最少（圖1：3）；而當(dāng)愈傷組織體積較小，生長(zhǎng)較慢時(shí)，它們的皂苷含量與之相反，都比較高（圖1：2，4，7，8，9）。該研究結(jié)果與李漢偉等（2010）研究冬凌草愈傷組織生長(zhǎng)及迷迭香酸的積累的結(jié)果一致。能促進(jìn)三七愈傷組織生長(zhǎng)的激素組合，反而抑制其次生代謝，說(shuō)明三七細(xì)胞皂苷代謝積累與細(xì)胞生長(zhǎng)階段呈負(fù)相關(guān)性。

2.3 NO3-/NH4+對(duì)三七愈傷組織生長(zhǎng)和皂苷含量的影響

在植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，大量元素對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)和次生代謝的影響非常大，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基中的氮源種類及其濃度，可以改變植物細(xì)胞的生長(zhǎng)和次生代謝物質(zhì)的積累。本研究NO3-/NH4+比例對(duì)三七愈傷組織生長(zhǎng)及皂苷含量的影響，試圖找到改善三七細(xì)胞中皂苷積累的簡(jiǎn)便手段。圖3結(jié)果表明，在總氮量為60 mmol·L1條件下，45 mmol·L1 KNO3+7.5 mmol·L1 NH4NO3（NO3-/NH4+=7∶1）時(shí)培養(yǎng)的愈傷組織中皂苷含量最多，達(dá)到4.71%±0.17%，但低于栽培三七根中皂苷含量；培養(yǎng)基中只加60 mmol·L1 NO3-，不添加NH4+，即NO3-/NH4+ =60∶0，愈傷組織中皂苷含量最少。說(shuō)明培養(yǎng)基中高比例NO3-不利于三七皂苷的積累，適當(dāng)比例的NH4+才有利于皂苷積累。

圖4顯示，培養(yǎng)基中添加不同NO3-/NH4+條件下，三七愈傷組織生長(zhǎng)25 d時(shí)的狀態(tài)。NO3-/NH4+ = 60∶0時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)最快，但皂苷含量卻最少。何雪嬌和賴鐘雄（2012）研究N源對(duì)朱砂根愈傷組織生長(zhǎng)及次生代謝的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)NO3-有利于愈傷組織生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基中NO3-濃度越高，愈傷組織的增殖系數(shù)增大，對(duì)次生代謝抑制作用越強(qiáng)。本研究結(jié)果也證明NO3-和NH4+通過(guò)促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)的途徑調(diào)節(jié)次生代謝作用，且這種促進(jìn)以減少次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)為代價(jià)（Collin，2001）。

2.4 光照對(duì)三七愈傷組織中皂苷積累的影響

將長(zhǎng)勢(shì)均一的三七愈傷組織分組后置于不同光強(qiáng)下培養(yǎng)，25 d后觀察愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)和測(cè)定皂苷含量（圖5、圖6）。圖5顯示，0（黑暗）、500和1 000 lx三種光強(qiáng)下三七愈傷組織中皂苷含量分別為3.57% ± 0.27%，2.38% ± 0.12%和1.94% ± 0.31%，表明無(wú)論500或1 000 lx 光照均對(duì)皂苷積累有一定的抑制作用。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在光下培養(yǎng)后發(fā)生分化，表面變綠，甚至長(zhǎng)出幼芽（圖6）。文濤等（2007）發(fā)現(xiàn)弱光有利于虎杖愈傷組織中白藜蘆醇積累；李琰等（2010）發(fā)現(xiàn)光照不僅影響雷公藤愈傷組織的生長(zhǎng)，且對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇及總生物堿的合成具有很強(qiáng)的抑制作用。關(guān)于光照對(duì)植物次生代謝的影響也有相反的報(bào)道，如連續(xù)光照可以明顯增強(qiáng)黃芩毛狀根中糖苷?qǐng)D

元、黃酮和黃芩素等次生代謝物質(zhì)積累水平（Marsh et al，2014）。

從本研究和前人研究中可以發(fā)現(xiàn)，光照對(duì)不同植物細(xì)胞次生代謝的影響是有差異的，這可能與次生代謝的復(fù)雜性有重大關(guān)系，因?yàn)橹参锛?xì)胞次生代謝與物種基因型、細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和發(fā)育階段、環(huán)境條件等因素有很大聯(lián)系（何雪嬌和賴鐘雄，2012）。在離體培養(yǎng)條件下， 細(xì)胞、 組織和器官等不同水平培養(yǎng)物中次生代謝活躍程度不同，對(duì)環(huán)境因素如光照等反應(yīng)也有差異。這些結(jié)果對(duì)于今后以組織培養(yǎng)技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)天然產(chǎn)物，特別是在培養(yǎng)參數(shù)設(shè)置和生物反應(yīng)器設(shè)計(jì)等方面具有重要參考意義。

2.5 三七愈傷組織中皂苷HPLC分析

為了研究三七愈傷組織中皂苷變化，本研究將圖

愈傷組織和人工栽培3年生的三七根中皂苷進(jìn)行了HPLC分析（圖7）。圖7：a是標(biāo)準(zhǔn)品R1、Rg1、Re、Rb1及Rd的保留時(shí)間圖譜，圖7：b和圖7：c分別是栽培三七根和三七愈傷組織（MS+0.5 mg·L1 2，4D+1.0 mg·L1 6BA）皂苷HPLC分析圖譜。

通過(guò)保留時(shí)間和峰面積分析，栽培三七根中包含Rg1、Rb1、Rd、R1及Re五種皂苷，它們含量從高到低順序是Rg1>Rb1>Rd>R1>Re，且Rg1和Rb1含量明顯高于其它三種皂苷含量（圖7：b）。許重陽(yáng)等（2008）在研究三七根莖、主根和支根三個(gè)部位中皂苷成分時(shí)發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1的含量最高，其中三七皂苷R1是三七特有的特征皂苷，各皂苷含量Rg1>Rb1>R1，這與本文結(jié)果一致。

離體培養(yǎng)的三七愈傷組織中僅含有Rg1、Re、Rb1及Rd四種皂苷，其含量從高到低為Rg1>Rb1>Rd>Re（圖7：c）。三七不同部位的皂苷種類不同，如三七絨根含人參皂苷Rg1、Rb1、Rh1和三七皂苷R1，三七蘆頭主要含人參皂苷Rg1和Rb1，三七葉、花、果中皂苷含量較少，種類也少（鮑建才等，2006）。

與栽培三七根中皂苷分布相比，愈傷組織中缺少三七皂苷R1，可能是R1含量太少而無(wú)法檢出，也可能是三七愈傷組織在培養(yǎng)過(guò)程中R1合成水平低，也可能是在離體條件下皂苷之間互相轉(zhuǎn)化的結(jié)果。目前，對(duì)于三七愈傷組織中皂苷種類及含量的研究較少，無(wú)法確定三七愈傷組織較栽培三七根中缺少三七特征皂苷R1的具體原因。

3結(jié)論

激素配比對(duì)三七愈傷組織中皂苷含量的影響最大，含有0.5 mg·L1 2，4D+1.0 mg·L1 6BA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)的愈傷組織中皂苷含量最多，達(dá)到4.72%±0.29%。在總氮量為60 mmol·L1時(shí)，NO3-/NH4+=7∶1條件下培養(yǎng)的愈傷組織中皂苷含量最多，達(dá)到4.71%±0.17%；黑暗培養(yǎng)有利于三七愈傷組織中皂苷積累，光照具有一定的抑制作用，這可能是與光照促進(jìn)愈傷組織分化有關(guān)。與人工栽培三七根中皂苷相比，愈傷組織中含有Rg1、Rb1、Rd和Re四種皂苷，R1未檢出，可能是含量低、生物合成能力差和皂苷之間轉(zhuǎn)化等原因造成的。

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