大葉落地生根類糖原合成激酶KdSK基因的克隆與表達分析

摘要： 類糖原合成酶激酶（SKs）屬于絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，在植物器官發(fā)育、激素信號傳導過程中十分重要，并參與生物脅迫、非生物脅迫的應答過程。大葉落地生根中的胎生苗發(fā)育過程，同時具備胚胎發(fā)生和器官發(fā)生的特征，是研究無性生殖的理想模型。為了更好地理解大葉落地生根中胎生苗發(fā)育的分子機制，該研究利用RACEPCR技術，從大葉落地生根中克隆了1個新的基因KdSK。該基因具有423個氨基酸殘基，分子量為47.79 kD，等電點為8.37，其開放閱讀框長為1 272 bp。其蛋白與黃瓜的同源性最高，屬于植物類GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ類，與苜蓿（MSK4）蛋白在進化關系上最近，且與擬南芥（AtSK41、AtKSK42）聚為一枝。保守域結構分析表明，KdSK蛋白具有明顯的蛋白激酶的結構域，包括蛋白激酶的ATP結構域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化結構域。實時熒光定量PCR分析表明，該蛋白基因在大葉落地生根的根中表達量最高，且受滲透脅迫（甘露醇）的誘導上調(diào)表達。該研究首次從大葉落地生根中克隆出KdSK基因，該研究結果為進一步研究該基因的功能打下了基礎。

關鍵詞： 大葉落地生根， 類糖原合成酶激酶， 基因克隆， 序列分析， 基因表達

中圖分類號： Q943.2文獻標識碼： A文章編號： 10003142（2017）08102510

（ 1. Shenzhen Risheng Landscape Co. Ltd.， Shenzhen 518040， Guangdong， China； 2. Shenzhen Tourism College， Jinan University，

Shenzhen 518053， Guangdong， China； 3. Turfgrass Research Institute， Beijing Forestry University， Beijing 1000083， China；

4. College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangdong

Engineering Research Center of Grassland Science， Guangzhou 510642， China ）

Abstract： Shaggylike protein kinase（SKs） plays numerous roles during the plant development， such as organ development， phytohormone conduction， abiotic stress and biotic stress. Kalanchoe daigremontiana is an attractive model system for the study of the molecular mechanisms of somatic embryogenesis and organogenesis competence because of its ability to form embryos and to acquire organogenic competence through plantlets. To better understand the molecular mechanisms of plantlet formation involved in K. daigremontiana， a shaggylike protein kinase， KdSK， was identified using rapid amplification of cDNA end （RACE） PCR. KdSK gene consists of an ORF of 1 272 bp that was predicted to encode a 483 amino acid residuelong protein of 47.79 kD with an isoelectric point of 8.37. The sequence analysis of the KdSK revealed homology to Cucumis sativus shaggyrelated protein kinase kappa. Phylogenetic analysis showed that KdSK gene was closely related to Medicage sativa protein（MSK4） and formed a subgroup with Arabidopsis thaliana（AtSK41， AtKSK42）， all clustered to Clade Ⅳof GSK3/shaggy kinases family. Conservation domain structure analysis indicated that KdSK protein had typical structure of the protein kinase domain， including ATP domain and Serine/Threonine protein kinases activesite signature. Realtime PCR analysis revealed that KdSK transcript was expressed the highest in root and upregulated under osmotic stress. This study characterized the novel KdSK gene from Kalanchoe daigremontiana for the first time and the results will be useful for further functional determination of the gene.

Key words： Kalanchoe daigremontiana， shaggylike kinase， gene clone， sequence analysis， gene expression

植物中的類糖原合成酶激酶（Shaggylike kinase，SK）是果蠅（Drosophila melanogaster） shaggy（SGG）基因和哺乳動物中糖原合成酶激酶（GlycogenSynthase Kinase3，GSK3）的同源物，同屬于絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶。在模式植物擬南芥中，AtSK基因家族中的10個家族成員，被分為四類。AtSK11、AtSK12、AtSK13屬于I類；AtSK21、AtSK22、AtSK23屬于Ⅱ類；AtSK31、AtSK32屬于Ⅲ類，AtSK41、AtSK42屬于Ⅳ類 （Yoo et al， 2006）。此外，從其他植物中也相繼克隆出SK基因（Qi et al， 2013； Tichtinsky et al，1998）。果蠅中，SGG基因參與無翅性狀的信號傳導（Bourouis et al， 1990； Siegfried et al， 1990），控制著正常的細胞分裂以及胚胎發(fā)育過程中細胞分化方向（Nusse，1999； Skaer，1998）。與SGG類似，植物中的SK基因在器官發(fā)育、信號傳導、傷害應答等方面都有非常重要的作用，而且不同種類的SK基因功能也不同（MillsLujan et al， 2015）。AtSK11、AtSK12可以調(diào)節(jié)花在不同階段的發(fā)育模式，反義表達AtSK11、AtSK12特異片段的轉基因植物，花被數(shù)增加，且雌蕊群的發(fā)育也發(fā)生改變（Dornelas et al， 2000）。AtSK32突變體表現(xiàn)出更小的花梗、花萼和花瓣，花器官中細胞較小，細胞壁擴展酶-三木葡聚糖轉錄水平降低，表明AtSK32參與細胞伸長，在花發(fā)育調(diào)控中有重要作用（Claisse et al， 2007）。

BZR1/BES1是油菜素內(nèi)酯（BRs）反應中的正調(diào)控因子，在BRs途徑中誘導BZR1/BES1的脫磷酸作用和積累。AtSK21在BRs反應中是一個負調(diào)控因子，AtSK21磷酸化BZR1/BES1使其降解，從而抑制下游的信號傳導反應（He et al， 2002）。過表達AtSK22的植株，能誘導鹽脅迫反應基因AtCBL1和AtCP1的表達和花色素苷積累，進而改變細胞內(nèi)的陽離子濃度，增強擬南芥耐鹽和耐干旱能力（Piao et al， 2001）。小立碗蘚中的5個PpSKs，對脫水、PEG、山梨醇都有響應（Richard et al， 2005）。高鹽脅迫下，紫花苜蓿中Msk4激酶被快速誘導，過表達該基因能改善對鹽脅迫的耐受力（Kempa et al， 2007）。

植物中的SK基因在器官發(fā)育和逆境脅迫中的重要作用已有報道，但大葉落地生根作為一種常見的園藝植物，人們對其獨特的繁殖模式機制卻知之甚少，大葉落地生根通過胎生苗進行繁殖，胎生苗的發(fā)生過程同時具有胚胎發(fā)生和器官發(fā)生的特征，被認為是研究無性生殖的理想模型。為了探究大葉落地生根的無性生殖模型，利用抑制消減雜交技術（SSH）構建了大葉落地生根胎生苗和普通葉片的SSHcDNA文庫，并從該文庫中篩選出一條與SK基因片段同源的表達序列標簽（EST）（Zhong et al， 2013； Rensing， 2016）。本研究以該EST片段為基礎，采用RACEPCR技術克隆出大葉落地生根SK的cDNA基因全長（命名為KdSK），利用生物信息學方法分析KdSK基因的序列、蛋白結構、系統(tǒng)發(fā)育，并研究該基因在大葉落地生根不同組織和滲透脅迫誘導下的表達變化，為該基因的進一步研究利用打下了基礎。

1材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)

大葉落地生根（Kalanchoe daigremontiana）種植于北京林業(yè)大學草坪研究所溫室中，培養(yǎng)基質(zhì)為腐葉土、蛭石和珍珠巖按4∶2∶1混合，在16 h光照/8 h黑暗、光照強度25 μmol·m2·s1、溫度 （30±3） ℃下培養(yǎng)。采集葉片后快速在液氮中固定，置于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.2 總RNA的提取及反轉錄

使用TaKaRa MiniBEST universal RNA Extraction Kit （Code No. 9769）提取落地生根葉片的總RNA，并在-80 ℃下保存。

1.3 KdSK基因的克隆和測序

根據(jù)差減文庫的測序結果，分別設計上游引物F1： 5′GGGGGAGCAGGCAGTTCTAGGA3′和下游引物R1： 5′ACTTATTTGGTAAAGCAAGCCG3′。以總RNA為模板，按照PrimeScript TM Ⅱ High Fidelity RTPCR Kit（Takara Code No.RO23A）的操作說明合成第一鏈cDNA，使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）進行PCR擴增。PCR反應體系為50 μL，包括1 μL cDNA模板，1 μL Tks Gflex DNA Polymerase（1.25 u·μL1），F(xiàn)1 Primer （20 μmol·L1） 1 μL，R1 Primer （20 μmol·L1）） 1 μL，2 × Gflex Buffer （mg 2+，dNTP plus） 25 μL，dH2O 21 μL。反應程序為98 ℃變性 10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃ 延伸1 min，共30個循環(huán)。以上述PCR產(chǎn)物為模板，進行二次PCR，反應體系及條件同上。取5 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收，用R1為特異引物對回收后的DNA測序。

根據(jù)獲得的KdSK基因cDNA片段序列設計5′RACE Outer PCR特異引物R01： 5′ TGATATCCCGGTGGCATATACC3′和Inner PCR R02： 5′ ATTTCGCTTGGACAACAACACC3′。使用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit （Clontech Cat. No. 634923）反轉錄總RNA合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）進行PCR擴增。Outer PCR反應完成后，立即取反應液1 μL進行Inner PCR反應。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 3.0 （Code No. 9762）回收。接著用TaKaRa DNA Ligation Kit Ver. 2.1 （Code No.6022）中的連接酶，將PCR產(chǎn)物與TVector pMDTM 18 （Code No.3271）進行連接，熱轉化至大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞JM109 （Code No. 9052）中，涂布平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選陽性菌落，提取質(zhì)粒，用引物M1347引物對進行測序。

根據(jù)獲得的KdSK基因cDNA片段序列設計3′RACE Outer PCR特異引物F01：5′ GGGCATGTCATAAGAACTACAA3′和Inner PCR特異引物F02：5′ TAAGCGTTACAAAAACCGAGAG 3′。以1 μL的RNA為模板，使用3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase （Code No. 6106）反轉錄合成cDNA。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No. R060A）進行PCR反應。兩輪PCR反應完成后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)膠回收和連接克隆，用M1347引物對質(zhì)粒進行測序分析。具體步驟同5′RACE。

對KdSK基因的cDNA片段的5′端和3′序列進行拼接，獲得KdSK基因的全長序列。并分別設計上游引物YZF1： 5′TGGACAAAAGTGCGCACTCCT3′；YZF2： 5′GGTGACCAGCGGCGACTTAA3′。下游引物 YZR1： 5′TGAAAGTCAGAGTGGCATCTCT3′。以驗證試驗中使用的cDNA為模板，進行兩輪PCR反應。第一輪PCR反應使用引物YZF1和YZR1。第二輪PCR反應使用YZF2和YZR1。使用Takara Tks Gflex DNA polymerase （Code No.R060A）進行PCR擴增。取5 μL PCR產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳。用YZF2、YZR1引物進行測序分析。

1.4 KdSK基因的生物信息學分析

應用NCBI數(shù)據(jù)庫中ORF Finder軟件尋找KdSK序列中的ORF，推導編碼的氨基酸序列。應用Expasy的ScanProstie、ProtParam、TMpred、Protscale程序分析KdSK蛋白的保守結構域、分子量和等電點、跨膜結構域和親疏水性（Gasteiger et al，2005）。用BLAST程序檢索相似蛋白，利用ClustalX 2.1 軟件對不同物種的氨基酸序列進行多重比對（Larkin et al， 2007）；利用MEGA 6.0分析氨基酸序列，用鄰接法構建進化樹，并用bootstrap校正（Tamura et al， 2007）；根據(jù)NPS@ web server網(wǎng)站中的PHD方法預測蛋白的二級結構（Combet et al， 2000）。應用在線分析工具Phyre分析SAHH蛋白三級結構（Kelley Sternberg， 2009）。

1.5 KdSK表達的熒光定量分析

以大葉落地生根actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)KdSK的序列信息設計熒光定量的上游引物F1：5′TACAAAAACCGAGAGCTACAGA3′，下游引物R1：5′CAAAGGAATTCGTTGATGGA3′。以大葉落地生根中的根、莖、葉、葉柄為總RNA材料分析KdSK基因在不同組織中的表達情況。對大葉落地生根幼苗進行滲透脅迫處理（300 mmol·L1甘露醇），分別在處理的0、3、6、9、12、24 h采集葉位相同的葉片，每個處理設3個重復，3個重復混合取樣，提取總RNA分析KdSK基因在滲透脅迫下的表達情況。按照Ist Strand cDNA Synthesis Kit （Takara）試劑盒操作說明合成cDNA，根據(jù)SYBR FAST qPCR Kit Master Mix （2×） Universal （KAPA Biosystems）試劑盒進行PCR擴增。熒光定量反應體系為SYBR FAST qPCR Kit Master Mix（2×） Universal 5 μL，上下游引物（10 μmol·L1） 各0.2 μL，cDNA 1 μL，ROX校正染料 0.2 μL，dH2O 3.4 μL，共10 μL。反應在ABI7900HT實時定量PCR儀上進行，反應條件為95 ℃預變性 5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s。采用2-ΔΔCT法分析結果。

2結果與分析

2.1 KdSK cDNA克隆與測序

以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，并用引物F1和R1進行PCR擴增，獲得約1 000 bp的目的片段（圖1：A）。根據(jù)獲得的SK基因cDNA片段序列分別設計3′RACE和5′ RACE特異引物，獲得約1 200 bp和500 bp的目的片段（圖1：B， 圖1：C）。將獲得的cDNA片段的5′端和3′端序列進行拼接，以大葉落地生根葉片第一鏈cDNA為模板，設計驗證引物，獲得約1 800 bp的目的片段（圖1：D）。因此，大葉落地生根SK基因的cDNA全長為1 712 bp （GenBank登錄號：KU740358），命名為KdSK，含有1 272 bp完整開放閱讀框（ORF），編碼 423個氨基酸（圖2），不包括PolyA尾的長度為1 700 bp，5′UTR（非編碼區(qū)）238 bp，3′UTR 190 bp。

2.2 KdSK序列分析及系統(tǒng)進化樹的構建

KdSK與黃瓜（XP_004147888.1）、胡楊（XP_011028359.1）、木本棉（KHF99017.1）、荷花（XP_010245513.1）、菠菜（KNA20150.1）的相似性分別為90%、89%、88%、87%、86%。通過ScanProsite在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有明顯的蛋白激酶的結構域（82～366），其中包括蛋白激酶ATP結構域（88～112）和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活化結構域（203～215）。

通過SIB中的Motif Scan，預測得到一些不同的基序，包括2個Nglycosylation site （239～242、313～316）、7個Casein kinase II phosphorylation site （23～26、49～52、144～147、262～265、287～290、303～306、356～359）、5個MYRISTYL Nmyristoylation site （7～12、20～25、58～63、70～75、270～275）、5個Protein kinase C phosphorylation site （3～5、11～13、146～148、229～231、373～375）、1個Tyrosine kinase phosphorylation site（112～119）、1個Protein tyrosine kinase（82～141）。

SK序列進行了氨基酸序列比對。從圖3可以看出，不同植物SK氨基酸序列在幾個重要功能位點的序列保守性程序很高，如蛋白激酶ATP結合區(qū)域、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點。為了明確大葉落地生根KdSK與其他植物中蛋白激酶的進化關系，選取了6種植物中的26條SK蛋白序列進行分析。

利用Mega 6.0中的相鄰連接法構建系統(tǒng)進化樹（圖4），采用默認參數(shù)，自檢舉1 000次，對生成的系統(tǒng)樹進行Bootstrap校正。結果表明，這26條SK蛋白分為2個大枝，其中KdSK屬于第一大枝，隸屬于第二分枝。與擬南芥（AtSK31、AtSK32）、煙草（NSK111、NSK6、NSK91）、矮牽牛（PSK6、SPSK6、PSK7、PSK4）、小立碗蘚（PpSK5、PpSK1、PpSK2）的親緣關系都較遠，而與苜蓿（MSK4）蛋白在進化關系最近，并且與擬南芥（AtSK41、AtSK42）屬于同一大枝。由此推測，KdSK可能參與到滲透脅迫途徑。

2.3 KdSK的理化性質(zhì)及三級結構預測

KdSK蛋白的理論分子量為47.79 kD，理論等電點為8.37。脂溶指數(shù)為85.04，總平均親水性（GRAVY）為-0.303，不穩(wěn)定系數(shù)為34.09，表明該蛋白是一個穩(wěn)定的蛋白。二級結構預測結果（圖5）表明，KdSK含有30.97%的α螺旋，21.75%的β折疊和47.28%的隨機卷曲，沒有信號肽及其剪切位點，是水溶性的非分泌型蛋白，有3個明顯的跨膜區(qū)（表1），被定位于細胞核中（預測精度為83%）。

通過Phyre在線預測網(wǎng)站預測的三維結構表明，KdSK蛋白分為2個部分，其中一個部分主要由α螺旋構成，另外兩個部分由α螺旋和β折疊共同構成。一共有10個α螺旋和8個β折疊（圖6：A）。KdSK蛋白中的259個氨基酸（占總氨基酸序列的61%），完全比對到G蛋白偶聯(lián)受體激酶（GRK5）的A鏈上（圖6：B）。

2.4 KdSK的組織表達分析

利用熒光實時定量PCR對KdSK在大葉落地生根中的表達情況進行檢測，結果如圖7所示，KdSK在根中表達量最高。表達量由高到低依次為根>莖>葉>葉柄。這些結果表明，KdSK在各組織中均有表達，但不具有組織特異性，主要在大葉落地生根的根部行使功能。

2.5 KdSK的誘導表達分析

用300 mmol·L1甘露醇對大葉落地生根進行滲透脅迫，以實時熒光定量PCR法分析其表達動態(tài)。圖8結果顯示，KdSK在甘露醇處理下存在先下降后上升再次下降而后上升的表達趨勢。在處理 6 h時，KdSK的表達量達到最大值。隨著處理時間的增加，KdSK的表達量出現(xiàn)劇烈變化之后，隨后趨于平衡的狀態(tài)。

3討論

大葉落地生根類糖原合成激酶KdSK基因，通過NCBIBLAST的同源性比對，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列與黃瓜（XP_004147888.1）的相似性最高，該黃瓜序列是AtSK41的同源序列。利用相鄰連接法構建進化樹，可分為2大亞枝，KdSK蛋白屬于第1大亞枝的第二分枝，與MSK4、AtSK41、AtSK42共同構成該分枝。這些結果都說明KdSK屬于植物類GSK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ類。KdSK蛋白與來自擬南芥、小立碗蘚、苜蓿、小麥、煙草、矮牽牛中的同源蛋白進行多序列比對，發(fā)現(xiàn)該蛋白激酶的催化區(qū)序列非常保守，但是N端和C端的序列差異很大，同源性較低，表明不同的SKs可能通過不同的末端序列調(diào)節(jié)不同的生物過程。

KdSK蛋白有一個較小的N端區(qū)域和一個較大的C端區(qū)域，N端區(qū)域由1個α螺旋和6個反平行的β折疊構成，C端區(qū)域主要由α螺旋構成（孫浩等，2009）。ATP（三磷酸腺苷）結合口袋位于N端區(qū)域和C端區(qū)域的結合部，保守的Tyr殘基是該蛋白的關鍵位點，在擬南芥中研究表明，該殘基參與了擬南芥GSKs的磷酸化過程（DE LA Fuente Van Bentem et al， 2008）。在KdSK氨基酸序列中有一個絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶活性位點（位置為203～215），表明KdSK蛋白是一個絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶。GSK3Shaggy激酶是盤基網(wǎng)柄菌建立極性必須的（Harwood et al， 1995），同樣在維持非洲爪蟾胚胎的對稱性中發(fā)揮重要作用（He et al， 1995）。果蠅中胚胎邊界（Siegfried et al， 1992）和神經(jīng)系統(tǒng)（Ruel et al， 1993）的空間結構也需要GSK3Shaggy激酶的參與。這說明KdSK蛋白很有可能參與到大葉落地生根胎生苗發(fā)育過程中的胚胎發(fā)生過程。

在不同組織中KdSK的表達量不同，暗示著KdSK可能參與了植物器官發(fā)育的調(diào)控，其中，在根中表達量最高，這也暗示著它主要在根中行使功能。在脅迫（甘露醇）處理下，KdSK基因在3h出現(xiàn)一個短暫的下降，隨后在6 h表達量達到最高，隨著時間的延長，表達量逐漸下降。Charrier（2002）等的研究表明，擬南芥Shaggylike家族中，AtSK42基因能夠被高鹽和滲透脅迫誘導，AtSK42基因表達量上調(diào)2倍以上，而在黑暗條件下，AtSK42基因表達下調(diào)4倍。KdSK基因?qū)儆谥参镱怗SK3/shaggy蛋白激酶家族的第Ⅳ類，在滲透脅迫（甘露醇處理）下，表達量大量升高，暗示著KdSK基因極有可能參與大葉落地生根抗逆脅迫反應中。本研究對大葉落地生根類糖原合成激酶進行克隆和生物信息學分析，定量分析結果表明，KdSK基因可能參與到滲透脅迫的響應中，關于KdSK是否在大葉落地生根中參與胚胎建成、抗逆脅迫響應途徑還需要進一步的實驗進行驗證。

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