木瓜提取物對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響

吳利春，涂浩，段麗，佘慧宇，張偉，張長城，袁丁，劉朝奇

1.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002

木瓜提取物對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠非酒精性脂肪性肝病的影響

吳利春1，涂浩1，段麗1，佘慧宇2，張偉1，張長城2，袁丁2，劉朝奇1

1.腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002

目的 觀察木瓜提取物對(duì)小鼠非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）的影響，探討其可能的分子機(jī)制。方法 將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組和藥物低（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組。正常組給予普通飼料，其他組給予高糖高脂飼養(yǎng)造模，4周后處死，檢測體質(zhì)量、肝臟質(zhì)量、血清相關(guān)指標(biāo)及肝臟三酰甘油（TG）水平，HE及油紅O染色觀察肝臟組織形態(tài)，RT-PCR和Western blot檢測脂代謝相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠肝臟明顯增大，肝指數(shù)明顯升高（P＜0.01），附睪脂肪指數(shù)明顯升高（P＜0.05）；血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖水平升高（P＜0.05）；肝臟TG水平升高（P＜0.05）；病理結(jié)果顯示，肝臟脂肪變性明顯；RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，模型組肝臟組織SIRT1、FoxO1表達(dá)水平下調(diào)，SERBP-1c表達(dá)水平上調(diào)。與模型組比較，藥物低、高劑量組脂肪肝病理損傷明顯改善，肝指數(shù)、肝臟TG含量均下降，SIRT1和FoxO1表達(dá)水平上調(diào)。結(jié)論 木瓜提取物對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過SIRT1-FoxO1信號(hào)通路發(fā)揮作用。

木瓜提取物；非酒精性脂肪性肝??；脂質(zhì)代謝；SIRT1信號(hào)通路；小鼠

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指無飲酒或每周飲酒低于140 g，由其他各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞脂肪變性，三酰甘油（TG）明顯升高，進(jìn)一步發(fā)展成脂肪性肝炎、肝纖維化甚至肝癌的一組臨床綜合征。隨著我國居民生活水平不斷提高，體力勞動(dòng)減少，NAFLD發(fā)病率逐年上升，大、中城市普通成人的NAFLD發(fā)病率高達(dá)20%[1]，至今尚無有效的干預(yù)措施。因此，急需尋找有效手段防治NAFLD。木瓜是薔薇科植物貼梗海棠近成熟果實(shí)，味酸、性溫、歸肝脾經(jīng)，具有祛濕舒筋、平肝和胃的作用[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，木瓜對(duì)小鼠NAFLD具有良好的干預(yù)作用[3]。為此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)木瓜進(jìn)行提取分離，進(jìn)一步研究該藥物有效成分對(duì)NAFLD的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及飼料

雄性昆明小鼠40只，SPF級(jí)，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)于室溫20～25℃、相對(duì)濕度50%～80%、明暗交替12 h/12 h環(huán)境，自由攝食飲水，每2 d稱重1次。高糖高脂飼料：按照56.5%普通飼料、30%果糖、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉的比例壓制而成。

1.2 藥物及制備

將木瓜塊粉碎成粗粉后按料液比1∶10加入60%乙醇，浸泡2 h，水浴回流提取3次，每次2 h，過濾。合并3次濾液，減壓回收乙醇至無醇味。取木瓜提取液適量，通過大孔樹脂進(jìn)一步分離，應(yīng)用梯度乙醇作為移動(dòng)相，收集相應(yīng)洗脫液，進(jìn)行濃縮、干燥，獲取不同組分木瓜提取物。本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的是在細(xì)胞水平已篩選活性較好的10%乙醇洗脫組分，命名為10%醇木瓜組分，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 主要試劑與儀器

膽固醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連寶生物科技有限公司提供；PCR引物，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；兔單抗β-actin（sc-4778），兔多抗FoxO3a（ab1096290），美國Santa Cruz公司；兔多抗SIRT1（#07-131），Millipore公司；羊抗兔二抗，武漢科瑞有限公司提供；顯影化學(xué)發(fā)光劑ECL，碧云天生物技術(shù)研究所。Powerpas Basic蛋白電泳儀器，美國伯樂公司；梯度PCR儀，德國Applied Biosysterms公司；Gellogic 200凝膠成像分析系統(tǒng)，美國柯達(dá)公司。

1.4 造模

將40只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和藥物低、高劑量組，每組10只。除正常組給予普通飼料外，其余各組均給予高糖高脂飼料造模，藥物低、高劑量組分別給予50、100 mg/kg藥物灌胃，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃。給藥體積0.5 mL/d，連續(xù)4周。

1.5 血清及肝臟生化指標(biāo)測定

小鼠脫頸椎處死，眼球取血，室溫靜置30 min，3000 r/min離心10 min后取血清，按葡萄糖（GLU）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測。稱取100 mg肝臟組織，加入900 μL 95%異丙醇于冰上研磨，室溫靜置2 h，4℃、2000 r/min離心4 min，取上清液，并按試劑盒說明書檢測TG含量。

1.6 肝指數(shù)及附睪脂肪指數(shù)測定

處死小鼠前稱重，處死后完整取下肝臟及附睪脂肪組織，分別稱重，計(jì)算肝指數(shù)（肝臟質(zhì)量÷體質(zhì)量）和附睪脂肪指數(shù)（附睪脂肪質(zhì)量÷體質(zhì)量）。

1.7 肝組織HE和油紅O染色

取10 mm×3 mm新鮮肝臟大葉放入包埋盒中，于10%中性甲醛溶液中固定24 h，用水清洗后經(jīng)梯度乙醇脫水，石蠟包埋切片（厚度4 μm），HE染色，顯微鏡下觀察肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)及病理變化。取新鮮肝臟作冰凍切片，油紅O染色，顯微鏡下觀察肝細(xì)胞脂肪變性情況。

1.8 RT-PCR檢測肝組織mRNA表達(dá)

應(yīng)用試劑盒提取總RNA，測定濃度，通過電泳觀察RNA的完整性。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作獲得cDNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL：10.5μL DEPC水，12.5μL PCR Master mix（2×），加入SIRT1、FoxO1、SREBP、GAPDH引物上下游各0.5μL，最后加入cDNA模板1μL。使用GAPDH作為內(nèi)參。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度平均值，以樣品各基因的灰度值與其內(nèi)參照GAPDH的比值代表其mRNA相對(duì)量。

1.9 Western blot檢測肝組織蛋白表達(dá)

稱取50～100 mg肝臟組織勻漿后，加入蛋白裂解液提取總蛋白。95℃變性5～10 min，SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜，再5%牛奶封閉，4℃一抗孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL顯色。應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行灰度掃描分析，以樣品各基因的灰度值與其內(nèi)參照β-actin的比值代表蛋白相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 木瓜提取物對(duì)模型小鼠相關(guān)指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組肝臟指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)、肝臟TG含量及血清GLU、ALT水平明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，藥物各劑量組均有不同程度改善，其中藥物高劑量組肝臟指數(shù)、附睪脂肪指數(shù)及血清ALT、GLU水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），藥物低劑量組肝臟TG含量明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

表2 各組小鼠相關(guān)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

血清組別 只數(shù) 肝臟指數(shù)/（mg/g） 附睪脂肪指數(shù)/（mg/g）肝臟TG/（mmol/L）ALT/（U/L） GLU/（mmol/L）正常組 10 44.79±5.60 17.84±1.83 12.42±2.33 4.28±0.32 3.85±0.29模型組 10 72.46±7.06** 21.83±2.27* 22.17±3.44* 7.65±0.63* 5.37±0.47*藥物低劑量組 10 69.95±6.74 19.27±2.09 15.17±3.23 7.27±0.58 4.08±0.40#藥物高劑量組 10 62.82±5.85# 16.85±1.65# 7.06±3.68## 5.80±0.54# 3.41±0.33##

2.2 木瓜提取物對(duì)模型小鼠肝組織病理變化的影響

HE染色結(jié)果顯示：正常組肝索圍繞中央靜脈呈放射狀緊密排列，肝細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞排列緊密均一；模型組肝細(xì)胞中含有較大脂滴，細(xì)胞腫大變圓，小葉中央?yún)^(qū)受累更明顯，細(xì)胞排列較紊亂，炎性細(xì)胞浸潤；藥物低、高劑量組較模型組脂滴更小，細(xì)胞排列更為緊密，中央靜脈區(qū)受累情況均有明顯改善。結(jié)果見圖1。

圖1 HE染色各組小鼠肝組織病理形態(tài)（×200）

油紅O染色結(jié)果顯示：正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，中央靜脈周圍的肝索呈放射狀排列，結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞無脂肪變性；模型組有一定程度的肝細(xì)胞腫脹、胞漿淡染，有大量的脂肪空泡形成，肝索結(jié)構(gòu)紊亂；藥物低、高劑量組較模型組肝組織結(jié)構(gòu)基本正常，紅色脂滴明顯減少。結(jié)果見圖2。

圖2 油紅O染色各組小鼠肝組織病理形態(tài)（×200）

2.3 木瓜提取物對(duì)模型小鼠脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，模型組FoxO1和SIRT1表達(dá)較正常組均降低，而SREBP-1c基因表達(dá)升高；與模型組比較，藥物低、高劑量組FoxO1和SIRT1表達(dá)升高，SREBP-1c基因表達(dá)明顯降低。結(jié)果見圖3。

圖3 各組小鼠肝組織脂代謝相關(guān)基因表達(dá)凝膠電泳圖

2.4 木瓜提取物對(duì)模型小鼠肝組織FoxO1和SIRT1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，模型組SIRT1和FoxO1蛋白表達(dá)明顯低于正常組；與模型組比較，藥物低、高劑量組FoxO1和SIRT1蛋白表達(dá)明顯升高。結(jié)果見圖4。

圖4 各組小鼠肝組織FoxO1和SIRT1蛋白表達(dá)免疫印跡電泳圖

3 討論

肝細(xì)胞的糖脂代謝紊亂是發(fā)生NAFLD的重要機(jī)制，SIRT1-FoxO1通路是調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝的重要通路。SIRT1可以通過FoxO1轉(zhuǎn)錄因子的脫乙?；蛊浜宿D(zhuǎn)位，誘導(dǎo)脂肪分解中限速酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，引起其下游的脂肪生成基因的表達(dá)量下調(diào)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化[4]。Deng X等[5]報(bào)道FoxO1可通過調(diào)節(jié)SREBP-1c啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的組裝，尤其是SP1和SREBP-1c的結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，從而可以抑制SREBP-1的表達(dá)，調(diào)控肝細(xì)胞的脂代謝，促進(jìn)脂肪動(dòng)員，降低脂肪沉積。在NAFLD發(fā)生發(fā)展中SIRT1的表達(dá)明顯降低，從而抑制 FoxO1的活性，導(dǎo)致SREBP-1表達(dá)增加，使肝細(xì)胞脂代謝紊亂[6]，據(jù)此推測SIRT1可能是治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，用腺病毒載體過表達(dá)SIRT1，能改善ob/ob小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，而特異敲除小鼠肝細(xì)胞中SIRT1基因，在高糖高脂飲食誘導(dǎo)下可以加速高脂血癥、脂肪肝的發(fā)生[7-8]。本實(shí)驗(yàn)建立的NAFLD模型所致的SIRT1-FoxO1通路變化與文獻(xiàn)結(jié)果相符，提示建立的模型可用于藥物篩選。

本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上應(yīng)用高糖高脂飼料誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型，用10%醇木瓜組分低、高劑量進(jìn)行干預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10%醇木瓜組分可有效干預(yù)NAFLD的脂代謝紊亂，降低TG水平，改善肝臟脂質(zhì)沉積狀況。在誘導(dǎo)的NAFLD模型中，SIRT1及FoxO的表達(dá)明顯下調(diào)，加入不同劑量10%醇木瓜組分干預(yù)后，SIRT1及FoxO的表達(dá)較模型組均有一定程度的上調(diào)，并呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，α-硫辛酸可增強(qiáng)Sirtuin 1去乙酰化酶活性，阻止SREBP-1的入核和FoxO1進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，增加TG脂肪酶的表達(dá)和減少脂肪酸合酶的豐度[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10%醇木瓜組分能有效改善肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，調(diào)節(jié)SIRT1-FoxO1信號(hào)分子，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，提示該藥物可能通過 SIRT1-FoxO1通路，抑制SREBP-1的活性，從而干預(yù)NAFLD的發(fā)生和發(fā)展。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10%醇木瓜組分對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型有較好的干預(yù)作用，為進(jìn)一步開發(fā)治療NAFLD的藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Extracted Active Components of Chaenomeles Speciosa on Non-alcoholic Fatty Liver Disease in Model Mice induced by High-fat–high-fructose Diet

WU Li-chun1,TU Hao1, DUAN Li1,SHE Hui-yu2,ZHANG Wei1,ZHANG Chang-cheng2,YUAN Ding2,LIU Chao-qi1
(1.Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy,Yichang 443002,China;2.Medical College,China Three Gorges University,Yichang 443002,China)

Objective To study the effects of extracted active components of Chaenomeles Speciosa(EACCS)on non-alcoholic fatty liver disease(NAFLD)in mice;To discuss the possible molecular mechanism.Methods Forty male KM mice were randomized into four groups,namely normal group,model group,low-dose(50 mg/kg)EACCS group and high-dose(100 mg/kg)EACCS group.Except that the normal group was daily given routine diet,the other groups were given high-fat–high-fructose diet(HFFD).The mice were put to death 4 weeks later.Body weight,liver weight and serum TG were measured.HE and oil red O staining were used to observe liver tissue morphology. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of lipid metabolism related genes.Results Compared with the normal group,the liver size,liver index(P<0.01)and epididymal fat index(P<0.05)increased significantly; The ALT and GLU in serum increased(P<0.05),TG increased(P<0.05),and pathological findings showed significant steatosis;RT-PCR and Western blot showed that the expression levels of SIRT1 and FoxO1 mRNA decreased and the level of SERBP-1c increased in the model group.Compared with the model group,the hepatic lipid accumulation of EACCS groups was obviously improved,and the serum ALT,GLU,and TG levels significantly decreased,the expression levels of hepatic SIRT1 and FoxO1 mRNA increased.Conclusion EACCS has protective effects on NAFLD mice induced by HFFD,and its mechanism may be related to the activation of SIRT1-FoxO1 signalingpathway in the liver tissues.

Chaenomeles Speciosa extracts;non-alcoholic fatty liver disease;lipid metabolism;SIRT1 signaling pathway;mice

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.012

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0048-04

2016-11-09）

（

2016-12-28；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金(81473461)

劉朝奇，E-mail：ctgulcq@163.com