青翹與老翹功效差異在經(jīng)典方劑中的驗證研究

孫迎娜，岳永花，劉聰，何盼，白關(guān)亞，倪艷

山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012

青翹與老翹功效差異在經(jīng)典方劑中的驗證研究

孫迎娜，岳永花，劉聰，何盼，白關(guān)亞，倪艷

山西省中醫(yī)藥研究院，山西 太原 030012

目的 采用經(jīng)典方劑連翹散和銀翹散驗證青翹和老翹的功效差異，為指導(dǎo)連翹“一體兩用”提供實驗依據(jù)。方法 采用金黃色葡萄球菌制作豚鼠瘡瘍模型，將40只豚鼠隨機分為空白組、模型組、連翹散青翹組和連翹散老翹組，空白組和模型組灌服生理鹽水，連翹散青翹組和連翹散老翹組灌服1.2 g原藥材/kg藥液，連續(xù)7 d，觀察各組模型豚鼠瘡瘍癥狀積分、血常規(guī)及病理變化。采用10%脂多糖霧化吸入法誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型，將40只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、銀翹散青翹組和銀翹散老翹組，空白組和模型組灌服生理鹽水，銀翹散青翹組和銀翹散老翹組灌服4 g原藥材/kg藥液，連續(xù)10 d，觀察各組大鼠肺洗液白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β水平。結(jié)果 連翹散青翹組抑制豚鼠瘡瘍傷口紅腫作用較老翹組起效快，但在抑制豚鼠瘡瘍傷口分泌物和病理改善方面與連翹散老翹組差異無統(tǒng)計學意義。銀翹散青翹組大鼠較老翹組IL-6、TNF-α、IL-1β含量降低，但差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論 不同復(fù)方中青翹與老翹功效有一定差異。

青翹；老翹；連翹散；銀翹散；瘡瘍模型；急性肺損傷模型；功效差異

連翹系木犀科植物連翹 Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果實。根據(jù)采收時間的不同，通常將連翹分為青翹和老翹。青翹為秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干而成；老翹則為果實熟透時采收，曬干，除去雜質(zhì)而成[1]。在現(xiàn)行標準中，已在【檢查】項下“雜質(zhì)”和【浸出物】2項中分別對“青翹”和“老翹”進行了控制，其指標值相差較大[1]。但在連翹藥材流通與臨床實際應(yīng)用中并無“青”與“老”的區(qū)分，二者?；祀s而用，標準與應(yīng)用脫節(jié)。同時，大量文獻表明青翹和老翹在化學成分、藥理作用方面存在一定差異[2-5]?？梢?，青翹與老翹確有功效差異。然而，這些研究只是基于連翹單味進行比較，單味功效差異在復(fù)方配伍應(yīng)用時如何尚需進一步研究。為此，本實驗選擇連翹散和銀翹散2個經(jīng)典方劑進行相應(yīng)藥效指標比較，進一步評價青翹和老翹的功效差異，以期為連翹的臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物

青翹、老翹（山西產(chǎn)），購自亳州成源中藥飲片有限公司，批號20140703，經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院倪艷教授鑒定均為木犀科落葉灌木連翹 Forsythia suspense（Thunb.）Vahl的干燥果實。梔子、甘草、防風、金銀花、桔梗、薄荷、竹葉、甘草、荊芥穗、豆豉、牛蒡子，飲片購自山西省中醫(yī)院中藥房。

1.2 主要試劑與儀器

金黃色葡萄球菌ATCC6538（上海魯微科技有限公司，批號A1008B），營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州微生物試劑有限公司，批號20150425-00），脂多糖（LPS，Solarbio，批號818E035），白細胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β ELISA試劑盒（武漢博士德生物，批號均為EK0393）。SE402F奧豪斯電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司），KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司），培養(yǎng)箱（購自上海魯微科技有限公司），F(xiàn)inesse325石蠟切片機（英國Shandon），SIGMA1-14高速離心機石蠟包埋機（Histocentre 3，英國Shandon），Excelsior全自動組織脫水機（英國Shandon），BX53熒光顯微成像系統(tǒng)（日本Olympus），BS2-Ⅰ電熱三用水箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠），Synergy H1全功能微孔板檢測儀（美國BioTek）。

1.3 動物

雄性健康豚鼠40只，10周齡，體質(zhì)量（300± 20）g，雄性健康SD大鼠40只，12周齡，體質(zhì)量（200±20）g，北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證號SCXK（京）2013-0005。飼養(yǎng)于清潔恒溫環(huán)境，溫度25℃，平均濕度37%，15～20次/h全新風，12 h光照明暗交替，自由攝食飲水。

1.4 供試品制備

1.4.1 連翹散 連翹散青翹供試品制備：分別取青翹、梔子、甘草、防風各30 g，加8倍量水浸泡1 h，煎煮0.5 h，濾出藥液，藥渣再加8倍量水煎煮0.5 h，合并藥液并濃縮，干膏率為19.99%。用蒸餾水溶解配成濃度為0.12 g/mL的受試藥液。連翹散老翹供試品制備：同上取藥制備，將青翹改為老翹，干膏率為21.61%。同上配成濃度為0.12 g/mL的受試藥液。

1.4.2 銀翹散 銀翹散青翹供試品制備：取青翹

60 g、金銀花60 g、桔梗36 g、薄荷36 g、竹葉24 g、甘草30 g、荊芥穗24 g、豆豉30 g、牛蒡子36 g，加8倍量水浸泡 1 h，煎煮0.5 h，濾出藥液，藥渣再加8倍量水煎煮0.5 h，合并藥液并濃縮、干燥，干膏率為19.63%。用蒸餾水溶解配成濃度為0.4 g/mL的受試藥液。銀翹散老翹供試品制備：同上取藥制備，將青翹改為老翹，干膏率為20.40%。同上配成濃度為0.4 g/mL的受試藥液。

2 實驗方法

2.1 豚鼠瘡瘍實驗

2.1.1 造模、分組及給藥 除10只空白組豚鼠外，其余豚鼠均右側(cè)腹部脫毛，麻醉后用刀片在脫毛部位劃一十字切口，于皮下注入9億/L金黃色葡萄球菌溶液0.5 mL，每日1次，連續(xù)3 d，至傷口周圍出現(xiàn)紅、腫、觸痛，可見膿性分泌物為止[6]。取成模豚鼠30只，隨機均分為模型組、連翹散青翹組、連翹散老翹組。連翹散青翹組和連翹散老翹組按10 mL/kg劑量灌服1.2 g原藥材/kg（相當于臨床用藥7.5倍）的藥液，空白組和模型組灌服等量生理鹽水，連續(xù)7 d。給藥過程中，因灌胃誤吸導(dǎo)致4只豚鼠死亡。

2.1.2 檢測指標 每次給藥后1 h，肉眼觀察給藥后瘡瘍皮膚的紅腫、分泌物等反應(yīng)癥狀，參考表1反應(yīng)癥狀和評分標準評分[7]。末次給藥評分結(jié)束后，豚鼠麻醉，心臟取血，置于抗凝管中，檢測血象。解剖實驗動物，剔除肺部有誤吸的豚鼠，分離局部瘡瘍皮膚，10%福爾馬林固定后送病理檢查。病理檢查結(jié)果評分：“-”皮膚各層結(jié)構(gòu)，毛囊、皮脂腺、皮下組織均正常；“+”皮膚各層結(jié)構(gòu)，毛囊、皮脂腺存在，潰瘍周圍有大量肉芽組織和結(jié)締組織形成；“++”皮膚各層結(jié)構(gòu)存在，毛囊、皮脂腺、毛桿數(shù)量輕度減少，潰瘍周圍有少量肉芽組織和輕度炎細胞浸潤；“+++”皮膚正常結(jié)構(gòu)消失，未見毛囊、皮脂腺及毛桿，而潰瘍周圍大量炎細胞浸潤和纖維增生。

表1 瘡瘍皮膚反應(yīng)癥狀和評分標準

2.2 大鼠急性肺損傷實驗

2.2.1 造模、分組及給藥 SD大鼠隨機分為空白組、模型組、銀翹散青翹組、銀翹散老翹組，每組10只。銀翹散青翹組和銀翹散老翹組按10 mL/kg劑量灌服4 g原藥材/kg（相當于臨床用藥的15倍）的相應(yīng)藥液，空白組和模型組灌服等量生理鹽水，連續(xù)10 d。末次給藥后，除空白組外，各組大鼠予20 mL 10%LPS溶液經(jīng)超聲波霧化器霧化30 min[8]。

2.2.2 檢測指標 吸入內(nèi)毒素后4 h，各組大鼠麻醉仰臥固定，于頸正中切開暴露氣管，插入磨圓的注射器針頭，5 mL生理鹽水通過氣管插管慢慢注入氣管內(nèi)，反復(fù)抽吸幾次，將洗液抽出，回收洗液2 mL[9]。將洗液放置1 h后，3000 r/min離心15 min，收集上清液。ELISA試劑盒測定肺洗液中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 連翹散對豚鼠瘡瘍模型皮膚紅腫、分泌物的影響

給藥第3日，與模型組比較，連翹散青翹組豚鼠瘡瘍皮膚紅腫、分泌物評分降低，連翹散老翹組豚鼠瘡瘍皮膚分泌物評分降低（P＜0.05，P＜0.01），而對豚鼠瘡瘍皮膚紅腫抑制作用不明顯；給藥第7日，連翹散青翹組豚鼠瘡瘍皮膚紅腫、分泌物評分降低（P＜0.05），連翹散老翹組豚鼠瘡瘍皮膚紅腫、分泌物評分降低（P＜0.01）。給藥第3日，連翹散青翹組抑制瘡瘍皮膚紅腫和分泌物的作用稍優(yōu)于連翹散老翹組（P＞0.05）；給藥第7日，連翹散老翹組抑制瘡瘍皮膚紅腫和分泌物的作用較連翹散青翹組強（P＞0.05）。見表2。

4.2 連翹散對豚鼠瘡瘍模型血常規(guī)的影響

與空白組比較，模型組白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、粒細胞變化不明顯（P＞0.05）；與模型組比較，給藥組也未見明顯差異（P＞0.05）。見表3。

表2 各組豚鼠皮膚紅腫、分泌物評分比較（±s，分）

表2 各組豚鼠皮膚紅腫、分泌物評分比較（±s，分）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

分泌物第0日 第3日 第7日 第0日 第3日 第7日空白組 9 0 0 0 0 0 0模型組 9 3.5±0.4 2.9±0.4 2.7±0.3 2.6±0.3 2.5±0.3 2.3±0.2連翹散青翹組 9 3.3±0.5 2.4±0.4* 2.2±0.4* 2.4±0.5 1.9±0.3** 1.8±0.4*連翹散老翹組 9 3.4±0.4 2.8±0.4 1.8±0.3** 2.5±0.5 2.1±0.4* 1.5±0.4**紅腫組別 只數(shù)

表3 各組豚鼠血常規(guī)比較（±s，×103/mm3）

表3 各組豚鼠血常規(guī)比較（±s，×103/mm3）

組別 只數(shù) 白細胞 淋巴細胞 中性粒細胞 粒細胞空白組 9 5.71±2.28 1.08±0.46 0.64±0.34 3.99±1.57模型組 9 5.83±0.80 0.77±0.08 0.57±0.08 4.50±0.68連翹散青翹組 9 6.82±3.86 1.03±0.23 0.57±0.23 5.22±3.52連翹散老翹組 9 5.54±1.72 0.81±0.22 0.40±0.10 4.33±1.57

4.3 連翹散對豚鼠瘡瘍模型病理形態(tài)的影響 空白組可見皮膚組織較薄的鱗狀上皮和角化層，皮下組織的毛囊、皮脂腺、毛桿以及皮下肌肉層形態(tài)正常結(jié)構(gòu)清楚；模型組可見表層鱗狀上皮輕度增生，未見毛囊、皮脂腺及毛桿，皮膚正常結(jié)構(gòu)消失，表皮層及真皮層結(jié)締組織形成，炎細胞浸潤；各給藥組可見表皮層下結(jié)締組織形成，真皮層肉芽組織形成及輕度炎細胞浸潤，部分樣本皮脂腺、毛囊、毛桿不同程度損傷、數(shù)量減少，見圖1。每組隨機取5只豚鼠瘡瘍皮膚做病理檢查，與空白組比較，模型組病理變化明顯加重（P＜0.01）；與模型組比較，連翹散青翹組和連翹散老翹組病理變化均明顯改善（P＜0.05，P＜0.01）；與連翹散青翹組比較，連翹散老翹組病理變化改善不明顯，見表4。

4.4 銀翹散對大鼠急性肺損傷模型相關(guān)炎癥因子的影響

與空白組比較，模型組肺洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀翹散青翹組TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），銀翹散老翹組TNF-α、IL-6顯著降低（P＜0.05）；與銀翹散老翹組比較，銀翹散青翹組TNF-α、 IL-6、IL-1β含量略降低（P＞0.05）。見表5。

圖1 各組豚鼠瘡瘍皮膚病理形態(tài)（HE染色，×200）

表4 各組豚鼠瘡瘍皮膚病理變化比較

表5 各組大鼠肺洗液IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠肺洗液IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 只數(shù) TNF-α IL-1β IL-6空白組 10 27.61± 7.07 88.83± 25.87 71.01± 18.92模型組 10 531.47±107.20** 706.97±180.28** 1824.24±232.17**銀翹散青翹組 10 282.82±157.93## 462.03±153.46# 1411.69±194.72#銀翹散老翹組 10 391.93±186.12# 578.83±106.45 1538.03±197.44#

5 討論

連翹性微寒，味苦，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，適用于溫熱、丹毒、斑疹、癰瘍腫毒及過敏性紫癜等。在臨床應(yīng)用中，連翹作為各中藥復(fù)方中的主要組成藥物，一方面多用于外感風熱，并伴有脈浮數(shù)或咽痛等，治以疏風解表、清熱解毒，代表方劑為銀翹散，現(xiàn)代臨床也常將銀翹散用于治療急性上呼吸道感染和肺炎等[10]；另一方面，連翹又為瘡家圣藥，常用于治療熱毒蘊結(jié)所致的各種瘡毒癰腫，代表方劑為連翹散。據(jù)《外科精義》中記載，連翹散“治瘡瘍癤腫，一切惡瘡，疼痛煩渴”。

瘡瘍是臨床常見的外科疾病，發(fā)病迅速，易出現(xiàn)感染，形成瘡瘍。目前常通過動物人工創(chuàng)傷并用金黃色葡萄球菌感染方法制作瘡瘍模型，瘡傷感染后，大量炎細胞浸潤，使血管壁通透性增加，產(chǎn)生紅、腫、熱、痛現(xiàn)象，并有膿性分泌物出現(xiàn)[11]。由豚鼠瘡瘍實驗評分結(jié)果可以看出，在感染金黃色葡萄球菌早期，連翹散青翹組抑制豚鼠瘡瘍傷口紅腫的作用較連翹散老翹組起效快。因此，本課題組推測在連翹散治療瘡瘍疾病早期，選用青翹入藥時其抑制紅腫和分泌物的作用比老翹入藥時起效快，可能與青翹對金黃色葡萄球菌的抗菌作用強有關(guān)，與已有報道一致[4，12]。

急性肺損傷是由多種炎性介質(zhì)及效應(yīng)細胞共同參與，并呈級聯(lián)放大的瀑布樣炎癥繼發(fā)性損傷[13]。細菌內(nèi)毒素可以在機體內(nèi)激活多種炎癥因子，如IL-1、IL-6、IL-8等，使炎癥細胞活化，損傷肺泡上皮細胞及肺毛細血管內(nèi)皮細胞，并引起機體一系列炎癥反應(yīng)[14-15]。本實驗結(jié)果顯示，各給藥組肺洗液中IL-6，TNF-α、IL-1β水平均與模型組有明顯差異，銀翹散治療LPS引起的炎癥反應(yīng)作用明顯；同時發(fā)現(xiàn)銀翹散青翹組降低IL-6、TNF-α、IL-1β水平均優(yōu)于銀翹散老翹組。因此，在銀翹散治療上呼吸道感染等炎癥疾病時，選用青翹入藥治療效果要優(yōu)于老翹。

上述實驗研究初步表明，青翹和老翹存在一定的功效差異。本研究提示青翹抗炎作用優(yōu)于老翹，同時青翹抑制紅腫和分泌物的作用比老翹起效快，但差異無統(tǒng)計學意義，后期課題組結(jié)合目前青翹與老翹單方的大量研究，擬選定大量的含連翹經(jīng)典復(fù)方，通過代謝組學、分子生物學等方法進一步明確青翹和老翹的藥效學差異，以實現(xiàn)臨床使用過程中分而用之的必要性，也要求對青翹和老翹制定行之有效的質(zhì)量標準，以期徹底解決連翹流通、使用等環(huán)節(jié)的混亂局面。

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Validation Study on Efficacy Difference of Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructus in the Classic Formula

SUN Ying-na,YUE Yong-hua,LIU Cong,HE Pan,BAI Guan-ya,Ni Yan
(Shanxi Institute of Traditional Chinese Medicine,Taiyuan 030012,China)

Objective To compare the efficacy difference of Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructusby using Lianqiao powder and Yinqiao powder in the classic formula;To provide experimental evidence for the guidance of“one for dual-use”of the Forsythiae Fructus.Methods The guinea pig sore model was made with Staphylococcus aureus.40 guinea pigs were randomly divided into blank group,model group,Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group.The blank group and the model group were fed with normal saline,while Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group were treated with 1.2 g raw medicine/kg liquid Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus for 7 d.The symptom score,blood and pathological changes of guinea pig soreness were observed.The model of acute lung injury was induced by 10%LPS aerosol inhalation.40 rats were randomly divided into blank group,model group,Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group.The blank group and the model group were fed with normal saline,while Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group were treated with 4 g raw medicine/kg liquid Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus and Yinqiao powder Ripe Forsythiae Fructus for 10 d.The levels of IL-6,TNF-α and IL-1β in the lung lavage fluid were detected.Results The effect of Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus on the wound healing of guinea pig sore wound was faster than that of Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus,but there was no significant difference between Lianqiao powder Green Forsythiae Fructus group and Lianqiao powder Ripe Forsythiae Fructus group in inhibiting the secretion and pathologicalchanges of guinea pig sore wound.The levels of IL-6,TNF-α and IL-1β in Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group was lower than that in Yinqiao powder Green Forsythiae Fructus group,without statistical significance. Conclusion It is verified that there is efficacy differences between Green Forsythiae Fructus and Ripe Forsythiae Fructus in the different Chinese herbal compound.

Green Forsythiae Fructus;Green Forsythiae Fructus;Lianqiao powder;Yinqiao powder;sore model; acute lung injury model;efficacy difference

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.010

R285.5

：A

：1005-5304(2017)05-0039-05

2016-06-12）

（

2016-07-23；編輯：華強）

國家自然科學基金面上項目（81470169）；山西省基礎(chǔ)研究項目（2015021196）

倪艷，E-mail：niyan_01@hotmail.com