逍遙散對肝郁脾虛證大鼠胃組織基因表達(dá)譜的影響

李曉紅 陳家旭 張 煜 臧知明 楊力強

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

逍遙散對肝郁脾虛證大鼠胃組織基因表達(dá)譜的影響

李曉紅1陳家旭2張 煜1臧知明1楊力強1

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：在全基因組水平上系統(tǒng)探討逍遙散大、中、小劑量對慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠胃組織基因表達(dá)譜的影響及其抗應(yīng)激調(diào)節(jié)機制。方法：采用Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片檢測慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠模型(每天束縛3 h，連續(xù)21 d)正常組、模型組、逍遙散組(大、中、小劑量)胃組織基因表達(dá)的差異，篩選出組間兩兩比較的差異基因表達(dá)譜，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對差異基因表達(dá)譜進行GO功能分析、信號通路分析。結(jié)果：模型組、逍遙散大、中、小劑量組具有不同的差異基因表達(dá)譜，多條生物過程和信號通路的功能被顯著上調(diào)或下調(diào)，其中模型組、逍遙散大、中、小劑量組差異基因參與的顯著生物過程分別有597、1216、817、924個功能基因群，參與的顯著信號通路分別有27、60、41、59條。結(jié)論：肝郁脾虛證具有胃組織差異表達(dá)基因組學(xué)背景，逍遙散大、中、小劑量對肝郁脾虛證大鼠胃組織眾多差異表達(dá)基因及功能改變的信號通路、生物過程均有一定的干預(yù)作用，中劑量結(jié)果顯示優(yōu)于大劑量和小劑量。

逍遙散；肝郁脾虛證；胃組織；基因表達(dá)譜

證候生物學(xué)基礎(chǔ)及中藥復(fù)方藥效作用機制的發(fā)現(xiàn)和闡明是中醫(yī)藥現(xiàn)代化和國際化進程中面臨的關(guān)鍵科學(xué)問題。基因芯片具有高通量、大規(guī)模、平行性分析及自動化程度高的特點，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選與檢測分析，因而能整體宏觀地研究生物體基因的表達(dá)及功能。近年來，在中醫(yī)藥研究中基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)證候、體質(zhì)、中藥復(fù)方作用機制、中藥有效成分篩選等領(lǐng)域[1]。肝郁脾虛證是臨床上的常見證型，逍遙散是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典名方。本研究應(yīng)用Agilent大鼠基因表達(dá)譜芯片，觀察了逍遙散大、中、小劑量對慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠外周胃組織差異基因表達(dá)譜的影響?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD雄性大鼠75只，體質(zhì)量(200±20)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心[動物許可證號：SCXK(桂)2009-0002]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機分為正常對照組、模型組、逍遙散大、中、小劑量組，每組15只。光照節(jié)律12L：12D(6：00—18：00)，飼養(yǎng)于普通級動物房，室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃，相對濕度保持為30%，大鼠喂常規(guī)飼料及飲用水。

1.1.2 藥物 實驗所用中藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散，組成藥物購自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，按鄧中甲[2]主編的第七版《方劑學(xué)》教材所載藥物組成比例：柴胡30 g、當(dāng)歸30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、茯苓30 g、炙甘草15 g、煨姜和薄荷少許(本次實驗各用10 g)用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，將模型組和逍遙散大、中、小劑量組大鼠進行捆綁束縛并單籠飼養(yǎng)造模，每日于夜間18:00—6:00點束縛3 h，束縛時間點隨機，連續(xù)21 d。

1.2.2 藥物干預(yù) 正常對照組大鼠群養(yǎng)不予束縛，自由進食、飲水及自主活動。自造模第1天開始，每日在束縛前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據(jù)成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠大劑量用藥量為16.7 g/(kg·d)，中劑量用藥量為8.35 g/(kg·d)，小劑量用藥量為4.175 g/(kg·d)，灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量，正常組、模型組大鼠每日灌服大劑量同等換算量的生理鹽水，造模期間根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.2.3 取材 造模21 d結(jié)束后取材標(biāo)本，各組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射進行深度麻醉(40 mg/kg)，鍘刀斷頭，在超凈臺內(nèi)冰上剖開大鼠腹腔，暴露內(nèi)臟,切取全胃,沿胃小彎側(cè)剪開，用預(yù)冷的0.9%生理鹽水徹底沖洗干凈，切取胃體中部上1/3約0.3 cm×0.5 cm小塊的胃組織置凍存管中迅速放入液氮速凍。取材完畢將標(biāo)本放入-80 ℃冰箱保存用于基因芯片實驗。

1.2.4 基因芯片檢測胃組織差異基因表達(dá)譜 每組選取3只大鼠的胃組織標(biāo)本提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000評估RNA的純度和濃度，通過標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評估RNA完整性?？俁NA質(zhì)檢后進行芯片實驗，芯片為Agilent Rat 4×44K Gene Expression Microarrays，RNA樣品標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實驗方案(Agilent Technology)執(zhí)行，由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿苫虮磉_(dá)譜檢測。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對原始數(shù)據(jù)進行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過篩選高質(zhì)量探針進行進一步分析。2個樣品間差異表達(dá)基因通過Fold Change篩選，以Fold change>=2.0標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。使用topGO[3]進行差異基因的GO分析，使用標(biāo)準(zhǔn)的富集計算方法進行Pathway分析，Pathway來源于KEGG數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果

2.1 芯片散點圖 見圖1。

圖1 組間兩兩比較的樣本標(biāo)準(zhǔn)化后的散點分布圖

注：圖1a～圖1d為組間兩兩比較的樣本標(biāo)準(zhǔn)化后的散點分布圖，橫縱坐標(biāo)代表樣本，每個點代表基因表達(dá)情況，點在上面斜線以上為上調(diào)大于2倍的基因，代表縱坐標(biāo)的樣本相對高表達(dá)，點在斜線以下為下調(diào)大于2倍的基因，代表橫縱標(biāo)的樣本相對高表達(dá)，點離斜線越遠(yuǎn)說明信號值越高，點在上下斜線中間的為無差異變化。

圖2 逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調(diào)和下調(diào)基因交集結(jié)果圖

圖3 逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調(diào)和下調(diào)的生物過程交集結(jié)果圖

表1 逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后模型組功能沒有逆轉(zhuǎn)的信號通路名稱

2.2 差異表達(dá)基因 1)模型組與正常組比較差異表達(dá)基因(簡稱模型組差異基因)：與正常組比較，模型組篩選出1 484個差異基因，其中512個上調(diào)基因，972個下調(diào)基因。2)逍遙散組與模型組比較差異表達(dá)基因(簡稱逍遙散組差異基因)：逍遙散大劑量組與模型組比較篩選出2 244個差異基因，其中1 238個上調(diào)基因，1 006個下調(diào)基因；逍遙散中劑量組與模型組比較篩選出1 059個差異基因，其中711個上調(diào)基因，348個下調(diào)基因；逍遙散小劑量組與模型組比較篩選出1 525個差異基因，其中967個上調(diào)基因，558個下調(diào)基因。3)逍遙散組差異基因與模型組差異基因交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的2 244、1 059、1 525個差異基因分別與模型組1 484個差異基因進行交集，結(jié)果分別有258(上調(diào)224個，下調(diào)34個)、36(上調(diào)22個，下調(diào)14個)、148(上調(diào)116個，下調(diào)32個)個共同差異基因仍為上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，從共同差異基因數(shù)目看逍遙散大劑量和小劑量沒有逆轉(zhuǎn)模型組差異表達(dá)的基因數(shù)目遠(yuǎn)多于中劑量。圖2a～圖2f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調(diào)和下調(diào)基因交集結(jié)果。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果 1)模型組差異基因參與的顯著生物過程涉及597個功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過程有147條，主要集中在表皮細(xì)胞分化、肽交聯(lián)、角質(zhì)化、蛋白水解、脂溶性維生素代謝過程等方面；功能下調(diào)的生物過程有450條，主要集中在突觸傳遞、多細(xì)胞生物信號、神經(jīng)沖動的傳遞、細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生、神經(jīng)肽信號通路等方面。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及1 216個功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過程有733條，主要集中在生物黏附、對傷害的反應(yīng)、組織發(fā)育、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、免疫系統(tǒng)過程等方面；功能下調(diào)的生物過程有483條，主要集中在系統(tǒng)過程、多細(xì)胞生物過程、神經(jīng)系統(tǒng)過程、感覺知覺、細(xì)胞表面受體信號通路等方面；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及817個功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過程有550條，主要集中在有絲分裂、細(xì)胞周期過程、細(xì)胞組分組織或生物發(fā)生、核分裂、染色體分離等方面；功能下調(diào)的生物過程有267條，主要集中在正調(diào)節(jié)分泌、細(xì)胞分泌、正調(diào)節(jié)運輸、蛋白質(zhì)分泌、生物過程的正調(diào)節(jié)等方面；逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著生物過程涉及924個功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過程有668條，主要集中在發(fā)育過程、組織發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)育、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、多細(xì)胞生物體發(fā)育等方面；功能下調(diào)的生物過程有256條，主要集中在肌器官形態(tài)發(fā)生、心血管系統(tǒng)發(fā)育、有機陰離子轉(zhuǎn)運、平滑肌細(xì)胞分化、多細(xì)胞生物過程等方面。

3)逍遙散組生物過程與模型組生物過程交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的1 216、817、924條生物過程分別與模型組597條生物過程進行交集，結(jié)果分別有209(上調(diào)88條、下調(diào)121條，其中32條為雙向調(diào)節(jié)通路)、100(上調(diào)29條、下調(diào)71條，其中19條為雙向調(diào)節(jié)通路)、103(上調(diào)65條、下調(diào)38條，其中24條為雙向調(diào)節(jié)通路)條相同生物過程的功能仍為上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，從交集部分相同的生物過程看逍遙散大劑量組沒有逆轉(zhuǎn)模型組功能改變的生物過程遠(yuǎn)多于中劑量和小劑量。圖3a～圖3f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調(diào)和下調(diào)的生物過程交集結(jié)果。

2.4 差異基因信號通路(Pathway)結(jié)果 1)模型組差異基因參與的顯著通路共有27條，其中上調(diào)通路11條，主要表現(xiàn)在視黃醇代謝、細(xì)胞色素P450對外源性物質(zhì)的代謝、藥物代謝、甘油代謝、谷胱甘肽代謝等通路功能的改變；下調(diào)通路16條，主要表現(xiàn)在胰腺分泌、葉酸生物合成、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、蛋白質(zhì)消化和吸收、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等通路功能的改變。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著通路共有60條，其中上調(diào)通路48條，主要表現(xiàn)在阿米巴病、蛋白質(zhì)消化和吸收、吞噬體、細(xì)胞黏附分子、ECM-受體相互作用等通路功能的改變；下調(diào)通路12條，主要表現(xiàn)在神經(jīng)活性配體-受體相互作用、嗅覺轉(zhuǎn)導(dǎo)、Jak-STAT信號通路、青春晚期糖尿病、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等通路功能的改變；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著通路共有41條，其中上調(diào)通路30條，主要表現(xiàn)在孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟、吞噬體、肥厚性心肌病、細(xì)胞周期、胰腺分泌等通路功能的改變；下調(diào)通路11條，主要表現(xiàn)在丁酸代謝、多巴胺能神經(jīng)突觸、晝夜周期、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、朊病毒病等通路功能的改變；逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著通路共有59條，其中上調(diào)通路46條，主要表現(xiàn)在移植物抗宿主病、同種異體移植物排斥、I型糖尿病、細(xì)胞黏附分子、自身免疫性甲狀腺疾病等通路功能的改變；下調(diào)通路13條，主要表現(xiàn)在Jak-STAT信號通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、碳水化合物消化吸收、PI3K-Akt信號通路、乙型肝炎等通路功能的改變。

3)逍遙散組信號通路與模型組信號通路交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的60、41、59條顯著通路分別與模型組27條顯著通路進行交集，結(jié)果分別有8(其中2條為雙向調(diào)節(jié)通路)、1(為雙向調(diào)節(jié)通路)、7(其中1條為雙向調(diào)節(jié)通路)條共同通路的功能仍為激活或抑制，從交集部分相同的信號通路看逍遙散中劑量組逆轉(zhuǎn)了模型組功能改變的所有顯著信號通路。由于篇幅原因，交集圖省略，表1列出逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后模型組功能沒有逆轉(zhuǎn)的信號通路名稱。

3 討論

中醫(yī)學(xué)把認(rèn)識疾病的焦點放在了整體功能上，中醫(yī)的證涉及西醫(yī)多個系統(tǒng)、多個層面。肝郁脾虛證患者的臨床表現(xiàn)除有精神情志異常外，常伴有納呆、噯氣、腹痛、腹脹、腹瀉等消化系統(tǒng)癥狀，學(xué)者們從腦腸軸學(xué)說和腦腸理論解釋這一病理機制，認(rèn)為這一病理機制與腦-腸軸學(xué)說和腦腸互動理論是異曲同工[4]。以往的研究表明抑郁癥、功能性消化不良(FD)、腸易激綜合征(IBS)的中醫(yī)辨證分型均以肝郁脾虛為主[5-7]，研究也認(rèn)為抑郁癥是腦區(qū)神經(jīng)回路的異常，認(rèn)為腦與外周存在強調(diào)的雙向性相互作用[8]，通過功能性磁共振成像技術(shù)(fMRI)也發(fā)現(xiàn),IBS患者大腦皮質(zhì)的活動性與內(nèi)臟感覺及IBS癥狀呈現(xiàn)同步改變的現(xiàn)象[9]，課題組前期的研究也顯示肝郁脾虛證大鼠存在腦腸互動功能障礙[10]。逍遙散最早記載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、甘草、生姜、薄荷8味藥物組成，大量實驗和臨床研究報道[11-13]顯示逍遙散對肝郁脾虛證有很好療效，廣泛應(yīng)用于精神科和神經(jīng)科疾病如抑郁癥、焦慮癥以及多種胃腸道疾病如功能性消化不良(FD)、腸易激綜合征(IBS)、術(shù)后胃腸功能紊亂等的治療中[14-16]。

本研究應(yīng)用Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片篩選了慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證模型大鼠及逍遙散大、中、小劑量干預(yù)大鼠胃組織差異基因表達(dá)譜，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對差異基因表達(dá)譜進行了GO功能分析和信號通路分析。從研究結(jié)果看出21 d慢性應(yīng)激復(fù)制出的肝郁脾虛證大鼠具有胃組織差異表達(dá)基因組學(xué)背景，模型組大鼠胃組織差異基因表達(dá)譜涉1 484個差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因參與了597條生物過程和27條信號通路的功能顯著改變，涉及如表皮細(xì)胞分化、蛋白水解、脂溶性維生素代謝過程、突觸傳遞、多細(xì)胞生物信號以及視黃醇代謝、甘油代謝、谷胱甘肽代謝、胰腺分泌、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等等多方面的變化。對于模型組大鼠出現(xiàn)的這些變化逍遙散大、中、小劑量均有一定的干預(yù)效果，顯示出整體雙向調(diào)節(jié)作用。逍遙散組大鼠與模型組大鼠的差異基因、生物過程、信號通路交集結(jié)果顯示，模型組大鼠1 484個差異表達(dá)基因、597條功能顯著改變的生物過程、27條功能顯著改變的信號通路經(jīng)過逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后，分別只有258、36、148個差異基因表達(dá)水平?jīng)]有接近正常組大鼠仍出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，177、81、79條(除外雙向調(diào)節(jié)的生物過程)顯著生物過程的功能仍為上調(diào)或下調(diào)狀態(tài)，6、0、6條(除外雙向調(diào)節(jié)的信號通路)通路的功能仍處于激活或抑制狀態(tài)，差異基因逆轉(zhuǎn)效果分別為82.6%、97.5%、90%，生物過程逆轉(zhuǎn)效果分別為70.3%、86.4%、86.7%，信號通路逆轉(zhuǎn)效果分別為77.7%、100%、77.7%，從差異基因、生物過程、信號通路逆轉(zhuǎn)的百分比綜合來看，中劑量的整體干預(yù)效果還是優(yōu)于大劑量和小劑量。當(dāng)然，研究結(jié)果也顯示逍遙散大、中、小劑量除了逆轉(zhuǎn)了模型組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)的上述變化外，逍遙散組大鼠差異表達(dá)基因還參與了眾多不同于模型組大鼠的顯著生物過程和顯著信號通路的功能改變，并且大、中、小劑量最顯著的干預(yù)效果表現(xiàn)在不同方面。

本次研究結(jié)果也顯示模型組大鼠眾多功能改變的顯著信號通路和生物過程不僅涉及代謝方面的變化，也涉及了神經(jīng)系統(tǒng)的改變，如神經(jīng)突觸傳遞、神經(jīng)沖動的傳遞、神經(jīng)肽信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路等等，這不僅對以往的研究結(jié)果進行了驗證，也為今后從腦腸軸研究肝郁脾虛證的生物學(xué)機制提供了提供了參考及思路。

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(2017-02-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強)

Effects of Xiaoyao Powder on stomach gene expression profile of rats with liver-depression and spleen deficiency

Li Xiaohong1，Chen Jiaxu2, Zhang Yu1，Zang Zhiming1,Yang Liqiang1

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530200,China; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To systematically investigate the different effects of large, medium and small dose of Xiaoyao Powder on gene expression profile in stomach tissue of rats with the syndrome of liver-depression and spleen-deficiency induced by chronic immobilization stress and to study the anti-stress regulatory mechanism of the three different doses at the whole genome. Methods:The rat whole genome expression chips (Agilent) were used to detect the differences of gene expression in the Stomach of the rat model with the syndrome of liver-depression and spleen-deficiency induced by 21-day chronic immobilization stress(3 hours per day) in normal group, model group and Xiaoyao Powder groups (large, medium and small dose,respectively), and any differential gene expression profiles between groups were recognized and selected. Then the differential gene expression profiles were analyzed through gene ontology and signal pathway using bioinformatics. Results:The differential gene expression profiles of model group and Xiaoyao Powder groups (large, medium and small dose) were different. The functions of multiple biological processes and signaling pathways were significantly up-regulated or down-regulated. The significantly-changed biological processes participated by differential gene of the model group and the Xiaoyao Powder groups(Large, medium and small dose) had 597，1216，817，924 function gene groups respectively, and signal pathways had 27，60，41，59 respectively. Conclusion:The syndrome of liver-depression and spleen-deficiency has the background of differentially expressed genomics in stomach. The large, medium and small dose of Xiaoyao Powder all have certain intervention effects on multiple stomach differentially expressed genes, the signal pathways and the biological processes whose functions are both changed. The result shows the medium dose of Xiaoyao Powder is better than the large and small dose.

Xiaoyao powder; Syndrome of liver depression and spleen deficiency; Stomach tissue; Gene expression profile

國家自然科學(xué)基金項目(編號：81360526；81560750)；廣西自然科學(xué)基金項目(編號：2013GXNSFAA019129)；廣西特色實驗動物病證模型重點實驗室建設(shè)項目(編號：桂教科研[2014]14)

李曉紅，醫(yī)學(xué)博士，副教授，從事中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究，Tel：(0771)4733794，E-mail:lsyuan2008@126.com

楊力強，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事方證研究，Tel：(0771)4733794,E-mail:ylq6606@163.com

R289.3；R277.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.005