逍遙散對(duì)肝郁脾虛證模型大鼠海馬TPH2與IDO1的調(diào)節(jié)作用

焦海燕 嚴(yán)志祎 馬慶宇 周 巖 李曉娟 潘秋霞 王亭曄 劉玥蕓 陳家旭

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

逍遙散對(duì)肝郁脾虛證模型大鼠海馬TPH2與IDO1的調(diào)節(jié)作用

焦海燕 嚴(yán)志祎 馬慶宇 周 巖 李曉娟 潘秋霞 王亭曄 劉玥蕓 陳家旭

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京，100029)

目的：觀察肝郁脾虛證模型大鼠海馬色氨酸羥化酶2(TPH2)與吲哚胺-2,3-雙加氧酶1(IDO1)表達(dá)的變化并探討逍遙散的調(diào)節(jié)作用。方法：雄性SD大鼠隨機(jī)分成4組，分別是正常組、模型組、逍遙散組、氟西汀組，每組6只。采用慢性束縛應(yīng)激的方法制備大鼠肝郁脾虛證模型，造模持續(xù)21 d。通過(guò)熒光定量PCR與Western-blot方法檢測(cè)各組大鼠海馬TPH2與IDO1的表達(dá)情況。結(jié)果：模型組大鼠海馬TPH2 mRNA的表達(dá)水平低于其余3組大鼠(P<0.05)，逍遙散與氟西汀對(duì)TPH2 mRNA的表達(dá)有一定的上調(diào)作用；模型組大鼠海馬IDO1 mRNA的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，逍遙散與氟西汀對(duì)IDO1 mRNA表達(dá)的下調(diào)作用明顯(P<0.01)，且逍遙散對(duì)IDO1 mRNA的下調(diào)作用更明顯。模型組、逍遙散組、氟西汀組大鼠海馬TPH2的蛋白的表達(dá)低于正常組(P<0.01)，逍遙散組TPH2蛋白表達(dá)高于模型組(P<0.05)；模型組大鼠海馬IDO1的蛋白表達(dá)顯著高于其余3組(P<0.01)。結(jié)論：肝郁脾虛證模型大鼠海馬TPH2的表達(dá)減少，IDO1的表達(dá)增多，逍遙散可能通過(guò)調(diào)節(jié)海馬TPH2與IDO1的表達(dá)水平進(jìn)而影響5-HT的含量，起到治療作用。

肝郁脾虛證；逍遙散；TPH2；IDO1

肝主疏泄、調(diào)暢氣機(jī)，肝臟是人體應(yīng)激機(jī)制的調(diào)節(jié)中心[5]，許多實(shí)驗(yàn)也證明了肝臟疏泄功能對(duì)于機(jī)體應(yīng)激調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用，與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)密切相關(guān)[6]，海馬是與情感、情緒密切相關(guān)的重要腦區(qū)，富含各種神經(jīng)遞質(zhì)及受體，對(duì)應(yīng)激最為敏感，且是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，慢性應(yīng)激可引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的變化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢性束縛應(yīng)激的方法復(fù)制大鼠21 d肝郁脾虛證模型[7]，觀察模型大鼠海馬中TPH2與IDO1表達(dá)的改變，同時(shí)以疏肝健脾的經(jīng)典復(fù)方逍遙散為治療藥物[8]，研究肝郁脾虛證發(fā)生的生物學(xué)機(jī)制，為逍遙散治療肝郁脾虛證的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以此探討逍遙散與肝郁脾虛證的方證關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，清潔級(jí)，共24只。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(Beijing)2012-0001。全部大鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心三級(jí)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室溫度為(22±2)℃，濕度60%±5%，正常光照晝夜節(jié)律，維持安靜環(huán)境。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)中所用方劑選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散(北柴胡30 g、當(dāng)歸30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、茯苓15 g、炙甘草15 g、生姜10 g、薄荷10 g)。由北京同仁堂(毫州)飲片有限責(zé)任公司提供，根據(jù)《北京市中藥炮制規(guī)范》，按原書(shū)配伍比例由中日友好醫(yī)院中藥制劑室煎煮、濃縮制成藥粉備用，1 g藥粉含生藥量3.18 g，使用時(shí)用去離子水溶解配制成混懸液。實(shí)驗(yàn)中使用的鹽酸氟西汀膠囊，Patheon France，由禮來(lái)蘇州制藥有限公司分包裝，20 mg/粒。

1.1.3 試劑與儀器 TRZOL Reagent(Sigma)，DEPC(Sigma)，氯仿(國(guó)產(chǎn)分析純)，異丙醇(國(guó)產(chǎn)分析純)，RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒(Thermo Scientific)，2×SYBR Green Mix(Biomiga)，手持電動(dòng)勻漿器(KONTES，ΜSA)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD)，BCA蛋白定量試劑盒，RIPA裂解液(Biomiga)，過(guò)硫酸銨(Sigma)，30%丙烯酰胺，10×TBST(Solarbio)，PBS鹽酸緩沖液，5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，10×電轉(zhuǎn)液，4×SDS-PAGE分離膠緩沖液，4×SDS-PAGE濃縮膠緩沖液(Solarbio)，甲醇(北京化工廠)，TEMED(北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司)，Anti-Indoleamine2,3-dioxygenase抗體(ab106134)，Anti-TPH2抗體(ab121013)，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(中杉金橋)，β-actin(Thermo Scientific)，超敏化學(xué)發(fā)光液(Thermo Scientific)，Tanon-5200分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，PVDF膜(0.45 μm，Thermo Scientific)，電泳儀(BIO-RAD)，全波長(zhǎng)掃描酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組 24只SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為：正常組、模型組、逍遙散組、氟西汀組，采用大鼠束縛架(自制)制備慢性束縛應(yīng)激的方法大鼠21 d肝郁脾虛證模型，大鼠束縛架為木質(zhì)結(jié)構(gòu)，底座寬10 cm、長(zhǎng)20 cm、厚1 cm。上面束縛臺(tái)長(zhǎng)22 cm，寬6.6 cm，前端有小架可固定大鼠頭部，束縛臺(tái)兩側(cè)分別為兩條可調(diào)節(jié)的粘貼軟帶，用于束縛大鼠的胸部和腹部。

心臟彩超為無(wú)創(chuàng)傷性，不會(huì)損傷患者，同時(shí)可將心臟舒張和收縮功能直觀體現(xiàn)，患者的心腔結(jié)構(gòu)、心臟搏動(dòng)和血流動(dòng)力學(xué)變化會(huì)動(dòng)態(tài)顯示，與心功能分級(jí)結(jié)合后可對(duì)病情的判定奠定基礎(chǔ)，從而使診斷準(zhǔn)確率顯著提升。此次數(shù)據(jù)中，研究組患者LVM、LIMI、LVESD、LVEDD、LAD顯著高于參照組LVEF、LVFS和E/Ea低于參照組，組間數(shù)據(jù)比對(duì)判定有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明左心衰竭會(huì)將心肌損害和重構(gòu)程度加重，從而損害心功能。

實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組大鼠不加任何實(shí)驗(yàn)條件常規(guī)飼養(yǎng)，其余3組大鼠每天束縛3 h。在束縛前1 h，正常組和模型組大鼠灌服去離子水，逍遙散組灌服逍遙散混懸液，按人體用藥量換算成大鼠等效劑量，給藥量為0.61 g/100 g體質(zhì)量(相當(dāng)于生藥量1.927 g/100 g)，氟西汀組灌服氟西汀溶液，給藥量為0.2 mg/100 g體質(zhì)量，大鼠的灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量。造模持續(xù)21 d。

1.2.2 取材 造模結(jié)束后進(jìn)行取材，采用2%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉大鼠(40 mg/kg)，冰上取出腦組織，分離海馬，然后一半置于有RNA保存液的凍存管中4 ℃儲(chǔ)存，另一半放入普通凍存管中后置于液氮中，待取材全部結(jié)束后將裝有海馬的RNA保存液的凍存管放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.3.1 下丘腦總RNA的提取 將每個(gè)海馬組織加入500 μL預(yù)冷Trizol的離心管中快速研磨，室溫放置5 min；以每1 mL Trizol加入0.2 mL的比例加入氯仿，蓋緊離心管，劇烈搖蕩離心管15 s，然后室溫靜置3 min，后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，樣品分為三層，取上層水相于另一干凈離心管中，按之前每1 mLTrizol液加入0.5 mL異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10 min，然后4 ℃，12 000 r/min離心10 min；棄去上清液，按每1 mLTrizol加入1 mL的比例加入75%乙醇，混勻后4 ℃，7 500 r/min離心5 min；小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5～10 min，后將RNA溶于無(wú)RNA酶水中，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 總RNA的質(zhì)量和濃度檢測(cè) 取出1 μLRNA樣品稀釋50倍，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度。根據(jù)A260的值計(jì)算RNA濃度(單位：μg/μL)，并根據(jù)A260/A280比值計(jì)算純度，要求為1.8～2.0，比值低于1.5或高于2.2者棄去。

1.2.3.3 合成第一鏈cDNA 按RevertAidTM第一鏈cDNA Synthesis試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，20 μL反應(yīng)體系，在置于冰上的無(wú)菌無(wú)核酸酶的PCR管中，按照順序加入總RNA、隨機(jī)六聚體引物1 μL，然后補(bǔ)充無(wú)核酸酶的高純水至12 μL；短暫離心后，65 ℃孵育5 min，冰上冷卻，離心，再置于冰上冷卻；按照順序加入4 μL 5X Reaction Buffer、1 μL RiboLockTMRNA酶抑制劑(20 μ/μL)、2 μL 10 mM dNTP Mix、1 μL RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 μ/μL)，共20 μL；輕輕混勻，離心，25 ℃孵育5 min，隨后42 ℃孵育60 min；70 ℃加熱5 min終止反應(yīng)，-80 ℃保存。

1.2.3.4 PCR實(shí)驗(yàn)引物 本實(shí)驗(yàn)采用由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

TPH2 REVERSE(TTGGAAGGTGGTGATTAGGC)，F(xiàn)ORWARD(CCATCGGAGAATTGAAGCAT);IDO1 REVERSE(GCTTCCCATTCTCAATCAGC)，F(xiàn)ORWARD(GGGCTTTGCTCTACCACATC);GAPDH REVERSE(TGGTCCAGGGTTTCTTACT)，F(xiàn)ORWARD(CCATTCTTCCACCTTTGAT)。

1.2.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)體系(50 μL)，2×SYBR Mixture(With Rox)25 μL，F(xiàn)orward Primer 10 μM，F(xiàn)orward Primer 10 μM，cDNA樣品2 μL(1～10 ng)，補(bǔ)充至50 μL。

在熒光定量PCR儀上設(shè)置運(yùn)行參數(shù)(預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸，60 ℃ 1 min，溶解曲線分析65 ℃至95 ℃，每5 s增長(zhǎng)0.5 ℃)，然后進(jìn)行兩步法PCR反應(yīng)。

1.2.4 Western-blot

1.2.4.1 蛋白提取和蛋白含量測(cè)定 每20 mg海馬組織加入100 μLRIPA裂解液，用手動(dòng)勻漿器勻漿，然后冰上放置30 min，后4 ℃，12 000 r/min離心15 min；所得上清液即為總蛋白，轉(zhuǎn)存于-20 ℃冰箱備用。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定總蛋白含量，用酶標(biāo)儀于562 nm處測(cè)定吸光度，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出蛋白濃度。

1.2.4.2 實(shí)驗(yàn)步驟 1)配置10%分離膠與5%濃縮膠，然后蛋白上樣，體積為20 μL，上樣量為50 μg；2)電泳：先以80V電泳30 min，然后120V電泳1 h；3)轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜采用200 ma，1.5 h，選用PVDF膜；4)封閉：用膜封閉液將轉(zhuǎn)好的PVDF膜室溫?fù)u床封閉2 h；5)孵育一抗：用膜封閉液稀釋一抗(TPH2為1∶500，IDO1為1∶50，β-Actin為1∶3 000)，膜置于雜交袋中4 ℃孵育過(guò)夜；6)孵育二抗：第二天將雜交袋取出放置至室溫，后TBST搖床水洗3×10 min，然后雜交袋搖床孵育二抗1 h，然后TBST搖床水洗3×10 min；7)顯影：將膜正面向下放入配置好的顯影液中2 min，然后通過(guò)Tanon-5200分析儀進(jìn)行曝光拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 21.0軟件，對(duì)數(shù)據(jù)做正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，兩項(xiàng)均符合，采用單因素方差分析(One-Way，ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。若數(shù)據(jù)不正態(tài)或方差不齊，則采用K個(gè)獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)逐項(xiàng)統(tǒng)計(jì)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組海馬TPH2與IDO1基因表達(dá)結(jié)果 采用2-△△Ct相對(duì)定量法計(jì)算各組大鼠基因的相對(duì)擴(kuò)增效率，其公式為：F=2[(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組內(nèi)參基因平均Ct值)-(正常組目的基因平均Ct值-正常組內(nèi)參基因平均Ct值)]，其結(jié)果如下。

與正常組相比，21 d慢性束縛應(yīng)激能夠明顯下調(diào)其余3組大鼠海馬TPH2 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)，并且逍遙散與氟西汀對(duì)TPH2 mRNA的表達(dá)有一定的上調(diào)作用；同樣相比于正常組，造模能夠明顯上調(diào)模型組大鼠海馬IDO1 mRNA的表達(dá)水平(P<0.01)，而逍遙散與氟西汀對(duì)IDO1 mRNA表達(dá)的下調(diào)作用明顯(P<0.01)，且逍遙散對(duì)IDO1 mRNA的下調(diào)作用更明顯。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠TPH2和IDO1 mRNA表達(dá)情況

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

2.2 各組海馬TPH2與IDO1蛋白表達(dá)結(jié)果 采用Tanon Gis軟件對(duì)所得各組WB條帶圖像灰度值進(jìn)行分析，通過(guò)比較各組目標(biāo)條帶灰度值/內(nèi)參灰度值的數(shù)值，得出各檢測(cè)指標(biāo)蛋白表達(dá)的相對(duì)含量值，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠TPH2和IDO1 mRNA表達(dá)比較

圖2 各組大鼠TPH2和IDO1 Western-blot條帶比較

與正常組相比，模型組、逍遙散組、氟西汀組3組大鼠海馬TPH2的蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.01)，并且逍遙散對(duì)TPH2蛋白表達(dá)有一定的上調(diào)作用，這一作用優(yōu)于氟西汀(P<0.05)；同樣的，造模能夠明顯上調(diào)模型組大鼠海馬IDO1的蛋白表達(dá)水平(P<0.01)，并且逍遙散與氟西汀對(duì)IDO1的蛋白表達(dá)有明顯的下調(diào)作用(P<0.01)。見(jiàn)表2、圖3。

表2 各組大鼠TPH2和IDO1蛋白表達(dá)情況(灰度比，

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與逍遙散組比較▲P<0.05，▲▲P<0.01。

圖3 各組大鼠TPH2和IDO1 Western-blot灰度值比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢性束縛應(yīng)激的方法，復(fù)制了21 d肝郁脾虛證大鼠模型，實(shí)驗(yàn)中采用了逍遙散作為干預(yù)藥物，西藥氟西汀作為對(duì)照藥物。在實(shí)驗(yàn)中，大鼠海馬TPH2與IDO1的基因表達(dá)與蛋白水平發(fā)生了變化，造模使TPH2的表達(dá)下調(diào)的同時(shí)上調(diào)了IDO1的表達(dá)，且基因與蛋白表達(dá)結(jié)果基本一致。研究顯示，5-HT系統(tǒng)紊亂與情緒抑郁、食欲減退、失眠、晝夜節(jié)律紊亂、內(nèi)分泌功能紊亂、性功能障礙、焦慮不安、活動(dòng)減少等密切相關(guān)。TPH的活性直接決定5-HT含量的變化，因此有學(xué)者提出TPH調(diào)控影響的研究比5-HT本身含量的研究更有價(jià)值[9]。TPH-2主要控制著中樞5-HT的合成，其基因的異?？赡軐?dǎo)致各類情感障礙，嚴(yán)重者能導(dǎo)致自殺行為。研究表明，TPH2基因在腦內(nèi)海馬、中縫核中表達(dá)豐富[10]，而海馬作為邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是與情感、情緒密切相關(guān)的重要腦區(qū)，富含各種神經(jīng)遞質(zhì)及受體，對(duì)應(yīng)激最為敏感，是應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，慢性應(yīng)激可引起海馬結(jié)構(gòu)和功能的變化[11]，這是目前研究肝郁脾虛證的重要靶點(diǎn)之一。IDO1作為在情感障礙疾病的發(fā)病及治療過(guò)程中都具有重要作用，與單胺類遞質(zhì)、細(xì)胞因子及神經(jīng)元可塑性密切相關(guān)[12]。IDO1的過(guò)度激活可以使色氨酸更多的代謝為犬尿氨酸，而色氨酸作為必需氨基酸和5-HT的前體物質(zhì)，在沒(méi)有大量外界攝入的情況下，其含量的減少會(huì)導(dǎo)致5-HT水平下降。此外，激活的IDO1還可以加速5-HT的代謝，使5-HT進(jìn)一步減少。IDO1同時(shí)也是炎性反應(yīng)誘導(dǎo)型酶，且細(xì)胞因子間具有協(xié)同效應(yīng)，機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活可以引起細(xì)胞因子過(guò)度分泌，誘導(dǎo)激活I(lǐng)DO1，影響神經(jīng)遞質(zhì)的代謝。情緒腦區(qū)神經(jīng)生成減少或退化增加導(dǎo)致了情感障礙，而IDO1作用下的色氨酸-犬尿氨酸通路的部分代謝產(chǎn)物，如3-羥基犬尿氨酸、喹啉酸等具有神經(jīng)毒性作用，可以導(dǎo)致神經(jīng)元的退化而影響神經(jīng)可塑性[13]。J Mao等[14]應(yīng)用IDO1阻斷劑1-MT及SSRI類抗抑郁藥對(duì)抑郁模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示模型組小鼠海馬IDO1較正常組升高，TPH2與正常組無(wú)顯著性差異，IDO1/TPH2顯著升高；單獨(dú)應(yīng)用1-MT及聯(lián)合用藥對(duì)各指標(biāo)有調(diào)節(jié)作用，而單獨(dú)應(yīng)用SSRI組IDO1/TPH2較模型組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TPH2作為5-HT合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶直接調(diào)控5-HT生成，IDO1則通過(guò)降解色氨酸為犬尿氨酸間接影響5-HT含量。當(dāng)IDO1表達(dá)過(guò)多導(dǎo)致色氨酸含量減少而TPH2催化功能的改變不能彌補(bǔ)由色氨酸不足導(dǎo)致的5-HT合成減少時(shí)，機(jī)體對(duì)應(yīng)激刺激的敏感性增加，可能會(huì)導(dǎo)致多種情感類障礙。因此，TPH2與IDO1作為色氨酸代謝生成5-HT途徑的重要調(diào)控指標(biāo)，能夠?qū)е?-HT合成不足，這與肝郁脾虛證的發(fā)生密切相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，逍遙散與氟西汀對(duì)TPH2與IDO1均有一定的調(diào)節(jié)作用，且逍遙散的調(diào)節(jié)作用更為明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道，抑郁模型大鼠海馬TPH mRNA表達(dá)減少，而氟西汀能夠上調(diào)TPH的表達(dá)[15]，且長(zhǎng)期的氟西汀治療對(duì)海馬TPH2 mRNA表達(dá)具有上調(diào)作用[16]。因此氟西汀雖作為本實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照藥物，其本身為SSRI類藥物雖能增加突觸間隙內(nèi)5-HT的含量，但可能會(huì)因色氨酸的減少導(dǎo)致突觸前膜5-HT合成和貯存不足而產(chǎn)生快速抗藥反應(yīng)，減弱其療效[17]。而逍遙散具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效，早期主要應(yīng)用于婦科疾病的治療中。隨著中醫(yī)學(xué)的現(xiàn)代發(fā)展，有利的情緒能夠促進(jìn)疾病的恢復(fù)，情志與臨床疾病關(guān)系研究的深入，逍遙散的應(yīng)用范圍也隨之增大，幾乎涵蓋了人體的所有系統(tǒng)。逍遙散治療肝郁脾虛證，因其整體調(diào)節(jié)、辨證論治、個(gè)體化診療等理念的滲透，顯示了明顯的優(yōu)越性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察了慢性束縛應(yīng)激大鼠海馬TPH2與IDO1基因蛋白表達(dá)情況，逍遙散作為治療肝郁脾虛證最常用的經(jīng)典名方之一，其作用靶點(diǎn)較多，也對(duì)TPH2與IDO1的含量變化有一定的調(diào)節(jié)作用，它們均通過(guò)作用于5-HT前體物質(zhì)—色氨酸來(lái)調(diào)節(jié)5-HT的含量，研究它們之間的相互作用關(guān)系是進(jìn)一步為肝郁脾虛證的中樞機(jī)制與逍遙散治療肝郁脾虛證提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(2017-02-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Influence of xiaoyaosan on the expression of TPH2 and IDO1 in hippocampus of rat with syndrome of liver depression and spleen deficiency

Jiao Haiyan, Yan Zhiyi, Ma Qingyu, Zhou Yan, Li Xiaojuan, Pan Qiuxia, Wang Tingye, Liu Yueyun, Chen Jiaxu

(SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the expression of TPH2 and IDO1 in hippocampus of rat with syndrome of liver depression and spleen deficiency, and to explore the regulating effect of xiaoyaosan. Methods:Male SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group, model group, xiayaosan group and fluoxetine group, each including 6 rats. The liver depression and spleen deficiency model was established by chronic immobilization stress for 21 days. The expression of TPH2 and IDO1 were detected by Fluorescent quantitative PCR and Western-blot method. Results:The mRNA expression of TPH2 in hippocampus of model group decreased significantly compared with the other groups (P<0.05); xiaoyaosan and fluoxetine could increase the TPH2 mRNA expression. The mRNA expression of IDO1 in hippocampus of model group increased significantly (P<0.01); xiaoyaosan and fluoxetine had the down-regulatory effect on IDO1 mRNA expression (P<0.01), which is more obvious in xiaoyaosan group. The protein expression of TPH2 in normal group was higher than the other groups (P<0.01), which of xiaoyaosan group was higher than model group (P<0.05); the protein expression of IDO1 in model group increased significantly compared with the other groups (P<0.01). Conclusion:The expression of TPH2 decreases and IDO1 increases in liver depression and spleen deficiency model rats, and xiaoyaosan has a therapeutic effec by regulating TPH2 and IDO1 in hippocampus to influence the content of 5-HT.

Syndrome of liver depression and spleen deficiency; Xiaoyaosan; TPH2; IDO1

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：81473597)；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào)：81630104)；北京中醫(yī)藥大學(xué)自主課題(編號(hào)：2016-JYB-XS012)

陳家旭，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京市朝陽(yáng)區(qū)北三環(huán)東路11號(hào)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷系83號(hào)信箱，郵編：100029，Tel：(010)64286656，E-mail：chenjx@bucm.edu.cn

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.004