注射用伊潘立酮長效緩釋微球的制備和評價

劉哲慧+張琳

[摘要] 目的 制備伊潘立酮的PLGA微球，并進行質(zhì)量評價。 方法 建立HPLC方法測定伊潘立酮的含量；比較5種規(guī)格的PLGA作為載體材料對微球質(zhì)量的影響；運用正交實驗設(shè)計優(yōu)化處方組成和制備工藝。 結(jié)果 PLGA的種類對伊潘立酮微球的包封率和體外釋放有顯著影響。按照正交設(shè)計得到優(yōu)化處方制備的微球，形狀圓整，平均粒徑為（27.3±2.7）μm，包封率為84.4%，體外釋放試驗第1天累計釋放17.6%，28 d的累計釋放度為85.7%，釋藥曲線符合Higuchi釋放模型。 結(jié)論 本實驗制備得到的伊潘立酮微球的包封率較高，沒有明顯的突釋，具有較好的緩釋效果。

[關(guān)鍵詞] 伊潘立酮；PLGA；微球；正交實驗；釋放曲線

[中圖分類號] R943 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）06-0036-04

[Abstract] Objective To prepare iloperidone loaded PLGA microspheres and evaluate its pharmaceutical characters. Methods The HPLC method was established to determine the concentration of iloperidone. The effect of 5 kinds of specifications of PLGA as carrier material on the quality of the microspheres was investigated. The formulation and the preparation conditions were optimized by orthogonal tests. Results The kinds of PLGA and drug encapsulation efficiency showed significant effect on the property of the microspheres， in particular on the release rate. The best formulation was obtained according to the effects of different factors on the preparation of iloperidone microspheres. The formed microspheres were spherical with smooth surface and the average size was（27.3±2.7） μm. The drug encapsulation efficiency was 84.4%. In vitro release study revealed of 17.6% at the first day and 85.7% of drug released from PLGA microspheres in 28 d. The release kinetics of microspheres in vitro were characterized by Higuchi equation. Conclusion Iloperidone-containing PLGA microspheres are prepared successfully with high encapsulation efficiency， with no obvious sudden release and good sustained release characteristics.

[Key words] Iloperidone； PLGA； Microspheres； Orthogonal tests； Release curve

伊潘立酮（iloperidone）是一種哌啶基苯唑衍生物，為新型的非典型抗精神病藥物，主要拮抗5-羥色胺2A受體（5-HT2A）和多巴胺-2受體（D2），用于成人精神分裂癥的治療。就目前臨床研究資料顯示，該藥安全有效，主要特點為錐體外系不良反應(yīng)（EPS）少、代謝異常和體質(zhì)量增加的發(fā)生率較低[1-3]。目前伊潘立酮上市劑型為普通口服制劑，患者需要長期服藥和特殊護理。

注射用長效緩釋微球可以減少患者的服藥次數(shù)，具有生物利用度較高、無肝臟首過效應(yīng)、血藥濃度平穩(wěn)和患者服藥順從性高等特點。對于精神病患者因經(jīng)常出現(xiàn)拒服、漏服藥物而導(dǎo)致的病情惡化現(xiàn)象，長效微球注射劑的出現(xiàn)無疑能夠很好地解決這個問題[4]。注射用利培酮微球，是第一個長效非典型性抗精神病藥物，結(jié)合了長效劑型和非典型抗精神病藥物的優(yōu)勢，使臨床療效和依從性達到最佳化，并改善耐受性，是精神分裂癥治療中的一個重大進展[5]。與傳統(tǒng)劑型比較，新劑型在藥物釋放、耐受性、有效性及依從性等方面具有顯著的優(yōu)越性。有鑒于此，本研究采用聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）作為微球載體材料，制備了注射用伊潘立酮長效緩釋微球，并對其進行藥劑學性質(zhì)評價。

1 材料與方法

1.1 儀器

高速勻漿器（德國IKA公司）；高速冷凍離心機（美國Beckman公司）；Waters 1525系列HPLC分析儀（美國Waters公司）；精密電子天平（德國Sartorius公司）；真空冷凍干燥機（西安常儀儀器設(shè)備有限公司）；恒溫加熱磁力攪拌器（河南中良科學儀器有限公司）；掃描電鏡（日本Hitachi公司）；激光粒度測定儀（美國Beckman公司）。

1.2 藥品與試劑

伊潘立酮原料藥（石藥集團中奇制藥技術(shù)有限公司，批號：091193，純度>98%）；PLGA（美國Birmingham Polymers公司，5種規(guī)格，見表1）；聚乙烯醇（PVA，國藥集團化學試劑有限公司）；二氯甲烷（分析純，北京化學試劑公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 伊潘立酮微球的制備

采用乳化溶劑揮發(fā)法制備伊潘立酮PLGA微球，精確稱量20 mg伊潘立酮和200 mg的PLGA 溶于適量的二氯甲烷中，形成油相，迅速轉(zhuǎn)移至濃度為2%的PVA水溶液中，高速攪拌下充分乳化10 min。乳化后的混合物轉(zhuǎn)移至100 mL去離子水中，在室溫條件下磁力攪拌3 h，揮發(fā)除去有機溶劑，同時固化微球。高速離心收集微球，去離子水洗滌3次，再將離心所得微球進行冷凍干燥[5，6]。

2.2 伊潘立酮微球包封率和載藥量的測定

2.2.1 色譜條件[7] 色譜柱為Krosmail-C18柱（5 μm，4.6×250 mm），以乙腈：0.2 mol/L甲酸銨（50∶50）為流動相，柱溫為45℃，檢測波長為275 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為20 μL。

2.2.2 標準曲線的建立 精密稱取伊潘立酮10 mg置于100 mL量瓶中，以流動相溶解并定容，再分別稀釋制成2～30 μg/mL系列標準溶液，進行HPLC測定，以峰面積（A）對質(zhì)量濃度（C，μg/mL）線性回歸，得標準曲線方程。A=15366C+14720，r=0.9998，線性范圍2～30 μg/mL。

2.2.3 精密度和回收率實驗 在線性范圍內(nèi)取30、12、4 μg/mL的高、中、低3個濃度的伊潘立酮標準溶液，按上述HPLC法每個濃度連續(xù)重復(fù)進樣5次，觀察測定方法的日內(nèi)精密度，RSD分別為1.22%、0.57%和0.68%。以上高、中、低3種濃度的伊潘立酮標準溶液分別于第1、2、3、4、5 天重復(fù)進樣5次，觀察測定方法的日間精密度，RSD分別為0.76%、1.03% 和0.35%。

上述高、中、低系列濃度的伊潘立酮溶液2 mL置于10 mL量瓶中，加入20 mg的空白微球，然后加入流動相，超聲至微球完全溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，按上述HPLC法進樣測定，計算回收率。結(jié)果高、中、低濃度的回收率分別為99.12%、99.31%和100.42%。

2.2.4 微球包封率和載藥量的測定 精密稱取冷凍干燥的微球20 mg，置10 mL量瓶中，加流動相5 mL，超聲至微球完全溶解后，加流動相定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，按上述HPLC法進樣測定，計算微球包封率和載藥量。

2.3 伊潘立酮微球體外釋放度測定

取冷凍干燥后的各處方微球，精密稱定20 mg，分別置于10 mL的具塞玻璃離心管中，加5 mL釋放介質(zhì)。釋放介質(zhì)為pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS），同時含有0.05%（w/v）的聚山梨酯-80和0.002%的疊氮化鈉[5]。釋放樣品置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為70 r/min。分別在2 h和1、4、7、14、21、28 d取出3支離心管，離心10 min（4000 r/min），棄去上清液，將殘余微球加入2 mL流動相，超聲至微球完全溶解后，4000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm微孔濾膜，濾液作為供試品溶液，用HPLC測定微球中剩余的伊潘立酮含量，推算出已經(jīng)釋放的藥量，計算出伊潘立酮微球的累積釋放百分率。以累積釋放百分率（%）為縱坐標，以釋放時間（day）為橫坐標繪制伊潘立酮的體外釋放曲線。

2.4 伊潘立酮微球的形態(tài)、粒徑大小和分布觀察

取伊潘立酮PLGA微球凍干粉適量，置雙面膠帶上，涂布均勻。用Eiko B-5離子鍍膜儀濺金，S-450電子掃描顯微鏡觀察微球的形狀、大小和表面形態(tài)。取微球凍干粉適量，加入適量蒸餾水稀釋，調(diào)整透光度，采用LS 230激光粒徑測定儀測定粒徑大小和分布。

2.5 PLGA種類對伊潘立酮微球性質(zhì)的影響

作為伊潘立酮微球骨架材料的PLGA，在藥物的包封和釋藥行為中發(fā)揮著重要作用。我們選取5種不同規(guī)格的PLGA，按照2.1伊潘立酮微球的制備方法，除PLGA規(guī)格變化外，其他制備條件保持一致，制備伊潘立酮微球，觀察不同種類的PLGA對微球粒徑、包封率和體外釋放的影響。表1說明不同種類的PLGA對微球的粒徑影響較?。≒>0.05），而對于藥物的包封率影響顯著（P<0.05）。

5種不同規(guī)格的PLGA制備的伊潘立酮微球的體外釋放曲線見圖1。在相同的LA/GA比例條件下，隨著PLGA分子量的增加（50DG020<50DG040<50DG065），制得的初乳黏度增加，藥物的包封率顯著提高（P<0.05）。同時隨著分子量的增加，PLGA的體外降解放慢，藥物釋放也隨之減慢。在相同的分子量條件下，PLGA中乳酸（LA）比例增加（50DG040<75DG040），對藥物的包封率影響較小（P>0.05），但由于75DG040中LA含量的增加，微球的體外降解放慢，藥物釋放時間顯著延長。在相同的分子量和LA/GA比例條件下，未封閉PLGA（50DG020A）較封閉PLGA（50DG020）的釋藥速度快，而對包封率影響較?。≒>0.05）。綜合考慮各種PLGA對微球性質(zhì)的影響，我們選擇了75DG040作為制備伊潘立酮微球的骨架材料，并進一步優(yōu)化處方工藝。

2.6正交設(shè)計優(yōu)化伊潘立酮微球的制備處方與工藝

在文獻調(diào)研[6，8]和前期研究的基礎(chǔ)上，選取PLGA濃度（A）和高速攪拌速度（B）2個因素，每個因素選擇3個水平，按L9（32）正交表設(shè)計安排實驗，以微球包封率和28 d體外累計釋放度作為評價指標，采用綜合評分法進行正交優(yōu)化[9]。綜合得分=包封率（%）×0.8+累計釋放度（%）×0.2。正交實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

由極差R的大小確定影響因素，實驗結(jié)果可見A>B，即說明PLGA濃度是制備工藝的關(guān)鍵因素。第8號實驗的包封率為84.4%，累計釋放度為85.7%，綜合得分最高，為84.6，故最優(yōu)的水平組合應(yīng)為A3B2。掃描電鏡下觀察，微球形狀圓整，表面光滑，如圖2所示，平均粒徑為（27.3±2.7）μm。微球的體外釋藥曲線見圖3，第1小時藥物的釋放為12%，第1天累計釋放了17.6%，沒有明顯的突釋現(xiàn)象，之后隨著PLGA的逐漸降解，藥物緩慢釋放。此外，我們用電鏡觀察了伊潘立酮微球在體外釋放過程中微球的形態(tài)變化。釋放1 d時，微球外觀形態(tài)完好，推測這時載藥微球中藥物的釋放主要依賴于微球表面的藥物；1周后，微球外觀形態(tài)發(fā)生了輕微變化，但微球基本圓整，推測這時載藥微球中藥物的釋放主要通過微球表面的孔洞以及藥物擴散；2周后，微球外觀形態(tài)發(fā)生了較明顯的變化，推測這時載藥微球中藥物的釋放主要依賴于PLGA的降解和溶蝕；4 周后，微球降解溶蝕明顯，有微球的融合聚集現(xiàn)象，推測這時藥物已經(jīng)基本釋放完全。

分別用零級釋放模型、一級釋放模型、Higuchi釋放模型、Weibull分布函數(shù)、Ritger-Peppas指數(shù)模型對伊潘立酮微球的體外釋放數(shù)據(jù)進行擬合[10]。5種釋放模型擬合后的線性相關(guān)系數(shù)依次為：Higuchi釋放模型>Ritger-Peppas指數(shù)模型>Weibull分布函數(shù)>一級釋放模型>零級釋放模型，表明微球的釋藥曲線符合Higuchi釋放模型，Q=0.2137+13.6577t1/2，r=0.9854，伊潘立酮微球的體外釋放以擴散機制為主。見表3。

2.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

精神分裂癥是一種病因未明的嚴重腦部功能紊亂疾病，多起病于青壯年，常有感知、思維、行為等方面的障礙和精神活動的不協(xié)調(diào)，嚴重影響患者及家屬的生活質(zhì)量。盡管心理療法和康復(fù)療法是不容忽視的治療手段，但是目前在臨床上對精神分裂癥的治療中藥物治療仍然占據(jù)核心地位[11]。已有大量研究證明，精神分裂癥患者需要接受抗精神病藥物治療。典型抗精神病藥物（傳統(tǒng)抗精神病藥物）主要有氯丙嗪、奮乃靜等，對陽性精神病性癥狀有效，但因其同時也伴隨較多副作用，從而在臨床應(yīng)用方面表現(xiàn)出較大的局限性。非典型抗精神病藥除作用于D2受體外，還對多巴胺D3、D4、D1受體，5-羥色胺受體以及谷氨酸受體系統(tǒng)等均有作用。這種多受體靶點作用的藥理特征，使其具有不同于傳統(tǒng)抗精神病藥物的優(yōu)點。與傳統(tǒng)抗精神病藥相比，非典型抗精神病藥物的錐體外系副作用更小，對陰性癥狀有效，并可改善認知功能障礙，是一類治療精神分裂癥更安全有效的藥物。

與傳統(tǒng)制劑相比，緩釋微球制劑可以減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性，降低副作用，提高療效，在臨床上已突顯優(yōu)勢，近年來已成為藥物新劑型研發(fā)的熱點[12]。針對精神病患者，緩釋微球制劑可防止患者拒服或漏服藥物現(xiàn)象而得到廣泛關(guān)注。臨床研究表明，注射用利培酮微球（恒德），其血漿藥物水平穩(wěn)定，療效明顯優(yōu)于安慰劑，且同于口服利培酮，不良反應(yīng)少，耐受性佳，可改善精神病患者的生活質(zhì)量和社會功能，可以作為第一線抗精神病藥物單一使用。而且注射用利培酮微球治療組的再住院和復(fù)發(fā)的風險也較低，在減少家庭及自身精神負擔、充滿自信、減少住院次數(shù)以及社交能力提高等方面呈顯著正相關(guān)，具有較好的效益成本性[13]。

本研究以廣泛使用的PLGA為載體材料，乳化溶劑揮發(fā)法制備了伊潘立酮微球。生物降解聚合物PLGA，應(yīng)用廣泛，并已獲得美國FDA批準用作手術(shù)縫合線、心血管支架、控釋藥物涂層，以及注射用微囊、微球、埋植劑等的骨架材料，近20多年來被大量用作長效微球注射劑的骨架材料[14，15]。乳化溶劑揮發(fā)法工藝簡單，初乳乳滴的粒徑較易控制，因此藥物在微球中較易分散均勻，且包封率及得率較高，藥物釋放也較理想[16，17]。制備PLGA微球過程中相關(guān)因素如制備方法、藥物本身理化性質(zhì)、PLGA結(jié)構(gòu)特點、有機溶劑、其他輔料等對微球的粒徑、形態(tài)、包封率、載藥量和釋放行為均有顯著的影響[18-20]。從本試驗結(jié)果可知，PLGA的分子量和LA/GA比例對伊潘立酮微球的性質(zhì)均有一定的影響，對微球的包封率和釋放行為影響比較明顯，而對微球的粒徑影響較小。在選擇了合適的PLGA種類后，通過正交設(shè)計進一步優(yōu)化了伊潘立酮微球的制備工藝和條件，選取適宜的PLGA濃度和高速攪拌速度，制備得到的微球，形狀圓整，平均粒徑為（27.3±2.7）μm，包封率為84.4%，體外釋放試驗第1天累計釋放了17.6%，28 d的累計釋放度為85.7%，釋藥曲線符合Higuchi釋放模型，為抗精神病用長效藥物注射微球的設(shè)計奠定了基礎(chǔ)。在今后的工作中，我們將進一步研究伊潘立酮微球的體內(nèi)釋藥特點。在條件允許的情況下，建立動物模型，以探究伊潘立酮微球的藥效學行為。

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（收稿日期：2016-12-19）