耐鎘乳酸菌對(duì)重金屬鎘的吸附機(jī)制

邵鑫，孫凱，熊婧，余翀，吳希陽

(暨南大學(xué) 理工學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

耐鎘乳酸菌對(duì)重金屬鎘的吸附機(jī)制

邵鑫，孫凱，熊婧，余翀，吳希陽*

(暨南大學(xué) 理工學(xué)院，食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州，510632)

乳酸菌；鎘耐受性；吸附機(jī)制

在所有重金屬污染問題中，鎘因其生物毒性大、移動(dòng)性強(qiáng)成為最受關(guān)注的對(duì)象之一[1]。而通過食物攝入是鎘進(jìn)入人體的最主要渠道(90%)[2-4]。當(dāng)鎘被人體吸收后，自然排泄是一個(gè)非常緩慢的過程，因此，使用解毒劑驅(qū)排體內(nèi)蓄積的鎘是預(yù)防及治療鎘中毒的優(yōu)選措施[5]。但這些藥物治療方法單一，副作用多、安全性差、價(jià)格昂貴、療程較長。螯合物還會(huì)結(jié)合除鎘之外的其他金屬，甚至體內(nèi)的一些必需微量元素，若長時(shí)間服用會(huì)影響機(jī)體健康[6-7]。

由于農(nóng)產(chǎn)品/食品重金屬鎘污染問題日趨嚴(yán)重，尋找能夠移除食品及人體中的重金屬鎘的方法已然迫在眉睫。雖然已發(fā)現(xiàn)了許多能夠吸附重金屬鎘的微生物，但它們通常是環(huán)境工業(yè)微生物或條件致病菌，無法應(yīng)用于食品行業(yè)[8]。

乳酸菌具有吸附重金屬鎘的能力，不僅能夠在環(huán)境中對(duì)鎘進(jìn)行吸附，且在腸道內(nèi)也能夠發(fā)揮吸附作用[9-13]。環(huán)境和腸道微生態(tài)在長期的低劑量鎘的壓力下，可能會(huì)產(chǎn)生對(duì)鎘的耐受性，因此通過篩選能夠分離出耐鎘乳酸菌成為潛在的鎘吸附劑和解毒劑。而乳酸菌作為食品安全級(jí)別的益生菌，在食品中應(yīng)用廣泛，使用食品安全級(jí)的乳酸菌作為重金屬鎘吸附劑添加到含鎘食品中移除食品中的鎘；或作為膳食補(bǔ)充劑攝入體內(nèi)，通過糞便將重金屬排出體外，防止鎘在體內(nèi)進(jìn)行積累是新的研究思路[14]。

現(xiàn)有的研究報(bào)道局限于乳酸菌對(duì)鎘的吸附力研究，缺乏對(duì)細(xì)菌細(xì)胞本身機(jī)理的了解。本研究結(jié)合紅外光譜、掃描電鏡方法，從細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)及形態(tài)變化對(duì)乳酸菌吸附重金屬鎘的機(jī)理進(jìn)行了探索。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

研究采用的乳酸桿菌菌株如表1所示，為本實(shí)驗(yàn)室收藏的標(biāo)準(zhǔn)菌株，其中的干酪乳桿菌(LAB-111)分離自益力多乳酸菌飲品。

1.2 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑

MRS培養(yǎng)基(250 g)、MRS肉湯(250 g)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；戊二醛(500 mL)、無水乙醇(500 mL)、醋酸異戊酯(500 mL)、多聚甲醛(500 mL)、Cd(NO3)2·4 H2O(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)(FD-1-50)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；傅里葉變換紅外吸收光譜儀(EQUINOX55)，德國Bruker公司；掃描電子顯微鏡(XL-30ESEM)、透射電子顯微鏡(TECNAI-10)，荷蘭飛利浦公司；火焰原子分光光度計(jì)(AA-7000)，日本島津公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鎘儲(chǔ)備液的配制

稱取27.44 g Cd(NO3)2·4 H2O溶于100 mL無菌蒸餾水中，配制成100 g/L的母液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

2.2 實(shí)驗(yàn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)測定

將表1中17株實(shí)驗(yàn)室保藏的標(biāo)準(zhǔn)乳酸桿菌接種于MRS平板中，于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落懸浮于1 mL滅菌純水中，取1環(huán)劃線于不同Cd2+濃度的平板上培養(yǎng)48～72 h后觀察生長情況并記錄各菌株的MIC。

2.3 目標(biāo)菌體收集及吸附

將表1中LAB-5、LAB-9、LAB-28、LAB-53四株對(duì)鎘具有高耐受性的乳酸桿菌(MIC≥4.0 g/L)的實(shí)驗(yàn)菌株和1株在鎘耐受性實(shí)驗(yàn)中MIC最低(10 mg/L)的乳酸菌LAB-54接種于MRS培養(yǎng)基上，置于37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，2 795 g離心10 min收集菌體，用滅菌純水洗滌3次，懸浮成100 g/L(濕重)的菌懸液。

取100 g/L的鎘儲(chǔ)備液用無菌水配制成濃度為100 mg/L的Cd2+水溶液，加入100 g/L的菌懸液，使菌體終濃度為5 g/L，置于37 ℃搖床培養(yǎng)120 min。于2 795 g離心10 min使吸附后的菌體沉淀，用無菌水洗滌3次，轉(zhuǎn)入已稱重的EP管中，80 ℃烘箱干燥至恒重，測干重。上清液用0.45 μm濾膜過濾，存于4 ℃冰箱中待測。共設(shè)3批平行實(shí)驗(yàn)。

取100 g/L的鎘儲(chǔ)備液用無菌水配制成濃度為0、25、300 mg/L的Cd2+水溶液，分別加入LAB-5和LAB-54 100 g/L的菌懸液，使菌體終濃度為5 g/L，置于37 ℃搖床培養(yǎng)120 min。4 024.8 g離心10 min使吸附后的菌體沉淀，用純水洗滌3次后再次離心使菌體沉淀。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 ppm)配制成濃度為0、0.5、1、1.5、2、2.5 ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入火焰原子化器中測其吸光度值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出吸光度值與濃度關(guān)系的一元線性回歸方程。

2.5 儀器工作參數(shù)設(shè)定及樣品的測定

火焰原子吸收分光光度計(jì)測定條件如下：波長228.8 nm，狹縫0.15～0.2 nm，燈電流6～7 mA，空氣流量5 L/min，背景校正為氚燈。

于測定標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液相同的實(shí)驗(yàn)條件下，吸取吸附后的上清液樣品注入火焰原子化器，測其吸光度值。代入標(biāo)準(zhǔn)系列的一元線性回歸方程中求樣品中鎘的濃度，平行測定2次。若測定結(jié)果超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，用1%硝酸溶液稀釋至范圍內(nèi)后再行測定。按公式(1)計(jì)算鎘的生物吸附率[15]：

(1)

其中，Qr，吸附率，%；Co，金屬離子初始濃度，mg/L；Ce，吸附后重金屬離子最終濃度，mg/L；m，菌株的干重，g；V，溶液總體積，L。

2.6 紅外光譜及掃描電鏡分析

將吸附后的菌體沉淀在-80 ℃冷凍過夜后，冷凍干燥至恒重，取干燥菌粉于瑪瑙研缽中與溴化鉀以1∶50的質(zhì)量比在紅外燈下研磨混勻后壓片，成形后置于傅里葉變換紅外吸收光譜儀的檢測臺(tái)上，對(duì)鎘結(jié)合的細(xì)胞進(jìn)行紅外光譜分析。

以2.5%戊二醛懸浮吸附后的菌體沉淀，于4℃冰箱中固定過夜，4 024.8 g離心5 min，去上清；用0.1 mol/L，pH 7.2的PBS清洗菌體3次，每次10 min；用30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水各10 min，再用無水乙醇(100%)脫水2次，每次10 min，然后用醋酸異戊酯懸浮菌體2次，每次8 min；將菌懸液在蓋玻片上滴樣，待醋酸異戊酯揮發(fā)后，將蓋玻片置于臨界點(diǎn)干燥機(jī)的樣品槽內(nèi)進(jìn)行干燥處理；將干燥好的樣品粘貼在銅臺(tái)上，用離子鍍膜機(jī)在樣品表面噴鍍1層金屬導(dǎo)電膜，然后將樣品置于掃描電鏡樣品觀察室中，選用3 kV加速電壓對(duì)菌體的表面微觀特征進(jìn)行觀察。

3 結(jié)果與討論

3.1 MIC測定結(jié)果

對(duì)17株乳酸桿菌進(jìn)行MIC測定的結(jié)果顯示，共有4株菌MIC≥4.0 g/L(23.50%)，11株菌(64.70%)的MIC低于2.0 g/L，其中LAB-54的MIC最低為10 mg/L，另外2株菌的MIC在2.0～2.5 g/L，如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)菌株的耐鎘MIC實(shí)驗(yàn)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別為0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/L，以Cd2+濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=1.003 7x+0.007 2，擬合度R2=0.999 2。

3.3 不同乳酸菌對(duì)鎘的吸附率

本研究通過原子吸收分光光度法測定經(jīng)乳酸菌在含Cd2+溶液中進(jìn)行生物吸附后的Cd2+含量，可知細(xì)菌胞內(nèi)或胞外吸附后溶液中的重金屬含量的改變，從而測定出不同的菌株對(duì)鎘的吸附性能。

圖1顯示了4株對(duì)鎘具有高耐受性能以及1株對(duì)鎘具有低耐受性能的乳酸菌在Cd2+濃度為100 mg/L的溶液中對(duì)Cd2+的吸附率。

圖1 耐鎘乳酸菌的鎘吸附率Fig.1 Cd removal efficiency of Cd-resistant LAB strains

可以看出，4株高耐受乳酸菌具有一定的Cd2+吸附能力，而LAB-54作為低耐受對(duì)照菌株的吸附率最低(6.80%)，LAB-9、LAB-28、LAB-53 3株菌的吸附率分別為：27.20%、28.00%、29.10%。LAB-5的吸附率最高, 達(dá)到了31.40%。ZHAI等在篩選高吸附性能的菌株時(shí)將篩選標(biāo)準(zhǔn)定為當(dāng)吸附率高于18% 則認(rèn)為該菌株具有高吸附性能[16]。若以此為依據(jù)，則本研究所篩選的4株乳酸菌皆被認(rèn)為是高吸附菌株。

3.4 紅外光譜

圖2 在3種Cd2+濃度(0、25、300 mg/L)下LAB-5的FTIR圖Fig.2 FTIR photographs of LAB-5 biomass under three different Cd2+ concentrations (0, 25, 300 mg/L)

圖3 在3種Cd2+濃度(0、25、300 mg/L)下LAB-54的FTIR圖Fig.3 FTIR photographs of LAB-54 biomass under three different Cd2+ concentrations (0, 25, 300 mg/L)

吸附前后主要吸收峰的變化量如表2所示，以吸附前為對(duì)照，若吸附后為負(fù)值，則該吸收峰向低波數(shù)移動(dòng)，代表紅移，若吸附后為正值，則該吸收峰向高波數(shù)移動(dòng)，代表藍(lán)移。

表2 吸附重金屬鎘前后細(xì)胞主要吸收峰的變化

LAB-54的鎘耐受能力非常弱，MIC為10 mg/L，選取該菌目的是作為對(duì)照組觀察低耐受菌株與鎘的結(jié)合機(jī)制。在25 mg/L的Cd2+處理后，只有原位于3 428.81 cm-1和2 931.27 cm-1的峰位置發(fā)生偏移，強(qiáng)度明顯減弱，其他位置的吸收峰變化均不明顯，推測此時(shí)Cd2+與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)主要在細(xì)胞壁的脂肪酸上。在300 mg/L的Cd2+處理后，各吸收峰均出現(xiàn)了不同程度的強(qiáng)度減弱，說明該菌與羥基、羧基、磷酸基、酰胺基、烴基官能團(tuán)共同作用。

3.5 掃描電鏡分析

掃描電鏡能從不同角度對(duì)樣品的表面微觀形態(tài)觀察，對(duì)在空白對(duì)照(0 mg/L)、低濃度(25 mg/L)和高濃度(300 mg/L)的Cd2+進(jìn)行吸附后的2株乳酸菌進(jìn)行掃描，以細(xì)胞的變化來分析鎘對(duì)細(xì)胞的影響，并推測作用機(jī)制。

圖4為LAB-5在3種不同Cd2+濃度處理后的細(xì)胞形態(tài)。LAB-5為革蘭氏陽性長桿菌，吸附前(圖4-A)細(xì)胞形態(tài)完整無缺，表面光滑飽滿，細(xì)胞與細(xì)胞之間似乎黏連著一層光滑的外膜。在25 mg/L的Cd2+吸附后(圖4-B)的細(xì)胞明顯出現(xiàn)變形、扭曲、凹陷、皺褶，表面變得粗糙，細(xì)胞之間覆蓋著的光滑外膜消失，胞外還黏連著一些絲狀物質(zhì)。在300 mg/L的Cd2+吸附后(圖4-C)的細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重，明顯觀察到細(xì)胞壁穿孔現(xiàn)象，表面粗糙不堪，有些細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)完全流失，呈扁平狀的空殼塌陷在蓋玻片上，絲狀黏連物明顯增多。結(jié)合紅外光譜(圖2)來看，在低濃度下，細(xì)胞已開始大規(guī)模壞死，推測Cd2+同時(shí)與細(xì)胞壁上的S層蛋白、多聚糖、胞內(nèi)分泌的多糖、酰胺、蛋白質(zhì)結(jié)合。在高濃度下，細(xì)胞壞死加重，推測是由于Cd2+濃度過高，胞內(nèi)外滲透壓差異巨大，更多高毒性的鎘進(jìn)入了細(xì)胞內(nèi)部，胞內(nèi)物質(zhì)迅速并且大量地從孔中溢出，使鎘的吸附量從低濃度的7 mg/g增加到21 mg/g(干重)。

圖4 在3種Cd2+濃度下LAB-5的SEM圖(A-0、B-25 mg/L、C-300 mg/L)Fig.4 SEM photographs of LAB-5 biomass under three different Cd2+ concentrations (A-0, B-25, C-300 mg/L)

圖5為LAB-54在3種不同Cd2+濃度處理后的細(xì)胞形態(tài)。LAB-54為革蘭氏陽性短桿菌，由于該菌的MIC只有10 mg/L，因此其在25和300 mg/L的Cd2+都無法生長，推測是Cd2+的毒性導(dǎo)致細(xì)胞死亡。該菌未對(duì)其吸附性能進(jìn)行探討，但由于其MIC非常低，失活菌體對(duì)鎘的吸附能力應(yīng)較強(qiáng)。吸附前(圖5-A)細(xì)胞為存活狀態(tài)，完整無缺，表面飽滿。在25 mg/L的Cd2+吸附后(圖5-B)的細(xì)胞壁形態(tài)完全改變，表面粗糙，內(nèi)陷、破裂、穿孔的程度十分嚴(yán)重，胞外附著許多細(xì)小顆粒。在300 mg/L的Cd2+吸附后(5C)的細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)完全流失，呈扁平狀的空殼塌陷在蓋玻片上，有些細(xì)胞堆積在一起完全變形，甚至無法觀察到細(xì)胞原來的形態(tài)。

圖5 在3種Cd2+濃度下LAB-54的SEM圖(A-0、B-25 mg/L、C-300 mg/L)Fig.5 SEM photographs of LAB-54 biomass under three different Cd2+ concentrations (A-0, B-25 mg/L, C-300 mg/L)

對(duì)以上2株菌進(jìn)行掃描電鏡分析，可以初步推測：LAB-5在低濃度下細(xì)胞幾乎無死亡，此時(shí)為胞外吸附，在高濃度下細(xì)胞壞死較多，表明Cd2+已通過胞內(nèi)運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，胞外吸附和胞內(nèi)擴(kuò)散共同作用；LAB-54則在低濃度下可能同時(shí)存在2種機(jī)制共同作用。因此，乳酸菌與鎘的作用機(jī)制包括胞外吸附及胞內(nèi)擴(kuò)散，而高耐受細(xì)菌可能存在一些耐受機(jī)制能夠阻止Cd2+進(jìn)入胞內(nèi)，或?qū)⒁堰M(jìn)入胞內(nèi)的Cd2+排出。

4 結(jié)論

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The cadmium removal mechanism of lactobacillus strains

SHAO Xin, SUN Kai, XIONG Jing, YU Chong, WU Xi-Yang*

(Department of Food Science & Engineering,Jinan University, Guangzhou 510632, China)

lactic acid bacteria (LAB); cadmium (Cd) resistance; removal mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703009

碩士研究生(吳希陽教授為通訊作者，E-mail:kentwu@hotmail.com)。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015A030401042)；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2012010008479)

2016-05-12，改回日期：2016-11-02