近紅外光譜模型用于姜黃素-賴氨酸共晶含量分析

伍旭明，遲宗良，蔡寶昌

近紅外光譜模型用于姜黃素-賴氨酸共晶含量分析

伍旭明1，遲宗良2*，蔡寶昌2,3

目的 探討近紅外光譜(NIR)分析姜黃素-賴氨酸共晶含量的可行性。方法 制備共60份不同含量的b型結(jié)晶，采用溶劑提取法和高效液相色譜法(HPLC)測定游離態(tài)姜黃素含量，并收集NIR圖，用偏最小二乘法(PLS)建立校正模型。結(jié)果 采用原始圖譜及Noriss平滑處理后的校正模型交叉驗證均方根誤差(RMSECV)為3.456，相關(guān)系數(shù)為0.988，優(yōu)于其他優(yōu)化方式。結(jié)論 基于PLS的NIR模型可用于藥物共晶的含量分析。

藥物共晶；姜黃素；賴氨酸；近紅外光譜；偏最小二乘法

0 引言

姜黃素(Curcumin，Cur)是從姜科(Zingiberaceae)姜黃屬CurcumaL.植物姜黃CurcumalongaL.的根莖中提取的一種天然活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗動脈粥樣硬化、調(diào)血脂等多種藥理活性，安全性良好[1-2]，但其生物利用度低、體內(nèi)駐留時間短[3-6]。因此，有研究者將Cur與賴氨酸(lysine，Lys)制備成姜黃素-賴氨酸共晶(Curcumin-lysine cocrystal，Cur-Lys)，得到a、b兩種晶型。經(jīng)對比，b型結(jié)晶藥動學(xué)行為更佳：其生物利用度從4.13%增至36.8%，體內(nèi)駐留時間從(6.65±0.30) h增至(22.08±0.86) h，符合臨床用藥要求，可以作為基礎(chǔ)進行后續(xù)開發(fā)。但若以藥物共晶為基礎(chǔ)進行新藥研發(fā)，需要對其進行純度分析和有關(guān)物質(zhì)控制(此處的有關(guān)物質(zhì)主要指游離態(tài)的Cur、Lys)。由于藥物共晶的鏈接力為氫鍵[7]，遇水或其他溶劑時會發(fā)生解離，因此常規(guī)的液態(tài)分析手段不適用于藥物共晶的分析[8]。本研究采用近紅外光譜法(Near infrared spectroscopy，NIR)，以偏最小二乘法(Partial least squares，PLS)為基礎(chǔ)，建立定量分析模型，直接測定Cur-Lys的純度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 AntarisⅡ型近紅外光譜儀(Thermo Fisher公司)，配備Version 3 SP4 Result and TQ 光譜分析軟件；LC-20AB高效液相色譜儀[島津(中國)有限公司]；ZORBAX RX-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，安捷倫公司)；EL104型分析天平[梅特勒-托利多(上海)有限公司]；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士步琦有限公司)。

姜黃素(批號：20150706，含量：95%，購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；賴氨酸(批號：15ABB002，含量：99%，購自上海味之素氨基酸有限公司)；姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品(110752-201514，含量：98.9%，中國食品藥品檢定研究院)；無水乙醇(分析純，浙江立鷹化學(xué)試劑有限公司)；甲醇、異丙醇(色譜純，美國Tedia公司)；冰醋酸(優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；實驗用水為超純水。

1.2 Cur-Lys-b型結(jié)晶對照品的制備 稱取姜黃素20 g和賴氨酸7.9 g (1∶1，mol/mol)，置于三頸瓶中，加水1 000 mL，90 ℃水浴攪拌1 h，趁熱過濾，向濾液中加無水乙醇至含乙醇量為70%，攪拌，過濾，濾液于60 ℃水浴條件下減壓回收乙醇至溶液體積減為100 mL，過濾，沉淀溶解于80 ℃水中，濾去不溶物，濾液冷卻至室溫，過濾，即得Cur-Lys-b型結(jié)晶對照品，以下簡稱b型對照品。

1.3 b型對照品的純度分析 b型對照品中主要有關(guān)物質(zhì)為游離態(tài)的Cur。Lys易溶于水，因此在重結(jié)晶過程中已除去。Cur-Lys-b型結(jié)晶易溶于水，不溶于無水乙醇；而Cur可溶于無水乙醇(溶解度約為10 mg/mL)。因此采用乙醇為溶劑，將b型對照品中游離的Cur提取出來，進行定量分析，從而計算b型對照品的純度。稱取b型對照品約1 g，加無水乙醇50 mL，恒溫振蕩24 h，過濾。濾液于水浴鍋上揮干，加甲醇1 mL溶解完全，過0.22 μm微孔濾膜，進HPLC分析。色譜條件：色譜柱ZORBAX RX-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇-0.4%醋酸溶液-異丙醇(27∶54∶19)，流速1 mL/min，測定波長420 nm，柱溫30 ℃。Cur含量測定結(jié)果見圖1。經(jīng)計算，游離態(tài)的Cur在無水乙醇中的濃度為4 μg/mL，遠小于其溶解度(10 mg/mL)，因此，認為混在結(jié)晶中的游離態(tài)Cur已經(jīng)提取完全。經(jīng)計算，b型對照品的純度為99.98%。

圖1 Cur對照品和b型對照品HPLC圖譜 注：1.Cur對照品，2.b型對照品；a.Cur色譜峰

1.4 不同含量b型結(jié)晶制備及紅外光譜收集 精密稱取b型結(jié)晶適量，加入Cur適量，混勻，分別得到b型結(jié)晶含量為100%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%和5%的混合物，過80目篩，即得混合物樣品。

取b型對照品和混合物樣品各5 g，于60 ℃減壓干燥12 h，過80目篩，統(tǒng)一裝入樣品杯中，墊實，采集光譜。采樣方式：Sab IR漫反射光纖。采集條件：掃描次數(shù)64次，分辨率8 cm-1，掃描范圍4 000～10 000 cm-1，每個樣品采集3張光譜，計算平均光譜以建立模型，數(shù)據(jù)格式為lg(1/R)，每次掃描前振蕩樣品杯。紅外光譜圖見圖2。

圖2 不同含量b型結(jié)晶紅外光譜圖匯總(n=60)

2 結(jié)果

2.1 模型的建立

2.1.1 異常點的剔除 由于實驗環(huán)境、儀器自身等因素，致使部分樣品的測定結(jié)果出現(xiàn)異常，從而使模型的準(zhǔn)確度和精密度下降。采用相關(guān)性對照檢驗及參考馬氏距離(杠桿值)等方法對結(jié)果進行評價，可有效剔除異常點[9]。線性回歸圖(圖3A)橫坐標(biāo)為實際值，縱坐標(biāo)為預(yù)測值，落在回歸線上或離回歸線很近的點，說明預(yù)測值與實際值一致或者很接近，離回歸線過遠的點即為異常點。馬氏距離圖(圖3B)在優(yōu)化建模參數(shù)時作為輔助參考指標(biāo)，圖中標(biāo)注的黑色圓點，超出直線標(biāo)示的范圍，代表馬氏距離過大，判定為異常點。

圖3 線性回歸法和馬氏距離法剔除異常點 注：A.線性回歸，B.馬氏距離

2.1.2 模型建立 剔除異常點后，首先運用Version 3 SP4 Result and TQ 光譜分析軟件進行光譜范圍分析，發(fā)現(xiàn)譜區(qū)的差異主要集中在6 449.9～4 597.2 cm-1范圍，因此，選定此范圍作為PLS建模效果最優(yōu)的光譜范圍。由于檢測過程易受環(huán)境因素的影響(如溫度等)，從而使結(jié)果產(chǎn)生偏差。因此需要對光譜進行預(yù)處理，以去除干擾，擴大有效信息，提高模型的精確度。采用矢量歸一化(Normalizaition Vector，SNV)處理及多元散射校正(Multiple Scatter Correction，MSC)處理，分別達到了消除光程差異和消除基線漂移的效果。在比較原始圖譜、一階導(dǎo)數(shù)、二階導(dǎo)數(shù)后，增加了移動窗口最小二乘多項式平滑(Savitzky-Golay Smoothing，SG)平滑、Norris平滑兩種平滑方式與求導(dǎo)聯(lián)用，進一步提升優(yōu)化效果。見表1。

經(jīng)對比，發(fā)現(xiàn)原始圖譜階導(dǎo)數(shù)+Norris平滑組的處理效果最好，RMSECV最小，R2優(yōu)于其他模型，故選擇該模型作為b型結(jié)晶的定量模型，其校正曲線如圖4A所示。模型的主因子數(shù)是模型建立的一個重要的指標(biāo)，選取的主因子數(shù)越多，引入噪聲的可能性越大，模型越不穩(wěn)定；但主因子數(shù)過少時，易造成有效信號的遺漏，對模型的準(zhǔn)確性造成不利影響，故主因子數(shù)選擇應(yīng)適中(通常為8～10)。主因子數(shù)的選擇主要以預(yù)測殘差平方和(PRESS)及RMSECV為指標(biāo)，以兩者拐點時的主因子數(shù)為最佳主因子數(shù)。主因子數(shù)-PRESS、主因子數(shù)-RMSECV相關(guān)圖分別見圖4B、圖4C。由圖4可知，當(dāng)主因子數(shù)為8時，PRESS和RMSECV均處于拐點，因此，以主因子數(shù)為8時的模型為最優(yōu)模型。

2.2 近紅外光譜模型的驗證

2.2.1 精密度考察 取1組樣品用近紅外光譜儀重復(fù)測定6次，用已建立的定量分析模型測定b型結(jié)晶的純度，結(jié)果顯示，RSD為0.36%。

2.2.2 準(zhǔn)確性考察 校正集樣品經(jīng)外部驗證，RMSEV為0.52%，與實際含量相比，NIR測定結(jié)果平均RSD為0.35%，最大RSD為0.98%。外部驗證均方差為0.137%，與實際含量相比，NIR測定結(jié)果平均RSD為0.51%，最大RSD為0.97%。將驗證集樣品NIR結(jié)果與實際含量在95%置信區(qū)間內(nèi)進行配對t檢驗，NIR檢測與參考方法結(jié)果無顯著差異。

表1 姜黃素的校正模型

圖4 姜黃素含量測定的校正和測試模型 注：A.姜黃素NIR含測模型校正曲線，B.主因子-PRESS相關(guān)圖， C.主因子數(shù)-RMSECV相關(guān)圖

2.2.3 實際樣品含量分析 用建立的近紅外模型分析3組樣品，并將結(jié)果與實際含量比較，結(jié)果見表2，NIR方法與實際含量間無顯著差異。

表2 三組樣品分析結(jié)果(%)

3 討論

b型結(jié)晶的純度很高，且藥物共晶的制備屬于一種純化手段[10]，幾乎不涉及到其他有關(guān)物質(zhì)，主要的有關(guān)物質(zhì)為游離態(tài)的Cur(游離態(tài)的Lys易溶于水，在重結(jié)晶過程中可有效除去)。因此，選用無水乙醇可在保證b型結(jié)晶不溶解的同時，有效去除混在晶體中的游離態(tài)Cur，從而達到測定b型結(jié)晶純度的目的。本方法也可用于其他藥物共晶的純度分析。

目前可用于固態(tài)物相含量測定的方法主要有NIR、中紅外光譜法(MIR)、X射線衍射法(XRD)以及配有固態(tài)進樣器的質(zhì)譜(MS)。其中，NIR方法較為成熟，儀器及使用成本最低，已得到廣泛的應(yīng)用，因此，本研究采用NIR的方法。

PLS通過最小化誤差的平方和找到一組數(shù)據(jù)的最佳函數(shù)匹配，易于辨別系統(tǒng)信息與噪聲，是NIR建模的常用算法[11]。通過對NIR圖譜共振峰進行求導(dǎo)，可將共振峰銳化，使原本難以分離的峰可以分離，從而減少噪聲的干擾；二階導(dǎo)數(shù)是在一階導(dǎo)數(shù)的基礎(chǔ)上再進行一次求導(dǎo)，減少噪聲的效果更好。但是由于b型結(jié)晶的純度高、有關(guān)物質(zhì)少，不屬于復(fù)雜體系，求導(dǎo)后反而會消除過多的有效信號，從而使模型的辨識度下降，導(dǎo)致準(zhǔn)確度降低。因此，在進行模型篩選時，應(yīng)以RMSECV、R2及主因子數(shù)等作為評價指標(biāo)，來判斷模型的優(yōu)劣。

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Near infrared spectroscopy used for content analysis of curcumin-lysine cocrystal

WU Xu-ming1,CHI Zong-liang2*,CAI Bao-chang2,3

(1.the First Hospital of Zhejiang University of TCM,Hangzhou 310053,China;2.Nanjing Haichang Chinese Medicine Group Co.,Ltd,Nanjing 210044,China;3.Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing,Nanjing 210049,China)

Objective To discuss the feasibility of near infrared (NIR) in the content analysis of the extraction of curcumin-lysine cocrystal.Methods Sixty b-type crystals of different contents were prepared,and the contents of Cur were detected by solvent extraction and high performance liquid chromatography (HPLC),then NIR spectrums were collected.Partial least squares (PLS) was used to build the correction model.Results RMSECV of the correction model which was handled by Noriss smoothing was 3.456,and the correlation coefficient (r) was 0.988,which indicated that original spectrum processed through Noriss smoothing was better than other methods.Conclusion NIR model based on PLS is reliable and accurate for content analysis of pharmaceutical cocrystal.

Pharmaceutical cocrystal;Curcumin;Lysine;NIR;PLS

2016-08-26

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，杭州 310053；2.南京海昌中藥集團有限公司，南京 210044；3.江蘇省中藥炮制重點實驗室，南京 210049

全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室(徐錫山名老中醫(yī)傳承工作室)建設(shè)項目(國中醫(yī)藥人教發(fā)〔2013〕47號)

10.14053/j.cnki.ppcr.201704023

*通信作者