一株真菌的發(fā)酵液對(duì)番茄抗鹽的促進(jìn)作用及菌株初步鑒定

劉國(guó)麗，龔 娜，陳 珣，王 娜

(1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物工程中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161； 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

一株真菌的發(fā)酵液對(duì)番茄抗鹽的促進(jìn)作用及菌株初步鑒定

劉國(guó)麗1，龔 娜1，陳 珣1，王 娜2，*

(1.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物工程中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161； 2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境資源研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161)

為篩選獲得能提高番茄耐鹽性的真菌發(fā)酵液，試驗(yàn)采用真菌的發(fā)酵液處理75 mmol·L-1Ca(NO3)2脅迫下的番茄種子，通過(guò)測(cè)定種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，選擇對(duì)種子發(fā)芽有促進(jìn)作用的菌株發(fā)酵液，研究其對(duì)Ca(NO3)2處理下番茄幼苗根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量等農(nóng)藝性狀指標(biāo)及植株內(nèi)源激素等的影響，結(jié)果顯示，其中部分菌株發(fā)酵液能不同程度地提高番茄種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，并能提高根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量；結(jié)合種子發(fā)芽指標(biāo)及幼苗干質(zhì)量和內(nèi)源激素含量來(lái)看，其中菌株DL12發(fā)酵液處理綜合效果最好，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、株高、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量較對(duì)照分別提升了29%、200%、17.6%、26.8%、18.9%。DL12處理后葉片中IAA含量是對(duì)照組的49.6倍。采用真菌通用引物ITS1和ITS2擴(kuò)增菌株DL12 18S rDNA序列，并與GenBank已知序列比對(duì)后，結(jié)果顯示，菌株DL12與Schizophyllumcommune相似度達(dá)到99%，推測(cè)菌株DL12是Schizophyllum屬真菌。

番茄；抗鹽；真菌；發(fā)酵液

近年來(lái)，我國(guó)設(shè)施番茄栽培發(fā)展迅速，已成為農(nóng)民增收的重要途徑之一。然而，由于設(shè)施栽培是封閉栽培方式，缺少自然雨水淋洗，高溫、高濕且通氣不良，設(shè)施農(nóng)田土壤又長(zhǎng)期處于高集約化、高復(fù)種指數(shù)、高肥料施用量的生產(chǎn)狀態(tài)，生態(tài)環(huán)境和生產(chǎn)狀態(tài)綜合導(dǎo)致了土壤次生鹽漬化、養(yǎng)分失調(diào)、土壤酸化等諸多問(wèn)題，其中以土壤次生鹽漬化問(wèn)題最為突出[1]。并且隨著種植年限的增加，設(shè)施土壤次生鹽漬化現(xiàn)象非常普遍，在連續(xù)栽培蔬菜 3 年以上的日光溫室和塑料大棚中，土壤可溶性鹽表積現(xiàn)象比較明顯，土壤可溶性鹽積累嚴(yán)重[2]。鹽漬化導(dǎo)致的鹽害通常表現(xiàn)為生理干旱，引起蔬菜生長(zhǎng)發(fā)育不良，植株抗病性下降，病蟲害加重等后果，此外鹽漬化導(dǎo)致的鹽脅迫影響作物對(duì)養(yǎng)分的吸收，引起植物根細(xì)胞吸收土壤水分困難或是脫水[3]，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成蔬菜生長(zhǎng)受阻，產(chǎn)量降低，因此土壤鹽漬化是蔬菜栽培的重要限制因子，嚴(yán)重制約著設(shè)施蔬菜栽培的進(jìn)一步發(fā)展。

番茄是我國(guó)主要的設(shè)施蔬菜作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，易受土壤鹽漬化影響。因此探索研究解決土壤鹽漬化，緩解番茄鹽害的方法，對(duì)于提高設(shè)施園藝生產(chǎn)效率具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。而通過(guò)生物途徑使植物充分適應(yīng)鹽漬環(huán)境，以提高植物在鹽漬土壤上的生產(chǎn)力極具發(fā)展?jié)摿4-5]。

本試驗(yàn)以番茄品種L402為材料，分析比較了不同外源真菌發(fā)酵液對(duì)鹽脅迫下番茄種子發(fā)芽情況、幼苗生長(zhǎng)的影響，探討不同外源真菌發(fā)酵液對(duì)番茄鹽脅迫的緩解作用，篩選獲得緩解番茄鹽害的菌種，以期找到提高番茄耐鹽性的有效途徑，為提高番茄在鹽漬化上的生產(chǎn)力提供科學(xué)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 番茄品種

供試番茄品種為L(zhǎng)402。

1.1.2 供試菌株及發(fā)酵液的配制

從遼寧不同鹽堿環(huán)境區(qū)的土壤和植株中自行分離出真菌菌株27株。無(wú)菌操作條件下將供試菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1培養(yǎng)5 d，離心取上清，并調(diào)節(jié)發(fā)酵液濃度為干質(zhì)量1 mg·mL-1，備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

發(fā)芽試驗(yàn)：選取大小一致、飽滿的番茄種子在2% (m/V)次氯酸鈉溶液中浸泡15 min，進(jìn)行消毒，然后用去離子水將種子清洗干凈，進(jìn)行發(fā)酵液拌種處理，對(duì)照用同等體積水替代處理，晾干后，置于9 cm直徑培養(yǎng)皿中，里面鋪兩層濾紙，加入10 mL 75 mmol·L-1Ca(NO3)2，然后在25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽，每個(gè)平皿20粒番茄種子，定期補(bǔ)充水分，每天觀察統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)，共統(tǒng)計(jì)14 d。

盆栽試驗(yàn)：盆栽試驗(yàn)于塑料花盆中進(jìn)行，每盆種一穴，每穴單株種植。當(dāng)長(zhǎng)至3葉1心時(shí)，用不同的發(fā)酵液噴淋番茄幼苗的葉片并至根部，共噴 30 mL 1 mg·mL-1發(fā)酵液，開始進(jìn)行發(fā)酵液處理，對(duì)照組噴淋同等體積水。7 d后，每3 d每穴澆30 mL 75 mmol·L-1Ca(NO3)2，開始鹽脅迫處理，共澆10次，每個(gè)處理3個(gè)平行。鹽處理結(jié)束后取樣，測(cè)定番茄植株生物量、內(nèi)源激素等指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定方法

發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率按下列公式：發(fā)芽率=總發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%；發(fā)芽勢(shì)=前3 d發(fā)芽的種子數(shù)/種子總數(shù)×100%。

植株生物量的測(cè)定：首先，將番茄植株從花盆中連根取出，用去離子水小心沖洗，并保持根系的完整。按地上部和地下部分開，置于鼓風(fēng)干燥箱中105 ℃下殺青 30 min，于80 ℃下烘干至恒質(zhì)量，稱得干質(zhì)量。

內(nèi)源激素提取與檢測(cè)[6-7]：采集盆栽試驗(yàn)后的番茄幼苗葉片，提取內(nèi)源激素樣品，并用0.22 μm孔徑的有機(jī)濾膜過(guò)濾，棄去初濾液，續(xù)濾液作為樣品溶液。檢測(cè)條件：運(yùn)行緩沖液75 mmol·L-1硼砂緩沖液(pH 9.0)；檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm；分離電壓20 kV。

1.2.3 菌株ITS序列擴(kuò)增與測(cè)序

將篩選到的菌株接種至PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃搖床150 r·min-1培養(yǎng)36 h，采用真菌DNA 試劑盒提取菌株總DNA，菌株DNA提取后，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，并通過(guò)微量核酸定量?jī)x檢測(cè)其濃度。采用真菌通用引物ITS1和ITS2擴(kuò)增18S rDNA 的ITS區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。將測(cè)得的序列與GenBank已知序列進(jìn)行BLAST比對(duì)(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，并利用MEGA 4.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 真菌發(fā)酵液對(duì)番茄種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響

由表1可以看出，75 mmol·L-1Ca(NO3)2脅迫下，L402種子發(fā)芽率受到了明顯的抑制，發(fā)芽速度很慢。不同真菌發(fā)酵液處理后番茄種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)表現(xiàn)差異很大，相對(duì)于對(duì)照組，部分菌株抑制了種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)，而DWJ2、DL2、DL12等顯著促進(jìn)了種子的萌發(fā)。其中DL12處理組番茄種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別比對(duì)照組高29%和200%。

2.2 真菌發(fā)酵液對(duì)番茄植株株高和生物量影響

綜合考慮真菌發(fā)酵液對(duì)發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)的影響，以發(fā)芽勢(shì)或發(fā)芽率不小于對(duì)照作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，挑選效果好的DL2、DL3等13種真菌發(fā)酵液進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。

從表2中可以看出，采用各真菌發(fā)酵液進(jìn)行噴淋處理后，對(duì)植株株高、干質(zhì)量影響各不相同，部分對(duì)種子發(fā)芽有促進(jìn)作用的菌株也能促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，說(shuō)明在一定程度上緩解了Ca(NO3)2對(duì)番茄幼苗的傷害。其中DL2、DL12、DL15、DWJ2、DWR3對(duì)番茄植株的株高和生物量積累作用較大，顯著高于對(duì)照。

2.3 DL12發(fā)酵液處理對(duì)番茄幼苗內(nèi)源激素的影響

表1 真菌發(fā)酵液對(duì)番茄種子發(fā)芽率及發(fā)芽勢(shì)的影響

Table 1 Effects of fungus fermentation liquid on germination rate and germination potential of tomato seeds

菌株編號(hào)No.發(fā)芽率Germinationrate/%發(fā)芽勢(shì)Germinationpotential/%DL143.31.7DL250.08.3DL365.013.3DL433.31.7DL536.711.7DL731.710.0DL951.75.0DL1153.36.7DL1266.715.0DL1323.30.0DL1541.76.7DWJ263.311.7DWR141.70DWR251.76.7DWR356.713.3DWR446.73.3XN118.30XN443.30XN536.71.7XN631.70XN740.03.3XN845.05.0XN1050.06.7XN1156.78.3XN1225.00XN1345.00XN1938.33.3CK51.75.0

表2 真菌發(fā)酵液噴淋對(duì)番茄植株株高和生物量的影響

Table 2 Effects of fungus fermentation liquid on plant height， root dry weight and seedling dry weight of tomato

菌株編號(hào)No.株高Plantheight/cm根干質(zhì)量Rootdryweight/g苗干質(zhì)量Seedlingdryweight/gDL217.17cd0.457bc2.097cdDL314.40a0.359a1.627aDL515.83abc0.383a1.857abcDL714.43a0.390a1.700abDL914.57ab0.413ab1.697abDL1116.07bc0.407ab1.833abcDL1218.23d0.511cd2.197dDL1518.03d0.483cd2.260dDWJ218.06d0.541d2.220dDWR216.16bc0.390a1.807abcDWR318.13d0.490cd1.973bcdXN1016.00bc0.420ab1.767abXN1115.57ab0.392a1.880abcCK15.50ab0.403ab1.847abc

表中同列數(shù)據(jù)后無(wú)相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。

Values within a column followed by different lowercase letters indicate the significant difference (P<0.05).

植物激素通常作用于植物激素受體，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)下游基因表達(dá)和相應(yīng)的生理生化反應(yīng)，進(jìn)而影響根、莖、葉、花、果實(shí)等器官的形態(tài)建成[8]。生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)是植物的內(nèi)源激素，可促進(jìn)或抑制與種子萌發(fā)有關(guān)酶類的活性從而調(diào)節(jié)代謝進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)或抑制種子的萌發(fā)和早期生長(zhǎng)。通過(guò)檢測(cè)DL2、DL12、DL15、DWJ2、DWR3發(fā)酵液對(duì)番茄植株內(nèi)源激素含量的影響，結(jié)果見表3和圖1，DL12、DL15、DWJ2均檢測(cè)到IAA，同等條件下未檢測(cè)到ABA。只有DL2檢測(cè)到ABA含量0.431 μg·mL-1。DWR3未檢測(cè)到ABA和IAA。DL12發(fā)酵液處理后有效提高了葉片中IAA的濃度，為14.473 μg·mL-1，而對(duì)照組檢測(cè)結(jié)果僅為0.290 μg·mL-1，DL12發(fā)酵液處理番茄葉片IAA含量是對(duì)照組的49.9倍。

表3 真菌發(fā)酵液對(duì)番茄葉片內(nèi)源激素含量的影響

Table 3 Effect of fermentation liquid on endogenous hormones content in tomato leaves

樣品編號(hào)No.吲哚乙酸含量IAA/(μg·mL-1)脫落酸含量ABA/(μg·mL-1)DL2—0.431DL1214.473—DL150.075—DWJ20.220—DWR3——CK0.290—

“—”表示未檢測(cè)到。

“—”stands for no detection.

a、b、c依次為標(biāo)準(zhǔn)品、DL12處理、CK組葉片圖譜a， Standard sample; b， HPCE chromatograms of IAA in tomato leaves treated by fermentation liquid of DL12; c， CK圖1 番茄葉片中IAA毛細(xì)管電泳圖譜Fig.1 The HPCE chromatograms of IAA in tomato leaves

2.4 菌株ITS rDNA序列分析

利用ITS1和ITS2 rDNA特異引物對(duì)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的目的DNA片段，利用Blast軟件與GenBank的序列進(jìn)行同源性比較(圖2)，結(jié)果顯示菌株DL12與Schizophyllumcommune相似度達(dá)到99%，初步推測(cè)DL12為Schizophyllum屬真菌。

圖2 菌株DL12基于ITS rDNA 序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain DL12 and other reference species

3 結(jié)論與討論

通過(guò)比較篩選不同來(lái)源的真菌發(fā)酵液對(duì)番茄發(fā)芽及生物量等指標(biāo)的作用，獲得一株對(duì)Ca(NO3)2脅迫下番茄發(fā)芽和生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的菌株DL12，DL12發(fā)酵液處理后能提高Ca(NO3)2脅迫下番茄種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)，較對(duì)照分別提升了29%、200%；株高、根干質(zhì)量、苗干質(zhì)量較對(duì)照分別提升了17.6%、26.8%、18.9%。內(nèi)源激素檢測(cè)表明，DL12能明顯提高幼苗的內(nèi)源激素IAA含量。

目前我國(guó)耕地面積不斷減少，土地鹽堿化不斷惡化，通過(guò)生物途徑使植物充分適應(yīng)鹽漬環(huán)境，增強(qiáng)植株對(duì)鹽堿的耐受范圍，以提高植物在鹽漬土壤上的生產(chǎn)力極具發(fā)展?jié)摿Γ蔀辂}漬化土地的利用提供新的途徑。近年來(lái)，關(guān)于鹽脅迫下促生菌的報(bào)道越來(lái)越多，涉及很多屬種，包括細(xì)菌、真菌等[9-15]。但關(guān)于Schizophyllum屬菌株與植物促生抗逆的報(bào)道較少，僅李莎[16]報(bào)道了分離得到的一株Schizophyllum屬TTS-5菌株，不僅對(duì)立枯絲核菌有拮抗作用，接種至油松幼苗后，油松苗成活率、生長(zhǎng)狀況及根系活力均高于對(duì)照。本試驗(yàn)結(jié)果表明，DL12發(fā)酵液處理可以提高番茄種子在Ca(NO3)2脅迫下的萌發(fā)，噴淋處理后，可以促進(jìn)幼苗的生長(zhǎng)，顯著影響番茄植株的內(nèi)源激素含量，緩解鹽脅迫對(duì)番茄幼苗的毒害作用，從而增強(qiáng)番茄對(duì)鹽脅迫的抗性。本試驗(yàn)為提高設(shè)施蔬菜在鹽漬化土地上的抗性提供了新的思路和方法。

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[16] 李莎.外生菌根真菌和熒光假單胞菌對(duì)油松生長(zhǎng)和抗病性的影響[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011. LI S. Effects of ectomycorrhiza fungi andPseudomonasfluorescenstoPinustabulaeformisgrowth and disease resistance[D]. Yangling: Northwest A&F University， 2011. (in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 張 韻)

Promotion effect of fungus DL12 fermentation liquid on salt-resistance ability of tomato and primary identification of strain

LIU Guoli1， GONG Na1， CHEN Xun1， WANG Na2，*

(1.CenterofMicrobialEngineering，LiaoningAcademyofAgriculturalSciences，Shenyang110161，China；2.InstituteofPlantNutrientsandEnvironmentalResources，LiaoningAcademyofAgriculturalSciences，Shenyang110161，China)

In order to screen fungi that could improve the salt-resistance ability ofLycopersiconesculentum， firstly， the fermentation liquid of different fungi were used to treat the seeds ofLycopersiconesculentumunder 75 mmol·L-1Ca(NO3)2stress. Then the seedlings were sprayed by fermentation liquid of different fungi which had good effects on germination of seeds through evaluation of germination rate and germination potential. The plant height and biomass of seedlings after treatment were recorded. Effect of fermentation liquid from strains DL2， DL12， DL15， DWJ2， DWR3 on endogenous hormones content of seedlings were also measured through HPCE chromatograms. Results showed that several fungi strains could partially improve germination rate and germination potential of seeds， and increase the dry weight. DL12 had the best effects among all the fungi. The germination rate， germination potential of seeds， plant height， root dry weight， and seedling dry weight were increased by 29%， 200%， 17.6%， 26.8%， 18.9%， respectively， compared with the control group. The IAA content was 49.6 times of the control group. The fungus general primers ITS1 and ITS2 were used to amplify 18S rDNA sequences of strain DL12， and alignment with the known sequences from GenBank was carried out， results showed that the similarity between strain DL12 andSchizophyllumcommunewas 99%. It was concluded that DL12 may belong toSchizophyllumsp.

tomato; salt-resistance; fungus; fermentation liquid

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.13

2016-12-21

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014027026)；遼寧省科學(xué)事業(yè)公益研究基金項(xiàng)目(2015002006)

劉國(guó)麗(1986—)，女，山東菏澤人，碩士，助理實(shí)習(xí)員，從事植物內(nèi)生菌方向研究。E-mail: liugl12@163.com

*通信作者，王娜，E-mail: wnsxh1999@126.com

S182

A

1004-1524(2017)04-0605-06

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 605-610

劉國(guó)麗，龔娜，陳珣，等. 一株真菌的發(fā)酵液對(duì)番茄抗鹽的促進(jìn)作用及菌株初步鑒定[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(4)： 605-610.