冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析

何祥祥，楊 華，戴寶玲，夏效東，肖英平，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析

何祥祥1，2，3，楊 華2，3，戴寶玲2，3，夏效東1，肖英平2，3，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省植物有害生物防控省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江 杭州 310021)

動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展過程中抗生素的長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致耐藥菌的快速發(fā)展。這些耐藥菌在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中逐漸被抗生素篩選，在動(dòng)物性食品生產(chǎn)鏈中容易被攜帶傳播，對(duì)人類食品安全產(chǎn)生很大的威脅。試驗(yàn)選取浙江省紹興市8個(gè)大型超市和11個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)銷售的冷鮮雞為檢測(cè)對(duì)象，采用PCR和測(cè)序驗(yàn)證的技術(shù)手段，對(duì)冷鮮雞表面微生物中的2種磺胺類耐藥基因sulⅠ、sulⅡ和8種喹諾酮類基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA與oqxB進(jìn)行檢測(cè)。在所檢測(cè)的樣品中，檢測(cè)出sulⅠ、sulⅡ、qnrD、qnrS、qepA和oqxB基因，檢出率分別為100%、100%、100%、89.5%、100%和89.5%。并對(duì)所檢出的耐藥基因進(jìn)行測(cè)序和NCBI收錄的耐藥基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)驗(yàn)證，比對(duì)結(jié)果同源性分別為100%、99.44%、100%、92.74%、99.82%和100%。試驗(yàn)結(jié)果將為冷鮮雞中耐藥基因的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供有力支持。

冷鮮雞；細(xì)菌；磺胺類；喹諾酮類；耐藥基因

目前國(guó)內(nèi)多數(shù)城市如上海、北京和杭州已經(jīng)全面禁止活禽買賣交易[1]，冷鮮雞因其肉質(zhì)純熟，適合烹飪和口味鮮美的特點(diǎn)代替了“活殺雞”走向百姓的餐桌[2]。然而，在禽類養(yǎng)殖中抗生素的普遍使用引起了人們較大的關(guān)注[3-6]?？咕幬镌跉W洲[7-8]和北美[9]已經(jīng)被廣泛使用了近半個(gè)世紀(jì)，在提高肉制品產(chǎn)量的同時(shí)也導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生[10-11]。例如Yildirim等[12]在200份零售的冷鮮雞中分離出68株沙門氏菌，通過對(duì)耐藥基因的檢測(cè)，這些沙門氏菌對(duì)青霉素、苯唑西林、克林霉素、萬古霉素、紅霉素和氨芐西林等抗生素具有不同程度的耐藥性，同時(shí)也有半數(shù)以上的沙門氏菌對(duì)四環(huán)素、鏈霉素、新霉素和頭孢霉素產(chǎn)生耐藥性。動(dòng)物性食品中耐藥性基因的出現(xiàn)引起了人們的極大關(guān)注，因?yàn)槟退幮曰蚴峭ㄟ^可移動(dòng)的介質(zhì)比如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子或染色體[13-14]來傳播，另外抗生素耐藥基因也可以在細(xì)菌之間相互傳播[15]。冷鮮雞在從養(yǎng)殖到宰殺、運(yùn)輸儲(chǔ)藏再到消費(fèi)者餐桌上[16-17]的過程的產(chǎn)業(yè)鏈中也會(huì)攜帶大量的耐藥細(xì)菌，對(duì)食品安全和人們的健康將產(chǎn)生很大的威脅[18]。

本試驗(yàn)從浙江紹興市19個(gè)不同的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市分別采冷鮮雞，然后通過直接提取表面微生物的DNA，通過PCR擴(kuò)增耐藥基因的方法，檢測(cè)總細(xì)菌的耐藥性。試驗(yàn)結(jié)果將為冷鮮雞表面微生物的耐藥監(jiān)測(cè)提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

19只冷鮮雞樣品于2016年8月6日采自浙江省紹興市的8個(gè)大型超市和11個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，編號(hào)為1～19。

1.1.2 儀器與試劑

PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)bio-rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)bio-rad公司)，微量核酸蛋白分析儀(Thermo Fisher公司)。BPW培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)，微生物基因組DNA提取試劑盒(Zymo Research Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將從市場(chǎng)上采集來的冷鮮雞放置于無菌袋中，按照每500 g冷鮮雞加入500 mLBPW沖洗液，密封后于搖床上振蕩(200 r·min-1)15～20 min，然后取50 mL沖洗下來的BPW溶液于37 ℃烘箱，培養(yǎng)12 h。

1.2.2 基因組DNA提取

將增菌后的BPW沖洗液按照微生物基因組DNA提取試劑盒(Zymo Research Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM)說明書，提取總細(xì)菌DNA。然后用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀(Nanodrop)對(duì)所提取的DNA進(jìn)行含量和純度(D260/D280)的測(cè)定。

1.2.3 耐藥基因的PCR擴(kuò)增

本試驗(yàn)從磺胺類和喹諾酮類耐藥基因中共選取了10種耐藥基因，其中包括2種磺胺類基因(sulⅠ、sulⅡ)和8種喹諾酮類基因(qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA和oqxB)。所用引物參照文獻(xiàn)[19]，見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，5 min預(yù)變性，然后94 ℃，30 s，58 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共32個(gè)循環(huán)；最后16 ℃保存。擴(kuò)增反應(yīng)后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并成像。

表1 PCR反應(yīng)引物

Table 1 PCR primers used in this study

目的基因Targetgene引物序列(5’-3’)Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度Length/bpsulⅠF:CGCACCGGAAACATCGCTGCACR:TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG163sulⅡF:TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGGR:CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG191qnrAF:AGAGGATTTCTCACGCCAGGR:TGCCAGGCACAGATCTTGAC580qnrBF:GGATGAAATTCGCCACTGR:TTTGCGCGCCAGTCGAA264qnrCF:GGGTTGTACATTTATT-GAATCGR:CACCTACCCATTTATTTTCA307qnrDF:CGAGATCAATTTACGGGGAA-TAR:AACAAGCTGAAGCGCCTG465qnrSF:GCAAGTTCATTGAACAGGGTR:TCTAAACCGTCGAGTTCGGCG428qepAF:CCAGCTCGGCAACTTGATACR:ATGCTCGCCTTCCAGAAAA570oqxAF:CTCGGCGCGATGATGCTR:CCACTCTTCACGGGAGACGA392oqxBF:TCCTGATCTCCATTAACGCCCAR:ACCGGAACCCATCTCGATGC131

1.2.4 檢出耐藥基因的測(cè)序和序列比對(duì)

將目的條帶割膠后送至杭州浩基生物公司，對(duì)PCR產(chǎn)物切膠回收，加尾后和pGM-Simple-T Fast Vector進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將返回的測(cè)序結(jié)果通過NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取和耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)浙江省某市超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上共19只冷鮮雞的表面微生物提取總DNA如圖1，然后以總DNA為模板，對(duì)10種耐藥基因的檢測(cè)，共檢測(cè)出6種耐藥基因如表2和圖2。其中包括2種磺胺類耐藥基因(sulⅠ、sulⅡ)和4種喹諾酮類耐藥基因(qnrD、qnrS、qepA、oqxB)。

2.2 被檢出的耐藥基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLAST進(jìn)行序列同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)到的耐藥基因PCR產(chǎn)物與以往文獻(xiàn)報(bào)道的耐藥基因有較高的同源性。在BLAST中進(jìn)行的序列比對(duì)同源性結(jié)果如表3。

M，DNA Marker(DL5000); 1～8分別為來自大型超市的樣品M, DNA ladder; 1-8, Samples from supermarkets圖1 基因組DNA電泳圖Fig.1 Electrophoretic results of genome DNA

表2 耐藥基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

Table 2 The PCR results of antibiotic genes

耐藥基因Drugresistancegene檢出率Detectionrate/%超市樣品Samplesfromsupermarket農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)樣品Samplesfromfarmersmarket磺胺類sulⅠ100100SulfonamidessulⅡ100100喹諾酮類qnrA00QuinolonesqnrB00qnrC00qnrD100100qnrS10081.8qepA100100oqxA00oqxB87.590.9

M: DNA marker(DL5000); 1～8:來自大型超市的樣品M: DNA ladder; 1-8: Samples from supermarkets圖2 耐藥基因電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of antibiotic resistance gene

表3 耐藥基因序列同源性比對(duì)結(jié)果

Table 3 The results of antibiotic resistance gene sequences comparing to ones who have been deposited into the GenBank

耐藥基因DrugresistancegeneNCBI中基因序列號(hào)AccessionnumberinGenBank相似度Similarity/%sulⅠJN003421100sulⅡHQ44116999.44qnrDHM056769100qnrSHQ64066192.74qepAFJ74412199.82oqxBHQ674771100

3 結(jié)論與討論

由于抗生素的大量使用，導(dǎo)致家禽養(yǎng)殖中細(xì)菌耐藥性的提高。岳磊等[20]對(duì)廣東地區(qū)分離得到的84株雞源腸桿菌進(jìn)行藥敏檢測(cè)，結(jié)果表明，這些雞源腸桿菌對(duì)氟羅沙星(98.8%)，恩諾沙星(84.5%)等喹諾酮類抗生素產(chǎn)生不同程度的抗性?；前奉愃幬镌诩仪蒺B(yǎng)殖中，主要被用來治療和預(yù)防雞白痢。然而近些年的廣泛使用，逐漸造成雞白痢沙門氏菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥性[21]。董洪燕等[22]對(duì)江蘇東臺(tái)地區(qū)分離得到的33株雞白痢沙門氏菌檢測(cè)，94.4%的菌株含有耐藥基因sulⅠ。寧家寶等[23]對(duì)珠江三角洲地區(qū)分離到的69株雞白痢沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，其中sulⅠ和sulⅡ基因的檢出率分別為33.3%和79.7%。

本試驗(yàn)所選取的2個(gè)磺胺類耐藥基因和8個(gè)喹諾酮類耐藥基因，具有一定的代表性。這些耐藥基因在家禽類的養(yǎng)殖中較為常見，對(duì)于細(xì)菌耐藥基因在環(huán)境中的傳播、擴(kuò)散具有一定的指示作用。本試驗(yàn)沒有采用細(xì)菌的分離培養(yǎng)的方法，而是直接對(duì)冷鮮雞表面總細(xì)菌進(jìn)行DNA的提取，對(duì)具有代表性的磺胺類和喹諾酮類耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳，共有6種基因被檢測(cè)出來，經(jīng)過序列比對(duì)后，所檢出的基因相似度均在92.74%以上，說明檢測(cè)結(jié)果可靠。其中包括2種磺胺類耐藥基因(sulⅠ、sulⅡ)和3種喹諾酮類耐藥基因(qnrS、qnrD、qepA、oqxB)。從電泳圖中亮度可以看出，sulⅠ、sulⅡ、qnrD、qnrS和oqxB基因在樣本間的差異不大，qepA在樣品間的差異較大。這可能與樣品采自不同市場(chǎng)有關(guān)。而其他5個(gè)喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrC、oqxA、oqxB)均未檢出。

細(xì)菌的耐藥性與耐藥基因產(chǎn)生的關(guān)系。微生物的耐藥基因的產(chǎn)生一方面來源于微生物固有的耐藥基因，另一方面來源于自身基因突變或通過微生物之間的的接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等相互作用而獲得[24-25]。細(xì)菌的抗生素耐藥基因主要有三種作用機(jī)制，第一種是通過產(chǎn)生抗生素的水解酶，使抗生素失去活性或分解。比如aac(6’)-Ib-cr可以編碼滅活酶，使喹諾酮類抗生素滅活而失去活性[26]。第二種是通過改變抗生素作用的靶點(diǎn)，降低抗生素與細(xì)菌的結(jié)合能力，這種方式比較普遍。比如四環(huán)素耐藥基因tetM、tetW、tetO、tetQ介導(dǎo)的耐藥機(jī)制就是通過產(chǎn)生的核糖體保護(hù)蛋白，抑制核糖體與四環(huán)素的相互作用[27]。第三種機(jī)制是通過改變細(xì)菌膜的通透性而形成藥物外排系統(tǒng)，將藥物外排，使得菌體內(nèi)抗生素達(dá)不到有效作用濃度。比如tetC等基因介導(dǎo)的耐藥機(jī)制[27]。

綜合本試驗(yàn)對(duì)磺胺類和喹諾酮類耐藥基因的檢測(cè)結(jié)果，可以得出家禽養(yǎng)殖場(chǎng)的耐藥基因可能會(huì)通過微生物攜帶到冷鮮雞的表面，對(duì)消費(fèi)者的健康會(huì)產(chǎn)生一定的影響。另一方面，養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素殘留和耐藥基因產(chǎn)生的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究，這對(duì)于分析耐藥基因的產(chǎn)生是由于自然因素還是人為因素導(dǎo)致的，意義重大。

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(責(zé)任編輯 張 韻)

Detection of the antibiotic genes of sulfonamides and quinolones of bacteria in refrigerated chicken

HE Xiangxiang1，2，3， YANG Hua2，3， DAI Baoling2，3， XIA Xiaodong1， XIAO Yingping2，3，*

(1.CollegeofFoodScienceandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China；2.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China；3.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

The long-term use of antibiotics in the animal farming industry has caused rapid expansion of drug resistant bacteria. These drug resistant bacteria are screened during the process of animal farming， and are easily transmitted in the animal production chain， which is a huge threat to human’s food safety. In this study， we aimed at testing the safety of refrigerated chicken collected from eight supermarkets and eleven agricultural markets in Shaoxing city， Zhejiang Province. We detected the antibiotic genes of sulfonamides and quinolones of surface microorganisms of the samples by PCR reaction and sequencing. We detectedsulⅠ，sulⅡ，qnrD，qnrS，qepAandoqxBin the samples and the detection rate was 100%， 100%， 100%， 89.5%， 100% and 89.5%， respectively. We also sequenced the antibiotic genes with the sequences in NCBI and the coincidence rate was 100%， 99.44%， 100%， 92.74%， 99.82% and 100%， respectively. This study will provide effective support for risk assessment of antibiotic genes in the refrigerated chicken.

refrigerated chicken; bacteria; sulfonamides; quinolones; drug-resistance genes

http://www.zjnyxb.cn何祥祥，楊華，戴寶玲，等. 冷鮮雞污染微生物磺胺類和喹諾酮類耐藥基因分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(4)： 555-559.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.04.06

2016-11-07

浙江省公益技術(shù)運(yùn)用研究項(xiàng)目(2016C32073)；浙江省植物有害生物防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地(2010DS700124-ZM1608)

何祥祥(1991—)，男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail:xianghe2009@126.com

*通信作者，肖英平，E-mail: ypxiaozju@126.com

S879.2

A

1004-1524(2017)04-0555-05

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(4): 555-559