胃泌素釋放肽受體拮抗劑RC—3095通過抑制TLR4途徑減輕小鼠肝缺血再灌注損傷的研究

孫璐+陸葉蘭+簡(jiǎn)春燕+馮慧+陳明生+曹利軍

[摘要] 目的 本文觀察胃泌素釋放肽（GRP）受體（R）在肝缺血再灌注損傷模型中的表達(dá)情況，并探討GRP及 GRPR拮抗劑RC-3095對(duì)小鼠肝缺血再灌注損傷是否具有保護(hù)作用。 方法 構(gòu)建小鼠肝缺血再灌注損傷模型，將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、I/R再灌注后3 h組（3 h）、I/R 再灌注后6 h組（6 h）、I/R再灌注后 12 h組（12 h），觀察GRP及 GRPR在缺血再灌注引起的肝損傷中的表達(dá)情況；然后將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）、I/R組（I/R）、RC-3095干預(yù)組（RC-3095），HE染色觀察小鼠肝組織壞死程度，檢測(cè)各組小鼠外周血谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平，ELISA法檢測(cè)小鼠外周血及肝臟組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平，RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織TLR4水平。 結(jié)果 小鼠肝臟缺血再灌注損傷GRP及GRPR表達(dá)增加，6 h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)降低；RC-3095能明顯減輕肝缺血再灌注損傷模型小鼠肝臟壞死程度，抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的釋放，抑制TLR4的表達(dá)。 結(jié)論 RC-3095可以通過抑制炎癥因子的釋放起到保護(hù)肝缺血再灌注損傷，其可能的機(jī)制是抑制TLR4的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 胃泌素釋放肽受體；RC-3095；肝缺血再灌注損傷；TLR4

[中圖分類號(hào)] R657.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）04-0037-04

Study on the effect of gastrin-releasing peptide receptor antagonist RC-3095 on reducing hepatic ischemia reperfusion injury in mice by inhibiting TLR4 pathway

SUN Lu LU Yelan JIAN Chunyan FENG Hui CHEN Mingsheng CAO Lijun

Department of Anesthesiology， No. 113 Hospital of PLA， Ningbo 315040， China

[Abstract] Objective To observe the expression of gastrin-releasing peptide （GRP） receptor （R） in the model of hepatic ischemia reperfusion injury， and to explore whether GRP and GRPR antagonist RC-3095 has a protective effect on hepatic ischemia reperfusion injury in mice. Methods The model of hepatic ischemia reperfusion injury in mice was established， and the mice were randomly divided into sham group， 3h group after I/R reperfusion group （3 h）， 6 h group after I/R reperfusion （6 h） and 12 h group after I/R reperfusion （12 h）. The expression of GRP and GRPR in hepatic injury induced by ischemia reperfusion was observed. The mice were then randomly divided into sham group （sham group）， I/R group （I/R） and RC-3095 intervention group （RC-3095）， and HE staining was used to observe the degree of liver necrosis in mice. AST and ALT levels at the peripheral blood were measured in mice in each group， and the expression levels of cytokines of TNF-α， IL-6 and IL-1β in peripheral blood and liver tissues were tested by ELISA. The level of TLR4 in liver tissue was tested by RT-PCR. Results It was found that GRP and GRPR expression was increased in the mice with liver ischemia reperfusion injury， and the expression level reached a peak at 6 h， followed by a decreased expression； RC-3095 could significantly reduce the degree of liver necrosis in mice with the model of liver ischemia reperfusion injury， inhibit the release of inflammatory factors（TNF-α， IL-6 and IL-1β） and inhibit the expression level of TLR4. Conclusion RC-3095 can protect hepatic ischemia reperfusion injury by inhibiting the release of inflammatory factors， and its possible mechanism is to inhibit the expression of TLR4.

[Key words] Gastrin-releasing peptide （GRP） receptor （R）； RC-3095； Hepatic ischemia reperfusion injury； TLR4

肝缺血再灌注損傷常見于肝臟外科手術(shù)、失血性休克等臨床情況，目前研究證明，活性氧、趨化因子和炎性細(xì)胞因子，在其中發(fā)揮了重要作用，但具體的詳細(xì)機(jī)制還不是十分清楚[1-3]。胃泌素釋放肽（gastrin-releasing peptide，GRP）是一種體內(nèi)活性神經(jīng)肽，與其受體胃泌素釋放肽受體（gastrin-releasing peptide receptor，GRPR）相互作用后可發(fā)揮多種生物學(xué)功能，已有研究表明GRP-GRPR在多種炎癥性疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過阻斷GRP-GRPR反應(yīng)可以抑制炎癥發(fā)展，改善疾病的轉(zhuǎn)歸[4，5]。那么，GRP-GRPR通路在缺血再灌注引起的肝損傷中是否發(fā)揮作用，阻斷GRP與GRPR通路能否減輕肝臟損傷？查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，相關(guān)的研究還未見明確報(bào)道。因此，本研究擬建立部分肝缺血再灌注損傷小鼠模型，觀察GRP和GRPR在小鼠肝臟中的表達(dá)情況，探索GRPR拮抗劑RC-3095對(duì)小鼠肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，并初步探索其可能的作用機(jī)制。

l 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 動(dòng)物 選取C57BL雄性小鼠，年齡6～7周，體重25 g左右，購(gòu)自寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要儀器 去離子水凈水器（法國(guó)MILLIPORE公司），L500低速離心機(jī)（江蘇其林貝爾儀器制作有限公司）。

1.1.3 主要試劑 RC-3095（美國(guó)Sigma公司），Trizol（日本Takara公司），ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），RT-PCR試劑（日本TakaRa公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?選取6～7周的C57BL健康雄性小鼠，本實(shí)驗(yàn)采用70%肝臟缺血再灌注小鼠模型。動(dòng)物麻醉后，腹部消毒，沿小鼠腹部正中線剪開皮膚約1～2 cm，使用絲線從肝臟底部沿著肝門根部，活結(jié)結(jié)扎阻斷左葉和中葉的供血，將活線線頭留于腹腔外，縫合切口。待缺血1 h后抽離結(jié)扎線，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組小鼠除不結(jié)扎肝門血管外，其余操作同模型組小鼠。

1.2.2 干預(yù)方法 ①觀察GRP及 GRPR在缺血再灌注引起的肝損傷中的表達(dá)情況時(shí)，實(shí)驗(yàn)分組為：假手術(shù)組（sham組）、I/R再灌注后3 h組（3 h）、I/R 再灌注后6 h組（6 h）、I/R再灌注后 12 h組（12 h）。sham組在手術(shù)1 h后處死小鼠，其它各組分別于再灌注后3 h、6 h、12 h后處死小鼠。②在RC-3095干預(yù)時(shí)，實(shí)驗(yàn)分組：假手術(shù)組（sham組）、I/R組（I/R）、RC-3095干預(yù)組（RC-3095），根據(jù)第一部分GRP及 GRPR的表達(dá)情況，I/R組和RC-3095干預(yù)組選擇GRP及 GRPR表達(dá)的峰值時(shí)間點(diǎn)處死小鼠。RC-3095干預(yù)組在造模手術(shù)前1 h通過小鼠尾靜脈注射，劑量為3 μg/g，容積為100 μL。sham組和I/R組通過尾靜脈注射100 μL生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。

1.2.3 RC-3095的配制 RC-3095劑量為1 mg粉末，使用生理鹽水進(jìn)行稀釋，配制成原始濃度為100 μg/200 μL。

1.2.4 GRP及GRPR表達(dá)的檢測(cè) 獲取肝臟組織后，制備勻漿液，然后實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)肝臟組織中GRP及GRPR的表達(dá)水平。

1.2.5 肝臟病理分析 獲取肝臟組織，蘇木精-伊紅染色法（HE染色），鏡檢觀察各組小鼠肝組織壞死程度。由病理科兩位副主任醫(yī)師讀片并評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無(wú)壞死；1分：個(gè)別細(xì)胞壞死；2分：小于30%的細(xì)胞壞死；3分：30%～60%細(xì)胞壞死；4分：大于60%的細(xì)胞壞死[6]。

1.2.6 外周血AST、ALT的檢測(cè) 處死小鼠，心臟穿刺抽血，抽取完畢后，迅速轉(zhuǎn)移到抗凝管中，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平。

1.2.7 外周血及肝臟炎癥因子水平的檢測(cè) 處死小鼠，心臟穿刺抽血，抽取完畢后，迅速轉(zhuǎn)移到抗凝管中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)小鼠外周血TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平。獲取肝臟組織后，制備勻漿液，RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織中細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)水平。

1.2.8 RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織TLR4水平 處死小鼠，獲取肝臟組織后，制備勻漿液，RT-PCR法檢測(cè)肝臟組織中Toll樣受體4（TLR4）水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用Gradphad Prism 5.0以及SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。符合正態(tài)分布及方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析比較多組間的差異，多組之間任兩組間比較采用Dunnett檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布或方差齊性兩者任一條件的數(shù)據(jù)采用Kruskal Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)比較多組間差異，任兩組間比較采用Dunnett檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GRP及GRPR在肝缺血再灌注損傷中的表達(dá)情況

結(jié)果顯示，GRP及GRPR在肝缺血再灌注損傷中的表達(dá)上調(diào)[GRP：I/R 3 h：（6000±124） pg/mL，I/R 6 h：（8700±167）pg/mL，I/R 12 h：（5560±98） pg/mL；GRPR：I/R 3 h：（3768±157）pg/mL，I/R 6 h：（5800±306）pg/mL，I/R 12 h：（4109±108）pg/mL]，而且在6 h達(dá)到高峰，隨后表達(dá)水平降低。見圖1。

2.2 RC-3095對(duì)缺血再灌注損傷肝臟病理影響

根據(jù)圖1結(jié)果顯示，GRP及GRPR表達(dá)高峰為再灌注后6 h，所以，I/R組及RC-3095干預(yù)組處死小鼠的時(shí)間為再灌注后6 h。光學(xué)顯微鏡下放大10倍觀察，結(jié)果顯示，sham組的肝組織結(jié)構(gòu)正常；I/R組肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)大面壞死。而RC-3095干預(yù)組肝臟組織壞死程度較I/R組明顯減輕，病理評(píng)分（1±1）分明顯低于I/R組（3±1）分（P<0.05）。見封三圖4。

2.3 RC-3095對(duì)缺血再灌注損傷外周血AST、ALT的影響

I/R組及RC-3095干預(yù)組處死小鼠的時(shí)間為再灌注后6 h。結(jié)果顯示，與I/R 6 h組（ALT：2000±981 IU/L；AST：3200±870 IU/L）相比，RC-3095能顯著降低外周血的轉(zhuǎn)氨酶水平（ALT：190±98 IU/L；AST：550±120 IU/L）（P<0.01）。見圖2。

2.4 RC-3095對(duì)缺血再灌注損傷外周血及肝臟細(xì)胞因子的影響

I/R組及RC-3095干預(yù)組處死小鼠的時(shí)間為再灌注后6 h。結(jié)果顯示，在外周血中，與I/R 6 h組[TNF-α：（44.0±3.5）pg/mL；IL-6：（56.0±7.7）pg/m；IL-1β：（58.0±5.9）pg/m]相比，RC-3095組[TNF-α：（16.0±2.1 pg/mL）；IL-6：（22.0±4.7pg/m）；IL-1β：（17.0±3.5 pg/m）]的細(xì)胞因子的水平明顯降低（P<0.01）；在肝組織中，與I/R 6 h組[TNF-α：（57.0±8.3 pg/mL）；IL-6：（76.0±9.2 pg/m）；IL-1β：（403.0±31.5） pg/m]相比，RC-3095組[TNF-α：（24.0±5.1）pg/mL；IL-6：（30.0±7.3）pg/m；IL-1β：（172.0±25.3）pg/m]的細(xì)胞因子的水平明顯降低（P<0.01）。見圖3。

2.5 RC-3095對(duì)肝臟組織TLR4水平的影響

I/R組及RC-3095干預(yù)組處死小鼠的時(shí)間為再灌注后6 h。結(jié)果顯示，與I/R 6 h組（26.0±3.0 pg/mL）相比，RC-3095能顯著抑制肝臟中TLR4表達(dá)水平[RC-3095組：TLR4：（13±4）pg/mL]。見圖4。

3 討論

肝缺血再灌注損傷是各種肝臟外科手術(shù)及危急癥后引起肝臟功能異常的一個(gè)重要原因，是不同且復(fù)雜的機(jī)制共同作用的結(jié)果[1-3]。GRP具有廣泛的生物學(xué)功能，GRP能夠促進(jìn)多種細(xì)胞因子的釋放，參與免疫功能紊亂的調(diào)節(jié)以及炎癥疾病的發(fā)生發(fā)展，研究證實(shí)，GRP-GRPR通路參與了多種疾病的進(jìn)展過程[4，5]。在本研究中，GRP及GRPR在缺血再灌注引起的肝損傷中表達(dá)上調(diào)，由此推測(cè)GRP-GRPR通路可能參與了缺血再灌注損傷引起的肝損傷的發(fā)展過程。

為了驗(yàn)證上面的推論，本研究使用RC-3095來(lái)阻斷GRP-GRPR通路，RC-3095是一種GRPR特異性的阻斷劑，研究證實(shí)，其能在多種疾病中具有抑制炎癥反應(yīng)的功能[7-9]。在目前的研究中普遍應(yīng)用肝功能及肝組織病理切片是評(píng)估肝損傷程度，本研究結(jié)果顯示，與Sham相比，I/R組的轉(zhuǎn)氨酶（AST、ALT）明顯升高，而RC-3095干預(yù)組的轉(zhuǎn)氨酶明顯降低；病理切片顯示，與I/R組相比RC-3095干預(yù)組的肝組織損傷明顯減輕。這些結(jié)果一方面暗示GRP-GRPR通路參與了缺血再灌注引起的肝損傷的疾病進(jìn)展過程，另一方面也提示RC-3095能明顯減輕缺血再灌注損傷引起的肝損害。

以前的文獻(xiàn)顯示，促炎因子在缺血再灌注引起的肝損傷的疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮了重要作用[10-13]。Godwin A等[14]應(yīng)用冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白預(yù)處理方法，抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)，從而達(dá)到減輕的肝臟的損傷。Colletti LM等[15]研究通過抑制TNF-α的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)缺血再灌注損傷引起的肝損傷顯著緩解。研究發(fā)現(xiàn)，GRP作為一種神經(jīng)肽物質(zhì)，也是一種內(nèi)源性的炎性介質(zhì)，可通過與GRPR的相互作用參與炎性反應(yīng)，這種作用與IL-1β、IL-6、TNF-α密切相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用RC-3095阻斷GRP-GRPR通路后，IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯降低，這些結(jié)果表明RC-3095可能通過抑制炎癥因子的表達(dá)來(lái)起到保護(hù)缺血再灌注引起的肝損傷的作用。

前面已經(jīng)證實(shí)了RC-3095可以抑制炎癥因子的表達(dá)，為了進(jìn)一步的探究其中的可能機(jī)制，本研究檢測(cè)了肝臟組織中TLR4的表達(dá)水平。TLR4受體是一種免疫受體，廣泛表達(dá)于庫(kù)普弗細(xì)胞，肝細(xì)胞，肝星狀細(xì)胞，膽管上皮細(xì)胞，竇狀內(nèi)皮細(xì)胞和肝臟樹狀細(xì)胞（DCs）上，文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，TLR4在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[17-19]。一項(xiàng)最近的研究證實(shí)，在肝臟大面積壞死的模型中，敲除TLR4基因小鼠的炎癥因子釋放受到抑制，并且肝臟壞死的程度明顯減輕，提示TLR4途徑在肝臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[20]。本研究也顯示肝缺血壞死模型中TLR4的表達(dá)顯著升高，同時(shí)也證實(shí)RC-3095能明顯抑制肝缺血再灌注損傷TLR4表達(dá)，此結(jié)果提示RC-3095保護(hù)缺血再灌注引起的肝損傷可能是通過抑制TLR4表達(dá)，從而降低炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，本研究提示GRP-GRPR通路參與了肝缺血再灌注損傷的疾病進(jìn)展過程，同時(shí)也揭示了RC-3095減輕肝損傷可能是通過抑制TLR4表達(dá)，從而降低炎癥因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，為以后RC-3095治療肝缺血再灌注損傷提供了一定的理論依據(jù)。另外，本研究還是存在一定的缺陷，首先，未對(duì)TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路具體機(jī)制進(jìn)行研究闡述，另外，TLRs受體家族種類很多，本研究只對(duì)其中一種受體進(jìn)行了初步探討，而未涉及其它受體，存在一定的局限性；其次，因?yàn)槿毖俟嘧p傷的病理生理十分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)只觀察了某一通路的作用，這些并不能非常清楚的解釋RC-3095保護(hù)作用詳細(xì)機(jī)制，還需進(jìn)一步的闡述其它信號(hào)通路在其中的作用。

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（收稿日期：2016-11-9）