微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌丙硫異煙胺耐藥結(jié)果分析

蘇碧儀,譚耀駒,吳愛(ài)武

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微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌丙硫異煙胺耐藥結(jié)果分析

蘇碧儀1,譚耀駒2,吳愛(ài)武3

目的 以MGIT960快速藥敏法為參照，微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌丙硫異煙胺耐藥的效果。方法 采用MGIT960快速藥敏(MGIT法)和微孔板稀釋法對(duì)248株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行丙硫異煙胺藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)該藥物的耐藥性。隨機(jī)選取117株菌株進(jìn)行該藥物的11個(gè)濃度梯度(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/mL)的藥敏檢測(cè)，比較兩種方法最低抑菌濃度的一致性。結(jié)果 MGIT法的平均檢測(cè)時(shí)間為10.1 d，微孔板稀釋法檢測(cè)時(shí)間為8 d，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。與MGIT法測(cè)定結(jié)果比較，微孔板稀釋法檢測(cè)的敏感度為96.5%(55/57)，特異度為93.2%(178/191),符合率為94.0%(233/248)，Kappa值為0.84。兩種方法所獲得的MIC值的總一致率為81.2%(95/117)， 其中在MIC值<8.0 μg/mL的分離株中，兩種方法的一致率為86.3%(82/95)；在MIC值≥8.0 μg/mL的分離株中，兩種方法的一致率僅為59.1%(13/22)。結(jié)論 兩種方法對(duì)丙硫異煙胺進(jìn)行耐藥檢測(cè)有較高的一致性，但也存在一定的差異。微孔板稀釋法比MGIT法簡(jiǎn)單，快速，適合用于結(jié)核分枝桿菌對(duì)丙硫異煙胺耐藥性的快速檢測(cè)。

結(jié)核分枝桿菌；丙硫異煙胺；藥物敏感試驗(yàn)

世界衛(wèi)生組織(WHO)結(jié)核病年度報(bào)告表明，結(jié)核分枝桿菌耐多藥的比率呈上升趨勢(shì)[1]，嚴(yán)重威脅到人類的健康,成為了全球公共衛(wèi)生問(wèn)題。耐多藥是指對(duì)利福平和異煙肼同時(shí)耐藥，稱為MDR-TB，MDR-TB是由于抗生素濫用和用藥不規(guī)范造成的[2]。丙硫異煙胺是臨床上用于治療MDR-TB比較重要的二線藥物[3]，它的體外藥敏的準(zhǔn)確性和快速檢測(cè)，對(duì)控制MDR-TB的傳播很有價(jià)值。WHO把結(jié)核分枝桿菌藥敏的金標(biāo)準(zhǔn)定為“比例法”[4]，MGIT 960快速藥敏(下簡(jiǎn)稱MGIT法)就是比例法的一種，檢測(cè)時(shí)間短、準(zhǔn)確，對(duì)臨床治療有很好的指導(dǎo)作用，但由于MGIT 960快速藥敏檢測(cè)系統(tǒng)比較昂貴，阻礙了其在經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)進(jìn)行推廣。微孔板稀釋法藥敏試驗(yàn)簡(jiǎn)單，成本低，而且可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)濃度梯度[4]，在很多抗結(jié)核藥物檢測(cè)中已經(jīng)有推廣，但關(guān)于丙硫異煙胺藥敏檢測(cè)的報(bào)道比較少。本研究旨在對(duì)微孔板稀釋法與MGIT法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)丙硫異煙胺的藥敏結(jié)果進(jìn)行對(duì)比探討。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源及試劑儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株 收集廣州市胸科醫(yī)院2014年的結(jié)核分枝桿菌菌株248株，均為經(jīng)痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，菌種鑒定(基因芯片法[5])確定為結(jié)核分枝桿菌的菌株。所收集的菌株包含耐多藥株(又稱為MDR-TB，指結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼同時(shí)耐藥)占26.2%(65/248)、泛耐藥株(又稱為XDR-TB，指結(jié)核分枝桿菌對(duì)任何喹諾酮類耐藥，且至少對(duì)一種二線藥物耐藥的耐多藥株)占3.2%(8/248)[6]、單耐藥株(指結(jié)核分枝桿菌對(duì)一種一線藥物耐藥)占22.2%(55/248)、敏感株占25.4%(63/248)，其它(至少對(duì)兩種抗結(jié)核藥耐藥，但不包括MDR-TB和XDR-TB的耐藥株)占23%(57/248)。質(zhì)控菌株H37Rv由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 主要試劑 丙硫異煙胺藥物純品，購(gòu)自英國(guó)Fluorochem公司。Bactec MGIT 960培養(yǎng)管和Panta抑菌劑均由美國(guó)BD公司生產(chǎn)。Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基干粉、Middlebrook OADC 購(gòu)自美國(guó)BD公司。阿爾瑪藍(lán)(Alamar blue)顯色劑購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，用時(shí)稀釋。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 培養(yǎng)箱：湖北黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。 Bactec MGIT 960系統(tǒng)：美國(guó)BD公司生產(chǎn)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 按培養(yǎng)基配制說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.1.1 定性試驗(yàn) Bactec MGIT 960培養(yǎng)管每組2支，每支加入0.8 mL OADC增菌劑，一支為對(duì)照管，另一支為含藥管(丙硫異煙胺終濃度為2.5 μg/mL)；定量試驗(yàn)：Bactec MGIT 960培養(yǎng)管每組12支，每支加入0.8 mLOADC增菌劑，一支為對(duì)照管，另外11支為含藥管(丙硫異煙胺的濃度梯度為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 μg/mL)。

1.2.1.2 7H9液體培養(yǎng)基 4.7 g干粉加入2 mL甘油，用蒸餾水定容到900 mL，于121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后放置4 ℃保存，臨用時(shí)加入10 mL OADC增菌劑。

1.2.2 藥敏試驗(yàn)

1.2.2.1 菌懸液的制備[7]研磨菌齡為2～3周的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物，配成1個(gè)麥?zhǔn)媳葷釢舛?3×108CFU/mL)。MGIT法中，菌液作10倍和1 000倍稀釋，配成3×107CFU/mL和3×105CFU/mL。微孔板稀釋法中，菌液用7H9作10倍稀釋，配成3×107CFU/mL。

1.2.2.2 接種、孵育、顯色[7]①M(fèi)GIT法：取500 μL、濁度為3×107CFU/mL菌液接種到含藥管，取500 μL、濁度為3×105CFU/mL菌液接種到對(duì)照管中，裝入專用藥敏架，置Bactec MGIT 960系統(tǒng)內(nèi)孵育。②微孔板稀釋法：在96孔板中，每孔加入100 μL7H9培養(yǎng)基，在第12列加入95 μL 7H9培養(yǎng)基和5 μL丙硫異煙胺溶液(5 120 μg /mL),倍比稀釋至第2列，得到從128～0.125 μg/mL的藥液梯度，第1列為空白對(duì)照，每株菌接種一行，每孔加入100 μL稀釋菌液。每批次均以H37Rv作為對(duì)照。96孔板用封口膜密封，37 ℃孵育7d后，每孔加入70 μL顯色劑(Alarm blue:5%吐溫—80=2∶5)，隔天觀察顏色變化。

1.2.2.3 結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)[8]：①M(fèi)GIT法：Bactec MGIT 960系統(tǒng)自動(dòng)報(bào)告耐藥或敏感結(jié)果，WHO推薦的耐藥臨界濃度為2.5 μg/mL。②微孔板稀釋法：變紅色為有菌生長(zhǎng)，沒(méi)有變紅色，仍然是藍(lán)色的為沒(méi)菌生長(zhǎng)，藍(lán)色的孔所對(duì)應(yīng)的最小藥物濃度為藥物的MIC值。耐藥臨界濃度為2.5 μg/mL。

1.3 質(zhì)量控制 每批次藥敏試驗(yàn)均用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv(ATCC27294)作為敏感對(duì)照。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析處理，MGIT法和微孔板稀釋法藥敏試驗(yàn)測(cè)定時(shí)間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以MGIT法檢測(cè)結(jié)果為參照，計(jì)算微孔板稀釋法的特異度、敏感度和符合率，兩種方法的一致性用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為一致性極好，Kappa值在0.4～0.75為一致性較好，Kappa值≤0.4時(shí)為一致性差。

2 結(jié) 果

2.1 微孔板稀釋法和MGIT法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)丙硫異煙胺的藥敏結(jié)果 微孔板稀釋法和MGIT法檢測(cè)丙硫異煙胺藥敏所需時(shí)間的比較 MGIT法獲得藥敏結(jié)果的平均檢測(cè)時(shí)間為10.1 d，微孔板稀釋法獲得結(jié)果的平均檢測(cè)時(shí)間為8 d，較MGIT法早2.1 d，兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)表1。

表1 丙硫異煙胺藥敏檢測(cè)獲得結(jié)果所需時(shí)間

Tab.1 The days required to get the results of drug susceptibility to PTO

檢測(cè)方法Detectionmethod菌株數(shù)No．ofisolates平均測(cè)定時(shí)間(d)Theaveragetime測(cè)定時(shí)間范圍(d)TimerangePMGIT法MGITmethod24810．15-13<0．001微孔板稀釋法Thebrothdilutionmethod24888

2.2 微孔板稀釋法與MGIT法檢測(cè)丙硫異煙胺耐藥性結(jié)果比較 對(duì)248例結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株進(jìn)行丙硫異煙胺的耐藥性檢測(cè)，以MGIT法測(cè)定結(jié)果為參照，微孔稀釋方法檢測(cè)丙硫異煙胺耐藥性的敏感度為96.5%(55/57)，特異度為93.2%(178/191),符合率為94.0%(233/248)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(Kappa檢驗(yàn))，兩種方法的Kappa值為0.84，說(shuō)明兩種方法具有較好的一致性，見(jiàn)表2。

表2 微孔板稀釋法與MGIT法檢測(cè)丙硫異煙胺耐藥性結(jié)果比較

Tab.2 Differences of drug resistance results to PTO between the broth dilution method and MGIT method

MGIT法MGITmethod耐藥Resistance敏感Susceptibility敏感度(%)Sensitivity(%)特異度(%)Specificity(%)符合率(%)Concordancerate(%)Kappa微孔板稀釋法Thebrothdilutionmethod耐藥Resistance551396．593．294．00．84敏感Susceptibility2178

2.3 微孔板稀釋法和MGIT法檢測(cè)丙硫異煙胺MIC值結(jié)果比較(定量) 對(duì)117株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行丙硫異煙胺MIC檢測(cè)，微孔板稀釋法和MGIT法的一致率為81.2%(95/117)。在不同的MIC值范圍內(nèi)，兩種方法藥敏結(jié)果一致率有差異，在MIC值<8.0 μg/mL的分離株中，兩種方法的一致率為86.3%(82/95)，兩種方法的一致性較好；在MIC值≥8.0 μg/mL的分離株中，一致率僅為 59.1%(13/22)，見(jiàn)表3。

3 討 論

耐多藥結(jié)核病是全球比較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，快速、準(zhǔn)確的藥敏試驗(yàn)，是耐多藥結(jié)核病防控的首要條件，二線抗結(jié)核藥物是臨床抗結(jié)核治療藥物的重要組成部分。丙硫異煙胺是重要的二線抗結(jié)核藥物之一，目前對(duì)于丙硫異煙胺的體外藥物敏感性試驗(yàn)主要依靠固體比例法或者液體MGIT法，但是固體比例法所需時(shí)間較長(zhǎng)，而MGIT法雖然大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是其檢測(cè)成本較高，限制了其使用范圍。微孔板稀釋法由于其成本低廉、操作簡(jiǎn)便且檢出時(shí)間短，目前廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)一線和主要二線抗結(jié)核藥物體外敏感性，但利用該方法進(jìn)行丙硫異煙胺藥敏檢測(cè)的報(bào)道比較少，本研究評(píng)估了體外采用該方法進(jìn)行丙硫異煙胺耐藥性檢測(cè)的可能性。結(jié)果表明，兩種方法具有很好的一致性，且微孔板稀釋法獲得結(jié)果的檢測(cè)時(shí)間比MGIT法短，MGIT法使用的設(shè)備比較昂貴，阻礙了該方法在經(jīng)濟(jì)水平低下地區(qū)推廣，而微孔板稀釋法操作簡(jiǎn)單、成本低、快速，和MGIT法一致性較好，且適用于多種其他藥物同時(shí)開(kāi)展[9]，特別適合于基層實(shí)驗(yàn)室。

表3 微孔板稀釋法和MGIT法檢測(cè)丙硫異煙胺MIC值比較

Tab.3 The difference of PTO MIC between the broth dilution method and MGIT method

檢驗(yàn)方法DetectionmethodMIC濃度梯度(μg/mL)MICconcentrationgradient微孔板稀釋法Thebrothdilutionmethod0．06250．1250．250．51248163264一致率concordancerate(%)MGIT0．0625300000000000．1250130100000000．250236410000000．500015330000010002400000020001080200081．20%400000030111800000007002160000000010132000000000016400000000005

因?yàn)榻?jīng)費(fèi)限制的原因，本研究在248株結(jié)核分枝桿菌中隨機(jī)選擇了117株進(jìn)行定量的最低抑菌濃度(MIC)檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)于敏感或者M(jìn)IC較低的結(jié)核分枝桿菌而言，使用MGIT法和微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌對(duì)丙硫異煙胺的MIC具有較高的一致性。但是對(duì)于高濃度耐藥的結(jié)核分枝桿菌(MIC>8.0 μg/mL)而言，兩者的一致率明顯較低，表現(xiàn)為以微孔板稀釋法MIC檢測(cè)值高于MGIT法檢測(cè)值為主。有文獻(xiàn)報(bào)道，乙胺丁醇的微孔板稀釋法藥敏試驗(yàn)也存在高濃度MIC值一致率較低的問(wèn)題[10]。分析導(dǎo)致上述不一致的原因，首先可能是結(jié)核分枝桿菌本身生物學(xué)性質(zhì)決定的，該菌在液體培養(yǎng)基中常聚集在一起呈“索狀生長(zhǎng)”，此特性使細(xì)菌難以完全均勻地分布在稀釋液中，而微孔板稀釋法的培養(yǎng)基體積僅200 μL，因?yàn)榕囵B(yǎng)基量少，在液體培養(yǎng)基中因“索狀生長(zhǎng)”導(dǎo)致菌體聚集時(shí)，單位培養(yǎng)基體積里的細(xì)菌數(shù)比設(shè)定的菌數(shù)可能更多，容易使檢測(cè)到的MIC值比實(shí)際高；但MGIT法液體培養(yǎng)基的體積卻有7 mL，較大的培養(yǎng)體積緩沖了分枝桿菌聚集生長(zhǎng)，對(duì)結(jié)果的影響起了一定的作用。其次，兩種方法的檢測(cè)原理存在一定差異，MGIT法是基于比例法檢測(cè)，其判讀結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為含藥管中生長(zhǎng)單位小于100判為敏感；而微孔板稀釋法其判讀結(jié)果時(shí)最低抑菌為完全抑制結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)的濃度，也就是說(shuō)，生長(zhǎng)單位小于100的菌株用MGIT法是判讀為敏感而微孔板稀釋法判讀為耐藥；有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，耐藥菌株的生長(zhǎng)速率明顯慢于敏感菌株，而丙硫異煙胺的耐藥判定濃度折點(diǎn)為2.5 μg/mL，MIC值≥8.0 μg/mL的分離株為高度耐藥菌株，當(dāng)生長(zhǎng)單位小于100時(shí)，用MGIT法判讀為敏感而微孔板稀釋法判讀為耐藥，因此兩種方法原理的差異導(dǎo)致微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)果可能高于MGIT法。本研究提示當(dāng)使用微孔板稀釋法檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的最低抑菌濃度時(shí)，對(duì)于高度耐藥的結(jié)核分枝桿菌(MIC>8.0 μg/mL)而言其檢測(cè)結(jié)果可能偏高。雖然如此，由于微孔板稀釋法對(duì)丙硫異煙胺的耐藥判定濃度折點(diǎn)為2.5 μg/mL，這個(gè)折點(diǎn)濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)<8.0 μg/mL，因此，使用此方法不影響對(duì)結(jié)核分枝桿菌丙硫異煙胺耐藥性的檢測(cè)。

總的來(lái)說(shuō)，對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行丙硫異煙胺耐藥性檢測(cè)，微孔板稀釋法和MGIT法相比，檢測(cè)結(jié)果一致性較好,且成本低、快速，值得在經(jīng)濟(jì)發(fā)展低下的偏遠(yuǎn)地區(qū)推薦使用。

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Wu Ai-wu, Email：aiwwu66@163.com

Broth dilution method for the resistance ofMycobacteriumtuberculosisisolates to protionamide

SU Bi-yi1, TAN Yao-ju2, WU Ai-wu3

(1.GuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouChestHospital,Guangzhou510182,China; 2.GuangzhouChesthospital,Guangzhou510095,China; 3.GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510182,China)

We compared the MGIT 960 method, the reference, and the broth microdilution method for detecting the susceptibility ofMycobacteriumtuberculosisisolates to protionamide (PTO). We performed drug susceptibility testing for 248M.tuberculosisclinical isolates to PTO using MGIT 960 and broth microdilution method. In addition, a total of 117 isolates were randomly selected for further evaluation of the consistency of the minimal inhibitory concentrations determined by these two methods, and eleven concentrations of PTO had been involved accordingly (0.062 5, 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64 μg/mL). The MGIT method showed an average detection time of 10.1 days, while the detection period of broth microdilution method was 8 days, and the difference was statistically significant (P<0.001). In addition, the rate of the sensitivity, specificity and concordance between these two methods was 96.5% (55/57), 93.2% (178/191), and 94.0% (233/248), respectively. The Kappa value was 0.84. Comparison of the MIC values detected by different methods revealed that the overall concordance rate was 81.2% (95/117). For the isolates harboring low MIC values (MIC<8.0 μg/mL), the concordance rate was 86.3% (82/95), while that of the isolates with high MIC values was only 59.1% (13/22). In conclusion, our data demonstrate that the broth microdilution method showed excellent concordance with MGIT method for detecting the resistance rate ofM.tuberculosisisolates to PTO, indicating that the broth microdilution method with available performance, short turn-around time and convenient manual operation was suitable for rapid detection ofM.tuberculosisto PTO.

Mycobacteriumtuberculosis; protionamide; drug susceptibility test

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.013

吳愛(ài)武，Email: aiwwu66@163.com

1.廣州醫(yī)科大學(xué)/廣州市胸科醫(yī)院，廣州 510182； 2.廣州市胸科醫(yī)院，廣州 510095； 3.廣州醫(yī)科大學(xué)金域檢驗(yàn)學(xué)院，廣州 510182

R378.9

A

1002-2694(2017)04-0357-05

2016-07-29 編輯：張智芳