低聚葡萄籽原花青素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

王 海，連燕娜，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

低聚葡萄籽原花青素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

王 海，連燕娜，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

目的：探討低聚葡萄籽原花青素（oligomer grape seed proanthocyanidins，O-GSP）聯(lián)合順鉑（cisdichlorodiamineplatinum(Ⅱ)，DDP）對A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)A549細(xì)胞，四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測DDP和O-GSP單獨(dú)及聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞存活率的影響；流式細(xì)胞儀檢測O-GSP聯(lián)合DDP對A549細(xì)胞周期的影響；Western Blot檢測促細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)。結(jié)果：DDP（≥5 mg/L）和O-GSP（≥16 mg/L）單獨(dú)用藥均對A549細(xì)胞增殖有抑制作用，且兩者同時作用對細(xì)胞增殖抑制具有聯(lián)合作用。5 mg/L DDP單獨(dú)用藥可以于S期阻滯A549細(xì)胞，4 mg/L O-GSP單獨(dú)用藥可以于G0/G1期阻滯A549細(xì)胞，兩者聯(lián)合可顯著降低細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)（P＜0.05）。結(jié)論：O-GSP可以聯(lián)合DDP抑制A549細(xì)胞增殖，且這種聯(lián)合作用與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。

低聚葡萄籽原花青素；順鉑；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率極高的癌癥之一，給人類的健康和生命帶來了極大的威脅[1]。非小細(xì)胞肺癌患者占總肺癌患者的80%左右。與小細(xì)胞肺癌相比，由于非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長分裂較慢，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對較晚，診斷時多處于中晚期，錯過了手術(shù)最佳治療時機(jī)，因此化療成為其主要治療方式。自1978年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用以來[2]，順鉑（cisdichlorodiamineplatinum(Ⅱ)，DDP）已成為臨床上應(yīng)用最廣泛的抗腫瘤藥物之一，在多種癌癥的治療中取得了顯著的療效，如乳腺癌、肝癌、卵巢癌等[3-5]。DDP對肺癌的化療效果也得到國內(nèi)外一致認(rèn)可[6]。但隨著DDP的大量使用，患者也出現(xiàn)了明顯的耐藥性和毒副作用，如腎毒性、肝毒性和耳毒性等[7-9]。

葡萄籽原花青素是指從葡萄籽中提取的、由不同數(shù)量的結(jié)構(gòu)單體（兒茶素、表兒茶素或表兒茶素沒食子酸酯）縮合而成的聚合體的混合物[10]，具有抗腫瘤、抗炎、抗輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗衰老等廣泛的藥理學(xué)作用[11-14]，尤其在抗腫瘤研究方面近年來備受關(guān)注，已有研究結(jié)果顯示原花青素對多種癌細(xì)胞都有不同程度的抑制作用[15]。葡萄籽原花青素中活性較強(qiáng)的是聚合度≤4的低聚葡萄籽原花青素（oligomer grape seed proanthocyanidins，O-GSP）[16]。

本課題組前期研究結(jié)果表明，O-GSP對DDP所致的腎毒性、心肌毒性和生殖毒性具有很好的保護(hù)作用[17-19]，但O-GSP與DDP是否具有聯(lián)合抗癌作用至今鮮見報道，因此本研究初步探討了O-GSP聯(lián)合DDP對A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響，以期為臨床上聯(lián)合化療藥物的使用提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肺腺癌細(xì)胞（A549）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。

DDP（批號：406022CF）、注射用凍干粉劑 齊魯制藥有限公司；O-GSP（原花青素純度≥95%，色譜級，其中二聚體純度≥60%、原花青素B2純度≥4%） 天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；杜氏改良Eagle培養(yǎng)基：營養(yǎng)混合物F-12（Dulbecco’s modif i ed Eagle medium: nutrient mixture F-12，DMEM/F12）培養(yǎng)基、0.25 g/100 mL胰酶、細(xì)胞周期試劑盒 美國G e n v i e w公司；胎牛血清 美國Hycolon公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 美國Sigma公司；Phospho-Rb抗體、Cyclin D1抗體 碧云天生物技術(shù)有限公司；CDK 4抗體 中杉金橋生物技術(shù)有限公司；β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記上樣抗兔（鼠）免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、二辛可寧酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司；FACS Calibar流式細(xì)胞儀 美國BD公司；電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

② 劉堅(jiān),曹廣順,吳福祥.論誘發(fā)漢語詞匯語法化的若干因素[J].中國語文,1995.(3).第161-168頁.

1.3.1 O-GSP和DDP單獨(dú)使用對A549細(xì)胞增殖的影響

將100 μL（1×105個/mL）處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，棄原培養(yǎng)液，分別單獨(dú)加入100 μL含0、5、7.5、10、15、20、25、30 mg/L DDP或0、4、8、16、32、64、128 mg/L O-GSP的無血清培養(yǎng)基，其中對照組的培養(yǎng)基中不加O-GSP或DDP，每組設(shè) 6 個復(fù)孔，在 37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀于570 nm波長處測定吸光度（A）。按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中：A實(shí)驗(yàn)組為各加藥組的吸光度；A對照組為對照組的吸光度。

1.3.2 O-GSP與DDP聯(lián)合作用對A549細(xì)胞增殖的影響

將100 μL（1×105個/mL）處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到96 孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，將細(xì)胞分為對照組、單獨(dú)用藥組和聯(lián)合用藥組，按照預(yù)設(shè)濃度加藥，聯(lián)合用藥組DDP質(zhì)量濃度分別為0、5、10 mg/L，O-GSP質(zhì)量濃度分別為0、4、8 mg/L。每組設(shè)6 個復(fù)孔，在 37 ℃、含5% CO2和飽和濕度的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測定細(xì)胞存活率。按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.3 O-GSP與DDP聯(lián)合作用對A549細(xì)胞周期的影響

將2 mL（5×104個/mL）處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到6孔板中，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，對各處理組進(jìn)行藥物處理。細(xì)胞分為對照組、DDP組、O-GSP組和DDP+O-GSP組。除對照組，其余各組中DDP質(zhì)量濃度為5 mg/L，O-GSP質(zhì)量濃度為4 mg/L。在 37 ℃、含 5% CO2和飽和濕度的孵育培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞后，按照試劑盒說明用70%乙醇4 ℃固定24 h，PI染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

1.3.4 O-GSP與DDP聯(lián)合作用對A549細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

按照1.3.3節(jié)的方法對細(xì)胞進(jìn)行分組處理后，每孔加入細(xì)胞裂解液200 μL，10 000 r/min離心10 min，BCA法測定總蛋白濃度，然后加入5×上樣緩沖液，沸水浴10 min使蛋白變性。12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）后，轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)印膜上，5%脫脂牛奶封閉75 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗常溫孵育75 min后，在凝膠成像系統(tǒng)曝光，按照公式（2）計(jì)算細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 O-GSP和DDP單獨(dú)用藥對A549細(xì)胞增殖的抑制作用

圖1 DDP對A549細(xì)胞增殖的抑制作用（n＝5）Fig. 1 Inhibitory effect of DDP on A549 cells (n=5)

由圖1可知，隨著DDP質(zhì)量濃度的升高，A549細(xì)胞存活率逐漸降低，當(dāng)DDP質(zhì)量濃度高于25 mg/L時，所測吸光度不再隨DDP質(zhì)量濃度的升高而顯著降低。通過SPSS軟件計(jì)算，DDP對A549細(xì)胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值為10.68 mg/L。

n＝5）Fig. 2 Inhibitory effect of O-GSP on A549 cells (n = 5)圖2 O-GSP對A549細(xì)胞增殖的抑制作用（

由圖2可知，當(dāng)O-GSP質(zhì)量濃度＜16 mg/L時，O-GSP對A549細(xì)胞存活率無顯著性影響（P＞0.05）。當(dāng)O-GSP質(zhì)量濃度≥16 mg/L時，A549細(xì)胞存活率顯著低于對照組（P＜0.05），說明O-GSP達(dá)到一定質(zhì)量濃度時能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖。

2.2 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞增殖的抑制作用

表1 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞存活率的影響（n＝5）Table 1 Effect of co-treatment with O-GSP and DDP on A549 cell survival (n= 5)

表2 析因分析結(jié)果Table 2 Results of factorial analysis

由表1可知，DDP單獨(dú)用藥于A549細(xì)胞時，能夠抑制A549細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05）。由表2可知，當(dāng)O-GSP和DDP共同作用于A549細(xì)胞時，其兩者的互作效應(yīng)對A549細(xì)胞的存活率也有顯著性影響（P＜0.05），結(jié)合表1中A549細(xì)胞存活率的變化，可知O-GSP和DDP對A549細(xì)胞增殖的抑制具有聯(lián)合作用。DDP對A549細(xì)胞的1/2 IC50約為5 mg/L，且O-GSP質(zhì)量濃度≥4 mg/L時，可以顯著增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)DDP質(zhì)量濃度為5 mg/L，O-GSP質(zhì)量濃度為4 mg/L時，A549細(xì)胞存活率為（51.0±6.3）%，最接近50%。加藥后細(xì)胞存活率太低，則在后期細(xì)胞進(jìn)行流式檢測時，細(xì)胞碎片太多，影響檢測；細(xì)胞存活率太高，則較難檢測出細(xì)胞損傷，因此選用此質(zhì)量濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞周期的影響

圖3 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞周期的影響Fig. 3 Effect of O-GSP combined with DDP on the cell cycle of A549 cells

表3 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對細(xì)胞周期中A549細(xì)胞比例的影響（n＝5）Table 3 Effect of O-GSP combined with DDP on cell populations at different cell cycle phases (n= 5)

在細(xì)胞周期中，G0/G1期細(xì)胞的DNA含量為2 N（N：染色體組數(shù)，下同），含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的DNA含量為4 N，而正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的DNA含量理論上應(yīng)在2～4 N之間。因此，可根據(jù)細(xì)胞中DNA含量的分布情況進(jìn)行細(xì)胞周期分析。如圖3和表3所示，與對照組細(xì)胞相比，DDP組G0/G1期細(xì)胞比例顯著減少，S期細(xì)胞比例顯著增大（P＜0.05），說明DDP可將細(xì)胞周期阻滯在S期。而O-GSP組與對照組相比G0/G1期細(xì)胞比例顯著增大，S期細(xì)胞比例顯著減少（P＜0.05），說明O-GSP可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。DDP與O-GSP同時作用于A549細(xì)胞后，G0/G1期細(xì)胞與DDP組相比顯著增多，S期細(xì)胞比例與O-GSP組相比顯著增加，G2/M期細(xì)胞比例與對照組相比顯著減少（P＜0.05）。說明O-GSP聯(lián)合DDP作用后，既可以對A549細(xì)胞形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.4 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步證明O-GSP和DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞的周期阻滯作用，使用Western Blot分別檢測促細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)。如表4所示，與對照組相比，DDP單獨(dú)用藥后，CDK 4和Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而p-Rb的表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。O-GSP單獨(dú)用藥后，CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。而DDP與O-GSP同時用藥后，與對照組相比CDK 4、Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與DDP組相比，Cyclin D1和p-Rb的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；與O-GSP組相比，Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。說明O-GSP與DDP聯(lián)合阻滯A549細(xì)胞周期可能與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。

表4 O-GSP與DDP聯(lián)合用藥對A549細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響（n＝5）Table 4 Effect of O-GSP combined with DDP on the expression levels of cell cycle-related proteins in A549 cells (n= 5)

3 討 論

本課題組前期研究結(jié)果表明，O-GSP質(zhì)量濃度為16 mg/L時，對DDP誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷的保護(hù)作用最佳，與DDP損傷組有顯著性差異（P＜0.05）[20]。氧化應(yīng)激是DDP造成腎毒性的主要原因，DDP含有的親核氨基能夠與水分子作用生產(chǎn)大量的自由基，造成線粒體的氧化損傷，功能喪失。另一方面，DDP可誘發(fā)機(jī)體抗氧化水平降低，DDP可通過直接或間接與GSH結(jié)合而引起細(xì)胞內(nèi)GSH耗竭，同時還可抑制谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶等的活力，使細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力減弱而引發(fā)氧化應(yīng)激[21]。O-GSP拮抗DDP腎細(xì)胞損傷的機(jī)制可能與其拮抗DDP所致腎細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)和線粒體損傷有關(guān)[19]。而O-GSP與DDP聯(lián)合抗腫瘤機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。

DDP抗腫瘤作用機(jī)制主要是DDP進(jìn)入細(xì)胞后，氯原子能夠被水分子取代形成活化狀態(tài)?；罨蟮腄DP與DNA分子嘌呤堿的N7活性中心結(jié)合形成DNA鏈內(nèi)或鏈間加合產(chǎn)物，從而造成癌細(xì)胞DNA損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。O-GSP屬于植物多酚類物質(zhì)，研究表明，O-GSP具有很好的抗腫瘤作用，其作用機(jī)制包括促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、降低腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散等[23-25]。本研究結(jié)果表明，單獨(dú)使用O-GSP和DDP均可抑制A549細(xì)胞的增殖，且兩者聯(lián)用時對A549細(xì)胞增殖抑制具有聯(lián)合作用。

細(xì)胞周期調(diào)控在細(xì)胞增殖和凋亡中起重要的作用。細(xì)胞周期可分為 G0/G1、S、G2/M 3 個階段，其中在G1期與G2期細(xì)胞進(jìn)行RNA的復(fù)制與有關(guān)蛋白質(zhì)的合成，S期進(jìn)行DNA的復(fù)制[26]。S期阻滯可以為細(xì)胞的受損DNA修復(fù)提供充足的時間，當(dāng)損傷DNA超過細(xì)胞的修復(fù)或耐受極限時，S期檢驗(yàn)點(diǎn)的關(guān)卡功能靈敏度就會降低，最終由于細(xì)胞內(nèi)DNA損傷不能得到有效修復(fù)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或死亡。有研究結(jié)果顯示DDP可以使細(xì)胞產(chǎn)生S期阻滯，當(dāng)用其他藥物去除S期阻滯后，可增加DDP的毒性[27]。因此推測S期阻滯與癌細(xì)胞對DDP的耐藥存在一定關(guān)系。本研究結(jié)果表明，DDP單獨(dú)用藥可以引起A549細(xì)胞S期阻滯，而O-GSP單獨(dú)用藥可以引起A549細(xì)胞G0/G1期阻滯，兩者聯(lián)用后既可以對A549細(xì)胞形成G0/G1期阻滯，又能形成S期阻滯。提示DDP和O-GSP對細(xì)胞周期的聯(lián)合阻滯作用進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖。

細(xì)胞周期的調(diào)控有外源性和內(nèi)源性調(diào)控，外源性調(diào)控主要是由外界刺激引起的，在細(xì)胞周期內(nèi)源性調(diào)控中，細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）具有關(guān)鍵性的調(diào)控作用[28]。Cyclin D1蛋白被認(rèn)為是一種原癌基因表達(dá)的蛋白，在人類多種腫瘤組織中高表達(dá)或有突變。Rb是一種抑癌基因表達(dá)的蛋白，可以通過調(diào)控細(xì)胞周期G1期的檢驗(yàn)點(diǎn)來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。Rb蛋白的活性通過其磷酸化水平來調(diào)控。Cyclin D1-CDK 4-Rb通路在調(diào)控細(xì)胞周期的過程中起到關(guān)鍵作用[29]。Cyclin D1和CDK 4結(jié)合形成復(fù)合物后，能夠使Rb蛋白磷酸化形成p-Rb，進(jìn)而促進(jìn)S期所需基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞由G0/G1期轉(zhuǎn)化到S期[30]。本研究結(jié)果顯示，DDP雖然可以使A549細(xì)胞中Cyclin D1和CDK 4蛋白水平下降，但卻使p-Rb蛋白水平升高，促進(jìn)了細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化。由于DDP又能形成DNA損傷，DNA復(fù)制過程受阻，從而使細(xì)胞形成了S期阻滯。與對照組相比，O-GSP單獨(dú)用藥后可以使Cyclin D1、CDK 4和p-Rb的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，細(xì)胞形成G0/G1期阻滯。而DDP與O-GSP聯(lián)合用藥后，Cyclin D1、CDK 4和p-Rb蛋白表達(dá)水平降低幅度更大，說明O-GSP降低了DDP引起的p-Rb蛋白表達(dá)水平的升高。然而，DDP升高p-Rb蛋白表達(dá)水平的通路以及此通路與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究顯示，O-GSP與DDP聯(lián)合作用可以增強(qiáng)DDP對A549細(xì)胞的殺傷作用，且這種聯(lián)合作用與Cyclin D1-CDK 4-Rb通路介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。該研究可為臨床上化療聯(lián)合用藥提供一定的參考。

[1] YOULDEN D R, CRAMB S M, BAADE P D. The international epidemiology of lung cancer: geographical distribution and secular trends[J]. Journal of Thoracic Oncology, 2008, 3(8): 819-831. DOI:10.1097/JTO.0b013e31818020eb.

[2] KELLAND L. The resurgence of platinum-based cancer chemotherapy[J]. Nature Reviews Cancer, 2007, 7(8): 573-584. DOI:10.1038/nrc2167.

[3] LEONE R, BENONI G, APOSTOLI P, et al. Two-cycle cisplatin kinetics in patients with ovarian and mammary cancer[J]. Therapeutic Drug Monitoring, 1987, 9(4): 374-377.

[4] CAVANNA L, BODINI F C, STROPPA E M, et al. Advanced gastric cancer with liver and lymph node metastases successfully resected after induction chemotherapy with docetaxel, cisplatin and 5-f l uorouracil[J]. Chemotherapy, 2014, 60(4): 224-227. DOI:10.1159/000375156.

[5] XIA Lingfang, WEN Hao, HAN Xiaotian, et al. Luteinizing hormone inhibits cisplatin-induced apoptosis in human epithelial ovarian cancer cells[J]. Oncology Letters, 2016, 11(3): 1943-1947. DOI:10.3892/ ol.2016.4122.

[6] ABRAMS T J, LEE L B, MURRAY L J, et al. SU11248 inhibits KIT and platelet-derived growth factor receptor beta in preclinical models of human small cell lung cancer[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2003, 2(5): 471-478.

[7] 丁大連, 亓衛(wèi)東, 張梅, 等. 順鉑及其耳毒性[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2008, 6(2): 125-133. DOI:10.3969/j.issn.1672-2922. 2008.02.001.

[8] 李革新, 金亞平, 陸春偉, 等. 順鉑肝毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 18(6): 352-353. DOI:10.3969/j.issn.1002-221X.2005.06.014.

[9] 趙艷萌, 高麗萍, 郭卓雨. 順鉑誘發(fā)腎毒性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2013, 34(23): 3679-3681. DOI:10.13820/j.cnki. gdyx.2013.23.032.

[10] 李春陽, 張紅城, 王乃富, 等. 葡萄籽原花青素的單元結(jié)構(gòu)[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 26(5): 1070-1077. DOI:10.3969/ j.issn.1000-4440.2010.05.031.

[11] LUAN Yunyan, LIU Zimin, ZHONG Jinyi, et al. Effect of grape seed proanthocyanidins on tumor vasculogenic mimicry in human triple-negative breast cancer cells[J]. Asian Pacif i c Journal of Cancer Prevention, 2015, 16(2): 531-535.

[12] 顏小梅, 楊光, 馬媛, 等. 葡萄籽原花青素對老年病的預(yù)防作用研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(21): 339-343. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201421064.

[13] PONS Z, GUERRERO L, MARGALEF M, et al. Effect of low molecular grape seed proanthocyanidins on blood pressure and lipid homeostasis in cafeteria diet-fed rats[J]. Journal of Physiology and Biochemistry, 2014, 70(2): 629-637. DOI:10.1007/s13105-014-0329-0.

[14] SHAO Z, VANDEN H T, LI C Q, et al. Synergistic effect of Scutellaria baicalensis and grape seed proanthocyanidins on scavenging reactive oxygen species in vitro[J]. American Journal of Chinese Medicine, 2004, 32(1): 89-95. DOI:10.1142/ S0192415X04001722.

[15] 江海洋, 張華. 葡萄籽原花青素的研究進(jìn)展[J]. 臨床誤診誤治, 2012, 25(11): 97-100. DOI:10.3969/j.issn.1002- 3429.2012.11.038.

[16] 郭磊, 楊靜玉, 王芳, 等. 葡萄籽提取物化學(xué)成分及藥理活性的研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報, 2008, 25: 32-34.

[17] 郭培培, 郭卓雨, 趙艷萌, 等. 葡萄籽原花青素對順鉑導(dǎo)致H9c2細(xì)胞毒性的保護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(3): 213-216. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201403043.

[18] 連燕娜, 張海蓮, 趙江燕, 等. 順鉑誘發(fā)大鼠睪丸毒性的機(jī)制及葡萄籽原花青素的防護(hù)作用[J]. 食品科學(xué), 2015, 36(15): 189-194. DOI:10.4506/spkx1002-6630-201515035.

[19] 趙艷萌, 趙江燕, 高麗萍. 葡萄籽原花青素對順鉑所致大鼠腎臟氧化損傷和線粒體損傷的防護(hù)作用[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2015, 31(1): 6-10. DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2015.1.002.

[20] 連燕娜, 高麗萍, 郭豫, 等. 低聚體葡萄籽原花青素對順鉑損傷HEK293細(xì)胞及抗癌活性的影響[J]. 食品科學(xué), 2016，37(7): 182-186. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201607033.

[21] 李貞, 高麗萍. 氧化應(yīng)激在順鉑腎毒性中的作用[J]. 廣東醫(yī)學(xué), 2010(19): 2600-2602. DOI:10.3969/j.issn.1001- 9448.2010.19.052.

[22] DASARI S, TCHOUNWOU P B. Cisplatin in cancer therapy: molecular mechanisms of action[J]. European Journal of Pharmacology, 2014, 740: 364-378. DOI:10.1016/ j.ejphar.2014.07.025.

[23] MA Jia, FANG Binbin, ZENG Fanpeng, et al. Grape seed proanthocyanidins extract inhibits pancreatic cancer cell growth through down-regulation of miR-27a expression[J]. Journal of Central South University(Medical Sciences), 2015, 40(1): 46-52. DOI:10.11817/j.issn.1672-7347.2015.01.008.

[24] PUNATHIL T, KATIYAR S K. Inhibition of non-small cell lung cancer cell migration by grape seed proanthocyanidins is mediated through the inhibition of nitric oxide, guanylate cyclase, and ERK1/2[J]. Molecular Carcinogenesis, 2009, 48(3): 232-242. DOI:10.1002/mc.20473.

[25] VAID M, KATIYAR S K. Grape seed proanthocyanidins inhibit cigarette smoke condensate-induced lung cancer cell migration through inhibition of NADPH oxidase and reduction in the binding of p22(phox) and p47(phox) proteins[J]. Molecular Carcinogenesis, 2015, 54(Suppl 1): 61-71. DOI:10.1002/mc.22173.

[26] 高燕, 林莉萍, 丁健. 細(xì)胞周期調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2005, 17(4): 318-322. DOI:10.3969/j.issn.1004-0374.2005.04.009.

[27] EASTMAN A, KOHN E A, BROWN M K, et al. A novel indolocarbazole, ICP-1, abrogates DNA damage-induced cell cycle arrest and enhances cytotoxicity: similarities and differences to the cell cycle checkpoint abrogator UCN-01[J]. Molecular Cancer Therapeutics, 2002, 1(12): 1067-1078.

[28] 盧夢玲, 閆超, 賴多, 等. Cyclin D1與細(xì)胞周期調(diào)控[J]. 生物技術(shù)通報, 2011, 27(10): 55-59. DOI:10.13560/j.cnki.biotech. bull.1985.2011.10.025.

[29] MARZEC M, KASPRZYCKA M, LAI R, et al. Mantle cell lymphoma cells express predominantly cyclin D1a isoform and are highly sensitive to selective inhibition of CDK4 kinase activity[J]. Blood, 2006, 108(5): 1744-1750. DOI:10.1182/blood- 2006-04-016634.

[30] 范祖森, 敖世洲. 腫瘤抑制基因Rb與細(xì)胞周期調(diào)控研究新進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1999, 26(5): 429-433. DOI:10.3321/ j.issn:1000-3282.1999.05.005.

Effect of Oligomeric Proanthocyanidins from Grape Seeds Combined with Cisplatin on A549 Cell Proliferation and Cell Cycle

WANG Hai, LIAN Yanna, GAO Liping*
(Beijing Municipal Key Laboratory of Biologically Active Substances and Functional Food, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100083, China)

Objective: To investigate the effect of oligomeric proanthocyanidins from grape seeds (O-GSP) combined with cisplatin (DDP) on the proliferation, cell cycle and cell cycle-related protein expression of A549 cells. Methods: A549 cells were cultured in vitro. The effects of DDP and O-GSP alone and in combination on the survival rate of A549 cells were observed by MTT assay; the combined effect of O-GSP and DDP on the cell cycle of A549 cells was detected by fl ow cytometry and the expression levels of the cell cycle-related proteins CDK 4, Cyclin D1 and p-Rb were detected by Western blot. Results: DDP (≥ 5 mg/L) and O-GSP (≥16 mg/L) treatments alone could inhibit A549 cell proliferation. The combined treatment had a synergistic effect on the inhibition of cell proliferation. DDP treatment alone at 5 mg/L arrested A549 cells at S phase and O-GSP at 4 mg/L arrested the cells at G0/G1phase. The combination of DDP at 5 mg/L and O-GSP at 4 mg/L significantly reduced the expression levels of the cell cycle regulatory proteins CDK 4, Cyclin D1 and p-Rb. Conclusion: DDP can inhibit the proliferation of A549 cells in combination with O-GSP through a mechanism related to the regulation of cell cycle progression mediated by the Cyclin D1-CDK 4-Rb pathway.

oligomeric proanthocyanidins from grape seeds; cisplatin; cell proliferation; cell cycle

10.7506/spkx1002-6630-201707034

Q946.8

A

1002-6630（2017）07-0213-06

王海, 連燕娜, 高麗萍. 低聚葡萄籽原花青素聯(lián)合順鉑對A549細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(7): 213-218. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707034. http://www.spkx.net.cn

WANG Hai, LIAN Yanna, GAO Liping. Effect of oligomeric proanthocyanidins from grape seeds combined with cisplatin on A549 cell proliferation and cell cycle[J]. Food Science, 2017, 38(7): 213-218. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707034. http://www.spkx.net.cn

2016-04-12

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7163211）

王海（1992—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)對機(jī)體的生化作用。E-mail：916319176@qq.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)對機(jī)體的生化作用。E-mail：gaolip62@163.com