高效液相色譜法檢測運動飲料中雙酚A的殘留

韓明均，覃榮周，程敏，王琪林

（1.阿壩師范學(xué)院，四川汶川623001；2.成都體育學(xué)院，四川成都610041）

高效液相色譜法檢測運動飲料中雙酚A的殘留

韓明均1，覃榮周1，程敏1，王琪林2

（1.阿壩師范學(xué)院，四川汶川623001；2.成都體育學(xué)院，四川成都610041）

建立一種快速、有效的高效液相色譜法測定運動飲料中雙酚A殘留的方法。樣品經(jīng)乙醇提取后，采用C18固相萃取小柱進(jìn)行凈化和富集。采用苯基色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈∶水=40∶60（體積比）作為流動相，用PDA檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，雙酚A標(biāo)液在0.10 μg/mL～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，檢出限為5.0μg/kg，定量限為15.0 μg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到92.1%～93.8%。該方法具有前處理簡單、富集效果好和檢測速度快的優(yōu)點，適用于運動飲料中雙酚A殘留的定量檢測。

高效液相色譜；運動飲料；雙酚A

雙酚A，也稱BPA，在工業(yè)上被用來合成聚碳酸酯（PC）和環(huán)氧樹脂等材料。在食品包裝材料上經(jīng)常用于制造塑料（奶）瓶、幼兒用的吸口杯、食品和飲料（奶粉）罐內(nèi)側(cè)涂層。BPA無處不在，從礦泉水瓶、飲料瓶到及食品包裝的內(nèi)里，都有它的身影，每年全世界生產(chǎn)2 700萬t含有BPA的塑料。但是BPA作為一種類雌性激素，模擬生物體內(nèi)源性激素的作用，被認(rèn)為是一種內(nèi)分泌干擾素。由于其存在潛在的致癌性、致突變性等不良的影響，雙酚A對人們的影響也逐步引起人們的重視。

目前，對各種環(huán)境和生物樣品中酚類化合物測定報道較多，對于比較特殊的運動飲料中BPA的殘留研究較少。對測定BPA殘留可采用氣相色譜-質(zhì)譜法[1-2]、毛細(xì)管電泳法[3]、液相色譜[4-11]等。氣相色譜-質(zhì)譜法靈敏度較高但前處理較復(fù)雜，為減小分析物的極性，提高分離的柱效和檢測的靈敏度，需要先對酚類化合物衍生處理后再進(jìn)行分析；液相色譜-質(zhì)譜方法儀器成本較高，不適于大量樣品中雙酚A污染物的快速檢測；毛細(xì)管電泳法受進(jìn)樣量及檢測方法限制，影響檢測靈敏度，同時定量誤差較大，也不適合作為常規(guī)檢測方法；而液相色譜-PDA法測定BPA，具有檢測靈敏度高、儀器操作簡便、成本低等優(yōu)勢。本文利SPEHPLC-PDA法測定運動飲料中BPA，對常見的用塑料瓶裝的運動飲料中是否含有BPA殘留以及殘留量的多少進(jìn)行研究，方法的檢出限低，線性系數(shù)、回收率和精密度等參數(shù)可以滿足實際樣品檢測需要。BPA的結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 BPA的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of BPA

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)、2998型PDA檢測器、C18固相萃取小柱（3cc，250 mg）：Waters；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：IKA；BPA標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 樣品來源

樣品均為市場上銷售的塑料瓶裝運動飲料。

1.3 色譜條件

色譜柱：苯基柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃。

1.4 試驗方法

1.4.1 流動相體系的選擇

固定流動相流速1.0 mL/min，配制不同體系的流動相體系，流動相Ⅰ：甲醇∶水=40∶60，體積比；流動相Ⅱ：乙腈∶水=40∶60，體積比；流動相Ⅲ：甲醇∶20 mmol/L乙酸銨=40∶60，體積比；流動相Ⅳ：乙腈∶20 mmol/L乙酸銨=40∶60，體積比，考察4種流動相對BPA色譜行為的影響。

1.4.2 檢測波長的選擇

本試驗采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍190 nm～350 nm），根據(jù)BPA標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，選擇比較合適的檢測波長。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的BPA標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理條件的優(yōu)化

本試驗樣品主要為塑料瓶裝的運動飲料，BPA的提取主要利用固相萃取小柱，其作用是對運動飲料中BPA的殘留起到一個凈化和富集的作用。本試驗對4種固相萃取小柱進(jìn)行比較，選擇較適合本試驗的固相萃取小柱。并在固相萃取柱洗脫液選擇中，比較甲醇、乙腈、丙酮、丙酮-二氯甲烷4種洗脫液，選擇一種較合適的作為固相萃取柱的洗脫液。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗及樣品測定

以市售未檢測出BPA殘留的運動飲料為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件操作，過固相萃取柱，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

為了考察不同填料的色譜柱對BPA分離的影響，選用兩種色譜柱（苯基柱和C18柱）進(jìn)行試驗，色譜柱規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm。由試驗結(jié)果可知，C18柱和苯基柱對BPA的分離均較好，但相對而言，苯基柱的分離效果更優(yōu)于C18柱。這是因為，苯基柱屬芳香性的，具有π-π作用，即苯環(huán)與芳香族化合物結(jié)構(gòu)中的苯基、萘基等有大π鍵相互作用，在同等條件下，對含取代苯環(huán)物質(zhì)具有一定的選擇性，分離效果更好，分離度更高。

2.2 流動相體系的選擇

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)檢測BPA殘留的流動相體系不同，主要分為四大類流動相體系：甲醇/水體系、乙腈/水體系、甲醇/乙酸銨溶液體系和乙腈/乙酸銨溶液體系。所以為了了解這些流動相對這BPA色譜行為的影響，本研究固定流動相洗脫速度，配制不同體系的流動相Ⅰ：甲醇∶水=40∶60，體積比；流動相Ⅱ：乙腈∶水=40∶60，體積比；流動相Ⅲ：甲醇∶20 mmol/L乙酸銨=40∶60，體積比；流動相Ⅳ：乙腈∶20mmol/L乙酸銨=40∶60，體積比，考察了流動相對BPA色譜行為的影響。BPA的色譜圖見圖2。

圖2 BPA的色譜圖Fig.2 The chromatograms of BPA

結(jié)果表明：在4種流動相體系中，均對BPA的色譜保留行為有不同程度的影響，其中流動相Ⅱ：乙腈∶水=40∶60，體積比的分離度最好，如圖2所示，在苯基柱柱上可得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。

2.3 檢測波長的選擇

本試驗采用PDA檢測器對BPA進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍190 nm～350 nm）。BPA的全波長掃描圖見圖3。

圖3 BPA的全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning chart of BPA

如圖3所示，BPA在202、227、278 nm附近各存在一個吸收峰。BPA標(biāo)液在上述3個特征波長條件下的色譜圖對比顯示，202 nm和227 nm波長條件下檢測到的雜質(zhì)峰明顯較多，且雜質(zhì)峰面積也較大。278 nm條件下的色譜圖中雜質(zhì)峰較少，峰形較好且峰形相近，所以選擇278 nm作為BPA的檢測波長。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗證BPA在流動相Ⅱ：乙腈∶水：=40∶60，體積比體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為0.10、0.20、0.40、0.60、1.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗結(jié)果表明，BPA在0.10 μg/mL～1.00 μg/mL內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到BPA組分的LOD為5.0 μg/kg，LOQ為15.0 μg/kg，結(jié)果見表1。

表1 BPA的保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of BPA

2.5 凈化方法的選擇與優(yōu)化

固相萃取法以其集樣品提取、濃縮、凈化于一體，簡化了操作步驟，減少了溶劑用量，提高了樣品前處理效率而受到重視。固相萃取法中，針對樣品BPA殘留的檢測大部分是利用C18小柱進(jìn)行凈化的。本試驗中為驗證C18小柱在運動飲料樣品凈化中的應(yīng)用優(yōu)勢，與其他常用的HLB、活性炭小柱以及酸性氧化鋁柱的對含BPA的樣品富集能力進(jìn)行比較。柱類型、洗脫液對BPA平均回收率的影響見圖4。

圖4 柱類型、洗脫液對BPA平均回收率的影響Fig.4 The effect of column type and elution solution on the average recovery rate of BPA

結(jié)果如圖4所示，HLB柱對BPA的吸附效果較好；活性炭小柱對極性和非極性有機化合物均有較強的吸附，但極性較強的溶劑如甲醇、乙腈一般很難將強吸附的物質(zhì)洗脫下來；酸性氧化鋁柱一般用于分離酸性物質(zhì)，但由于其表面含有鋁羥基，對非極性化合物的吸附能力較弱，因此活性炭小柱和酸性氧化鋁柱對BPA的富集能力均較弱。而C18小柱的富集效果最佳，對樣品中BPA回收率能達(dá)到92%，這是由于C18固相萃取柱填料為硅膠多點鍵合十八烷基，其含碳量較高，因此對中等極性的BPA保留容量大，故選用C18固相萃取柱對樣品進(jìn)行富集。

在選用C18固相萃取柱提取BPA殘留時，考察洗脫液的效果是在空白樣品中加入BPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇提取后上柱，分別考察了以甲醇、乙腈、丙酮、丙酮∶二氯甲烷=8∶2（體積比）混合溶液作為C18固相萃取洗脫液時的洗脫效果。

結(jié)果如圖4所示，丙酮∶二氯甲烷=8∶2（體積比）混合溶液的洗脫回收率最高，其次為丙酮和乙腈，甲醇的洗脫回收率最低。因此試驗選用丙酮∶二氯甲烷= 8∶2（體積比）作為C18固相萃取小柱的洗脫溶劑。

2.6 加標(biāo)回收與相對偏差

在以上試驗的優(yōu)化條件下，利用空白基質(zhì)的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，在分別添加20、40、80 μg/kg等3個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，每個濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可見，BPA的加標(biāo)回收率為92.1%～93.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%～2.0%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.7 實際樣品的測定

應(yīng)用本文所建立的方法，對市售不同類型運動飲料共30個批次進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)2個批次運動飲料中含有BPA殘留。如圖所示，是一款運動飲料中含有BPA的色譜圖。樣品中BPA的色譜圖見圖5。

圖5 樣品中BPA的色譜圖Fig.5 The chromatograms of BPA in the sample

3 結(jié)論

本文建立了一種固相萃取-高效液相色譜-PDA檢測器檢測運動飲料中BPA殘留的分析方法。結(jié)果表明，在乙腈∶水=40∶60（體積比）流動相體系中，BPA能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。在270 nm的檢測波長下，樣品經(jīng)過乙醇提取后，再處理采用C18固相萃取柱法，丙酮∶二氯甲烷=8∶2（體積比）作為洗脫溶劑，可實現(xiàn)對目標(biāo)物的凈化與富集，能準(zhǔn)確快速有效地檢測運動飲料中BPA殘留。

[1] CUNHA S C,FERNANDES J O.Quantification of free and total bisphenol A and bisphenol B in human urine by dispersive liquidfiliquid microextraction (DLLME)and heart-cutting multidimensional gas chromatographyfimass spectrometry(MD-GC/MS)[J].Talanta,2010,83(1):117-125

[2] SNCHEZ-BRUNETE C,MIGUEL E,TADEO J L.Determination of tetrabromobisphenol-A,tetrachlorobisphenol-A and bisphenol A in soil by ultrasonic assisted extraction and gas chromatographyfimass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(29): 5497-5503

[3]MEI S R,WU D,JIANG M,et al.Determination of trace bisphenol A in complex samples using selective molecularly imprinted solidphase extraction coupled with capillary electrophoresis[J].Microchemical Journal,2011,98(1):150-155

[4] 江明,林怡,張江,等.高效液相色譜法測定環(huán)境水中超痕量雙酚A[J].分析化學(xué),2006,34(10):1419-1422

[5]肖全偉,黎源倩,吳德生.高效液相色譜法測定大鼠組織中雙酚A和4-壬基酚濃度[J].色譜,2004,22(6):579-582

[6] 王曉東,趙新華,張新波,等.固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測法同時測定水中的壬基酚和雙酚A[J].分析實驗室,2006,25(9): 27-29

[7]吳新華,丁利,肖家勇,等.單分散磁性亞微米粒子固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中的雙酚A[J].色譜,2011,29(5):399-403

[8]張海峰,胡建,常紅,等.SPE-LC-MS法檢測杭州地區(qū)飲用水水源及自來水中的雙酚A[J].環(huán)境化學(xué),2004,23(5):584-586

[9]BALLESTEROS-GMEZ A,RUBIO S,PREZ-BENDITO D.Analytical methods for the determination of bisphenol A infood[J].Journal of Chromatography A,2009,1216(3):449-469

[10]XIAO J,SHAO B,WU X Y,et al.A Study on bisphenolA, Nonylphenol,and Octylphenol in Human Urine amples Detected by SPE-UPLC-MS[J].Biomedical and Environmental Sciences,2011, 24(1):40-46

[11]FERRER E,SANTONI E,VITTORI S,et al.Simultaneous determination of bisphenol A,octylphenol,and nonylphenol by pressurised liquid extraction and liquid chromatographyfitandem mass spectrometry in powdered milk and infant formulas[J].Food Chemistry, 2011,126(1):360-367

Determination of BPA in Sports Drink by HPLC

HAN Ming-jun1，QIN Rong-zhou1，CHENG Min1，WANG Qi-lin2
（1.Aba Normal University，Wenchuan 623001，Sichuan，China；2.Chengdu Sport University，Chengdu 610041，Sichuan，China）

A rapid and effective method was established for the determination of BPA in sports drink by HPLC. After the sample was extracted by ethanol，it concentrated and purified by C18solid phase extraction column. The separation of targeted compound was performed on phenyl column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile∶water（40∶60，volume ratio）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of BPA was in the range of 0.10 μg/mL-1.00 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 5.0 μg/kg and the quantitative limit was 15.0 μg/kg.The recovery rate was 92.1%-93.8%.The method has the advantages of simple pretreatment，good purifying effect and fast detection rate，and is suitable for the separation and quantitative detection of BPA in sports drink.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；BPA

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.035

2016-11-24

韓明均（1982—），男（漢），講師，碩士，研究方向：民族傳統(tǒng)體育與體育保健康復(fù)。