精氨酸對(duì)Escherichiacoli發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的影響

楊夢(mèng)晨,劉鎮(zhèn)瑜,陳 寧,徐慶陽(yáng)

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

精氨酸對(duì)Escherichiacoli發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的影響

楊夢(mèng)晨,劉鎮(zhèn)瑜,陳 寧,徐慶陽(yáng)

(1.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;2.天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室,天津 300457;3.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457)

色氨酸是人和動(dòng)物體內(nèi)必須氨基酸,在食品、飼料及醫(yī)藥工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值.以色氨酸生產(chǎn)菌株EscherichiacoliTRTH為出發(fā)菌株,在培養(yǎng)基中添加精氨酸,以降低代謝副產(chǎn)物的積累量,提高L-色氨酸的產(chǎn)量.在30 L發(fā)酵罐上考察了精氨酸對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響,結(jié)果表明:添加0.2 g/L的精氨酸時(shí),菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為41.5 g/L,34.5 g/L和18.0%,較未添加時(shí)分別提高了5.46%,5.83%和2.86%,且乙酸積累量較未添加時(shí)降低了10.99%.

精氨酸;大腸桿菌;L-色氨酸;乙酸

L-色氨酸屬于芳香族氨基酸,其中L-色氨酸可以作為藥物提高人的睡眠質(zhì)量及穩(wěn)定情緒,也可以作為食品及飼料添加劑[1].目前,獲得L-色氨酸的主要方法是直接發(fā)酵法[2-3].在L-色氨酸發(fā)酵中,改變培養(yǎng)基的組成成分及發(fā)酵條件可以提高L-色氨酸的產(chǎn)量[4-5].乙酸是E.coli培養(yǎng)過(guò)程中主要的抑制性代謝副產(chǎn)物,且乙酸的積累不僅會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)及目的產(chǎn)物的合成,而且會(huì)造成碳源的浪費(fèi)[3].通過(guò)培養(yǎng)工藝的優(yōu)化或者菌株的基因改造使細(xì)菌生長(zhǎng)速率與其耗氧速率更加趨于平衡,可以避免培養(yǎng)過(guò)程中乙酸的積累.

在培養(yǎng)過(guò)程中,乙酸的合成受到培養(yǎng)基成分的影響.在培養(yǎng)基中添加酵母粉、甲硫氨酸、精氨酸及甘氨酸,可以降低乙酸的積累量并提高蛋白的表達(dá)水平[6].前期實(shí)驗(yàn)證明:L-色氨酸發(fā)酵中精氨酸的最佳添加質(zhì)量濃度為0.2 g/L.因此,在L-色氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 g/L精氨酸,考察精氨酸對(duì)菌體生物量、L-色氨酸產(chǎn)量、乙酸積累量及葡萄糖消耗速率的影響,以?xún)?yōu)化L-色氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌 種

E.coliTRTH,保藏于天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室.

1.2 主要儀器及設(shè)備

5 L和30 L自動(dòng)控制發(fā)酵罐,上海保興生物設(shè)備工程有限公司;752分光光度計(jì),上海分析儀器廠;生物傳感分析儀(SBA-40C),山東科學(xué)院生物研究所;高效液相色譜儀(Agilent 1200),安捷倫科技(中國(guó))有限公司.

1.3 主要試劑

L-色氨酸、L-精氨酸和鹽酸四環(huán)素,北京索萊寶科技有限公司;對(duì)二甲氨基苯甲醛(分析純),上海三愛(ài)思試劑有限公司;亞硝酸鈉(分析純),天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠;乙腈(色譜純)和甲醇(色譜純),天津四通化工廠;乙酸(色譜純),天津化學(xué)試劑一廠.

1.4 培養(yǎng)基

1.4.1 活化斜面培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,鹽酸四環(huán)素50 mg/L,瓊脂粉20 g/L.

1.4.2 保藏斜面培養(yǎng)基

酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,鹽酸四環(huán)素50 mg/L,瓊脂粉20 g/L.

1.4.3 基本培養(yǎng)基

葡萄糖2 g/L,NH4Cl 1 g/L,KH2PO4·3H2O 1.5 g/L,Na2HPO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L.

1.4.4 抗性基本培養(yǎng)基

葡萄糖2 g/L,NH4Cl 1 g/L,KH2PO4·3H2O 1.5 g/L,Na2HPO43.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,鹽酸四環(huán)素50 mg/L.

1.4.5 種子培養(yǎng)基

葡萄糖20 g/L,酵母浸粉7.5 g/L,KH2PO40.75 g/L,KCl 1.9 g/L,(NH4)2SO42 g/L,MgSO4·7H2O 3.15 g/L,FeSO4·7H2O 2.8 mg/L,VB124 mg/L,微量元素混合溶液2 mL,鹽酸四環(huán)素50 mg/L.

1.4.6 初始發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖10 g/L,酵母浸粉1 g/L,KH2PO41.5 g/L,KCl 1.9 g/L,(NH4)2SO410 g/L,MgSO4·7H2O 3.15 g/L,FeSO4·7H2O 75.6 mg/L,微量元素混合溶液4 mL,鹽酸四環(huán)素50 mg/L.

1.5 相關(guān)溶液

1.5.1 對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定色氨酸含量的相關(guān)溶液

1) 色氨酸儲(chǔ)備液(1 g/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g L-色氨酸于100 mL燒杯中,加入適量蒸餾水溶解,然后用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中;2) 對(duì)二甲氨基苯甲醛儲(chǔ)備液(3 g/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取1.500 0 g對(duì)二甲氨基苯甲醛,溶于500 mL 50%的硫酸溶液中;3) 亞硝酸鈉溶液(20 g/L):準(zhǔn)確稱(chēng)取0.200 g亞硝酸鈉于50 mL燒杯中,加入適量蒸餾水溶解,然后用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中.

1.5.2 HPLC直接測(cè)定發(fā)酵液中L-色氨酸含量的相關(guān)溶液

1) L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:質(zhì)量濃度為0.02,0.05,0.08,0.1 g/L的L-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液;2) 流動(dòng)相:V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10.

1.5.3 4 mol/L NaOH溶液

稱(chēng)取80 g NaOH溶于少量蒸餾水中,然后定容至500 mL容量瓶中.

1.5.4 4 mol/L HCl溶液

量取分析純濃鹽酸50 mL,溶于150 mL蒸餾水中.

1.5.5 鹽酸四環(huán)素溶液(10 mg/mL)

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.5 g鹽酸四環(huán)素至50 mL燒杯中,并加少量水溶解,然后定容于50 mL容量瓶中.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)方法

2.1.1 斜面活化種子培養(yǎng)

取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面,然后將活化斜面放入培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12 h.

2.1.2 種子培養(yǎng)

以無(wú)菌水洗菌,將菌液接入裝有3 L種子培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中,培養(yǎng)溫度為36 ℃,利用25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氨水將pH維持在7.0,通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速及通氣量將溶氧水平維持在20%左右.培養(yǎng)12 h后作為種子液.

2.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在30 L發(fā)酵罐中按10%(體積分?jǐn)?shù))接種量接入種子液;攪拌轉(zhuǎn)速300～800 r/min;初始通氣量2 L/min;培養(yǎng)溫度為36 ℃;利用25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氨水將pH控制在7.0;以泡敵消泡;培養(yǎng)過(guò)程中,初始葡萄糖質(zhì)量濃度降至1.0 g/L時(shí),按照一定的脈沖速度將80%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖溶液流加至培養(yǎng)基中以維持殘?zhí)琴|(zhì)量濃度1.0 g/L左右.

2.2 分析測(cè)定方法

2.2.1 發(fā)酵液預(yù)處理

取1.0 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù),使L-色氨酸質(zhì)量濃度介于測(cè)定方法的線性范圍內(nèi),然后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,所得濾液直接進(jìn)樣測(cè)定.

2.2.2 對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法測(cè)定發(fā)酵液中L-色氨酸含量

在比色管中加入20 μL L-色氨酸溶液或者已處理好的發(fā)酵液與1 mL對(duì)二甲氨基苯甲醛溶液,混合后在沸水中加熱2 min,然后加入1滴亞硝酸鈉溶液,再繼續(xù)加熱3 min,隨后取出加入5 mL水并用冷水浴冷卻,以試劑作空白,在600 nm處測(cè)定其吸光值.將發(fā)酵液樣品的吸光值代入該方法的工作曲線方程,即可得出發(fā)酵液中L-色氨酸的含量[7].

2.2.3 高效液相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中L-色氨酸的含量

高效液相色譜分離工作條件[8]:Agilent C18(3.5 μm,150 mm×4.6 mm)分離柱,檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm,柱溫39 ℃,V(0.03% KH2PO4溶液)∶V(甲醇)=90∶10為流動(dòng)相,流動(dòng)相流速為1 mL/min.

2.2.4 發(fā)酵液中丙酮酸及乙酸含量的測(cè)定

利用BioRrofile 300A Nova(美國(guó)Nova Biomedical公司)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定[9].

2.2.5 pH測(cè)定

采用pH 6.4～8.0的精密pH試紙及發(fā)酵罐附帶的pH電極進(jìn)行測(cè)定.

2.2.6 溶氧值測(cè)定

利用發(fā)酵罐的溶氧電極測(cè)定發(fā)酵過(guò)程的溶氧水平.

2.2.7 菌體濃度測(cè)定

用蒸餾水將發(fā)酵液稀釋適當(dāng)倍數(shù),在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值,使OD值為0.2～0.9,OD值乘以稀釋倍數(shù)即為菌體濃度.

2.2.8 菌體干重測(cè)定

10 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心20 min,將菌體用蒸餾水洗滌2次后置于80 ℃真空干燥箱中干燥至恒重,然后用分析天平稱(chēng)重,計(jì)算菌體干重.

2.2.9 殘?zhí)羌叭樗釢舛葴y(cè)定

采用生物傳感分析儀(SBA-40C)測(cè)定發(fā)酵液中的殘?zhí)羌叭樗釢舛?

3 結(jié)果與討論

在30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行L-色氨酸發(fā)酵,在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.2 g/L精氨酸為實(shí)驗(yàn)組,未添加精氨酸的為對(duì)照組,每隔2 h測(cè)定發(fā)酵液中菌體干重、L-色氨酸產(chǎn)量、乙酸含量和葡萄糖消耗速率.

3.1 精氨酸對(duì)菌體生物量的影響

精氨酸對(duì)菌體生物量的影響如圖1所示.由圖1可知:在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加精氨酸可以提高菌體生物量,試驗(yàn)組和對(duì)照組的菌體干重分別為41.5,39.4 g/L,試驗(yàn)組菌體干重較對(duì)照組提高了5.33%;在發(fā)酵初期,試驗(yàn)組的生物量未高于對(duì)照組生物量.原因是精氨酸可降低代謝副產(chǎn)物的積累量,從而降低對(duì)菌體生長(zhǎng)的毒害作用,有助于生物量的增加.因此,在L-色氨酸發(fā)酵中,添加精氨酸可以提高菌體生物量.

圖1 精氨酸對(duì)菌體生物量的影響Fig.1 The effect of arginine on cell biomass

3.2 精氨酸對(duì)L-色氨酸產(chǎn)量的影響

精氨酸對(duì)L-色氨酸產(chǎn)量的影響如圖2所示.由圖2可知:試驗(yàn)組和對(duì)照組的最終L-色氨酸質(zhì)量濃度分別為34.5，32.6 g/L,試驗(yàn)組的L-色氨酸產(chǎn)量較對(duì)照組提高了5.83%;在發(fā)酵初期,試驗(yàn)組和對(duì)照組的色氨酸生成速率基本一致;而在培養(yǎng)中后期,試驗(yàn)組的色氨酸生成速率明顯高于對(duì)照組.利用E.coli發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸,乙酸積累量的降低可以提高L-色氨酸的產(chǎn)量.添加精氨酸能提高HMP途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活力,會(huì)增加HMP途徑的代謝通量.添加精氨酸使HMP途徑代謝流提高,說(shuō)明碳代謝流由EMP途徑向HMP途徑發(fā)生遷移,有利于L-色氨酸的合成[10].同時(shí),HMP途經(jīng)代謝流的增加會(huì)提高還原力NADPH的供應(yīng)量,且NADPH的增多對(duì)L-色氨酸的生物合成有積極作用[11].因此,在L-色氨酸發(fā)酵中,添加精氨酸可以提高L-色氨酸產(chǎn)量.

圖2 精氨酸對(duì)L-色氨酸質(zhì)量濃度及其生成速率的影響 Fig.2 The effect of arginine on L-tryptophan concentration and its production rate

3.3 精氨酸對(duì)乙酸積累量的影響

圖3 精氨酸對(duì)乙酸積累量的影響Fig.3 The effect of arginine on acetic acid accumulation

精氨酸對(duì)乙酸積累量的影響如圖3所示.由圖3可知:試驗(yàn)組和對(duì)照組的乙酸積累量分別為2.51，2.82 g/L,試驗(yàn)組的乙酸積累量較對(duì)照組降低了10.99%.添加精氨酸會(huì)顯著提高胞內(nèi)ATP和NADH的水平,胞內(nèi)高水平的ATP可以為目的產(chǎn)物的合成提供足夠的能量物質(zhì),從而避免了由于能量不足而需要通過(guò)乙酸合成來(lái)提供能量.另外,由于鈣離子是丙酮酸激酶的強(qiáng)烈抑制劑,會(huì)強(qiáng)烈抑制丙酮酸激酶的活力[12].培養(yǎng)基中添加精氨酸會(huì)維持Ca2+的濃度,使EMP途徑丙酮酸激酶活力降低,減慢EMP途徑的酶反應(yīng)速率,進(jìn)而降低EMP途徑的代謝通量.EMP途徑代謝流的減弱,可以緩解EMP途徑與TCA循環(huán)存在的碳源溢流,使得副產(chǎn)物乙酸積累量降低.由于上述原因,在L-色氨酸發(fā)酵中,添加精氨酸可降低乙酸積累量.

3.4 精氨酸對(duì)葡萄糖消耗速率的影響

精氨酸對(duì)葡萄糖消耗速率的影響如圖4所示.由圖4可知:在L-色氨酸發(fā)酵過(guò)程中,培養(yǎng)初期試驗(yàn)組的葡萄糖消耗速率低于對(duì)照組,而在培養(yǎng)后期試驗(yàn)組的葡萄糖消耗速率高于對(duì)照組.由于EMP途徑代謝流的降低會(huì)降低葡萄糖的消耗速率,添加0.2 g/L的精氨酸時(shí),發(fā)酵前期的葡萄糖消耗速率較低.代謝副產(chǎn)物乙酸積累量的降低及L-色氨酸產(chǎn)量的提高,可提高糖酸轉(zhuǎn)化率.由L-色氨酸的產(chǎn)量及葡萄糖消耗速率計(jì)算可得,試驗(yàn)組和對(duì)照組的糖酸轉(zhuǎn)化率分別為18%和17.5%,試驗(yàn)組的糖酸轉(zhuǎn)化率較對(duì)照組提高了2.86%.

圖4 精氨酸對(duì)葡萄糖消耗速率的影響Fig.4 The effect of arginine on glucose consumption rate

4 結(jié) 論

在色氨酸發(fā)酵過(guò)程中,培養(yǎng)基中添加精氨酸可降低代謝副產(chǎn)物的積累量,提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量.試驗(yàn)結(jié)果表明:L-色氨酸發(fā)酵時(shí)添加0.2 g/L的精氨酸,生物量、L-色氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別為41.5 g/L,34.5 g/L和18.0%,較未添加時(shí)分別提高5.46%,5.83%和2.86%,且乙酸積累量較未添加時(shí)降低10.99%.在發(fā)酵過(guò)程中添加精氨酸可提高胞內(nèi)ATP和NADH的水平,胞內(nèi)高水平的ATP可以為目的產(chǎn)物的合成提供足夠的能量物質(zhì),從而避免了由于能量不足而需要通過(guò)乙酸合成來(lái)提供能量;同時(shí)添加精氨酸能提高HMP途徑中6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活力,會(huì)增加HMP途徑的代謝通量,進(jìn)而促進(jìn)L-色氨酸的生成.總之,在色氨酸發(fā)酵過(guò)程中添加精氨酸對(duì)副產(chǎn)物積累量的降低及產(chǎn)物產(chǎn)量的提高具有一定促進(jìn)作用,但本實(shí)驗(yàn)僅針對(duì)精氨酸單一因素對(duì)L-色氨酸發(fā)酵的影響進(jìn)行探究,其他氨基酸的添加及氨基酸混合添加及其交互作用對(duì)發(fā)酵的影響有待進(jìn)一步研究.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Effect of arginine on L-tryptophan production byEscherichiacoli

YANG Mengchen, LIU Zhenyu, CHEN Ning, XU Qingyang

(1. National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 2. Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China; 3. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China)

L-tryptophan, one of the essential amino acids for human and animals, is widely used in the food, feed stuff and pharmaceutical industries. L-tryptophan producing strainEscherichiacoliTRTH was used as original strain in this article and sodium arginine was added to the medium to decrease the accumulation of by-products and increase the yield of desired product. The effects of sodium arginine on L-tryptophan fermentation were investigated in a 30 L fermentor. The results indicated that when added with 0.2 g/L sodium arginine, the biomass, L-tryptophan production and glucose conversion rate were 41.5 g/L, 34.5 g/L and 18.0%, respectively, increased by 5.46%, 5.83% and 2.86% compared with that without sodium arginine addition, and the accumulation of acetate was decreased by 10.99%.

arginine;Escherichiacoli; L-tryptophan; acetate

2016-05-13

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(14ZCZDSY00015);天津市科技特派員項(xiàng)目(15JCTPJC57000)

楊夢(mèng)晨(1991—),男,山東青島人,碩士研究生,研究方向?yàn)榇x控制發(fā)酵,E-mail:846756016@qq.com.

TQ92

A

1674-2214(2017)01-0016-04