p16/Ki67雙染在宮頸病變檢出中的作用

葛雪飛　張睿怡　游　珂　郭艷利　李子健　耿　力

北京大學(xué)第三醫(yī)院(100083)

目前宮頸癌發(fā)病率占中國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第一位，每年宮頸癌新發(fā)病例約10萬[1-2]。宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，可通過早期篩查發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌和宮頸病變，實(shí)現(xiàn)早期診斷、早期治療。目前宮頸癌篩查方案多樣，但均有不同的局限性。細(xì)胞學(xué)由最初的傳統(tǒng)宮頸涂片進(jìn)展到現(xiàn)今的液基細(xì)胞學(xué)制片技術(shù)，其細(xì)胞涂片質(zhì)量明顯提高，但仍有假陰性的問題存在，并且其需要細(xì)胞病理學(xué)家的診斷，使細(xì)胞學(xué)的進(jìn)展受到制約[3]。大量研究表明高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續(xù)感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，尤其是宮頸癌標(biāo)本中可檢測出高危型HPV，此后HR-HPV檢測成為篩查手段之一。2015年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學(xué)會(huì)的宮頸癌篩查過渡期指南中明確指出HR-HPV篩查的靈敏度高于細(xì)胞學(xué)，但特異度不滿意。p16/Ki67雙染是一種近年新出現(xiàn)的宮頸病變檢出手段。若同一細(xì)胞中檢測到 p16和Ki67共表達(dá)，可作為細(xì)胞周期失調(diào)的標(biāo)志物，強(qiáng)烈提示高級別病變[4-5]。本文對92位婦女進(jìn)行p16/Ki67雙染檢測，計(jì)算靈敏度、特異度等指標(biāo)，并按年齡與HR-HPV感染與否再次分組，分析雙染在≥30歲婦女、HR-HPV(+)婦女中的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年1-5月在北京大學(xué)第三醫(yī)院婦科門診進(jìn)行機(jī)會(huì)性篩查的105位婦女，最終獲得92例完整樣本。婦女年齡21～65歲，其中≥30歲婦女有78例，每位婦女均行液基細(xì)胞學(xué)檢測(TCT)、HR-HPV檢測、p16/Ki67雙染檢測，并對HR-HPV(+)的非典型鱗狀細(xì)胞(ASC-US)、HPV16或HPV18型陽性、細(xì)胞學(xué)異常等行陰道鏡檢查和活檢組織病理學(xué)檢查，其中細(xì)胞學(xué)異常包括ASC-US、非典型鱗狀細(xì)胞-不除外宮頸高度上皮內(nèi)病變(ASC-H)、低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)、非典型腺細(xì)胞(AGC)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

p16/Ki67雙染采用CINtec PLUS細(xì)胞學(xué)試劑盒(羅氏公司，德國)檢測。處理子宮頸細(xì)胞后立即進(jìn)行BD SurePath樣本制備，經(jīng)過95%酒精固定、染色、洗潔精清洗、封固等過程，最終鏡下觀察并拍照記錄。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 p16/Ki67雙染結(jié)果判讀細(xì)胞質(zhì)染色棕色(p16)、細(xì)胞核染色紅色(Ki-67)，若在同一個(gè)焦距下觀察到特定的紅染細(xì)胞核和棕染細(xì)胞質(zhì)，則判讀為陽性細(xì)胞。

1.3.2細(xì)胞學(xué)、HR-HPV、組織病理學(xué)結(jié)果判讀細(xì)胞學(xué)結(jié)果ASC-US及以上病變記為異常；14型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)HR-HPV結(jié)果只要有一項(xiàng)為陽性則記為陽性，結(jié)果均陰性記為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0和Medcalc14.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)算p16/Ki67雙染檢測檢出CIN2及以上病變的靈敏度、特異度、陽性似然比、陰性似然比、ROC曲線下面積(AUC)等指標(biāo)，所有檢驗(yàn)結(jié)果以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同方法檢測檢出CIN2及以上病變效力比較

p16/Ki67雙染檢出CIN2及以上病變的靈敏度與TCT、HR-HPV檢測相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.000；P=0.424)；檢出特異度與TCT、HR-HPV檢測相比均提高(P=0.001；P=0.001)，AUC指數(shù)與HR-HPV、TCT相比有差異(P=0.001；P<0.001)；p16/Ki67雙染的陽性似然比較TCT、HR-HPV檢測升高，陰性似然比降低(表1)。

表1　3種方法檢測檢出CIN2及以上宮頸病變的靈敏度、特異度比較

2.2 不同方法在≥30歲婦女中檢出CIN2及以上病變效力的比較

92例婦女中≥30歲78例，≥30歲婦女p16/Ki67雙染檢出CIN2及以上病變的靈敏度與TCT、HR-HPV檢測相比無差異(P=0.581；P=1.000)；檢出特異度與TCT、HR-HPV檢測相比提高(P=0.001；P=0.001)；AUC指數(shù)與HR-HPV、TCT檢測相比有差異(P<0.0011；P<0.0001)；陽性似然比較TCT、HR-HPV(1.20；1.23)檢測提高2倍以上，陰性似然比降低。在<30組婦女(14例)中p16/Ki67雙染、TCT、HR-HPV檢測的靈敏度、特異度、陽性似然比和AUC指標(biāo)無差異。見表2。

表2　3種方法在不同年齡組婦女檢測檢出宮頸病變的靈敏度、特異度比較

2.3 p16/Ki67雙染、TCT檢測在HR-HPV感染婦女中檢出CIN2及以上病變效力的比較

根據(jù)是否感染HR-HPV分組，HR-HPV(+)婦女80例，HR-HPV(-)婦女12例。HR-HPV(+)組中p16/Ki67雙染與TCT檢出CIN2及以上病變的靈敏度無差異(P=1.000)，p16/Ki67雙染的特異度較TCT增高(P=0.016)；p16/Ki67雙染的AUC優(yōu)于TCT檢測(P=0.006)(表3)。

表3　HR-HPV(+)兩種方法檢測宮頸病變的靈敏度、特異度比較

HR-HPV(-)組中p16/Ki67雙染和TCT檢出CIN2及以上病變的靈敏度、特異度(P=1.000，P=0.063)無差異；p16/Ki67雙染的AUC優(yōu)于TCT檢測(P=0.007)(表4)。最后分析≥30歲婦女中HR-HPV(+)時(shí)p16/Ki67雙染、TCT檢出CIN2及以上病變的靈敏度無差異(P=0.774)，p16/Ki67雙染的特異度較TCT增高(P=0.016)；p16/Ki67雙染的AUC指標(biāo)優(yōu)于TCT檢測(P=0.002)(表5)。由表3和表5可知，HR-HPV(+)婦女和≥30歲HR-HPV(+)婦女中，p16/Ki67雙染檢出CIN2及以上病變的特異度較TCT增高。

表4　HR-HPV(-)婦女兩種方法檢測宮頸病變的靈敏度、特異度比較

表5　HR-HPV(+)≥30歲婦女兩種方法檢測宮頸病變的靈敏度、特異度比較

3 討論

本次研究首先對92例樣本進(jìn)行p16/Ki67雙染、TCT、HR-HPV檢測比較，發(fā)現(xiàn)雙染與后兩者檢出宮頸病變的靈敏度相似，而特異度較其他兩種方法明顯提高，AUC、陽性似然比增高，陰性似然比降低。陽性似然比反映篩查實(shí)驗(yàn)真陽性與假陽性的比值，比值越大，試驗(yàn)結(jié)果陽性時(shí)為真陽性的概率越大。而陰性似然比越小，試驗(yàn)結(jié)果陰性時(shí)為真陰性的可能性越大。AUC為ROC曲線下面積，數(shù)值越大說明篩查實(shí)驗(yàn)的靈敏度、特異度越高。因此本研究表明p16/Ki67雙染在宮頸癌篩查中有更高的應(yīng)用價(jià)值，而且該結(jié)論同樣適用于≥30歲婦女。在Ordi等[6]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)≥30歲婦女組p16/Ki67雙染檢出CIN1及以上病變的靈敏度特異度較高，在<30歲婦女組中檢出病變的特異度是二代雜交捕獲法(HC2)檢測的2倍。由此推測p16/Ki67雙染可能在<30歲婦女中有更高的應(yīng)用價(jià)值。而本研究并沒有相似的結(jié)論，可能與檢出病變的級別不同和<30歲婦女樣本例數(shù)少有關(guān)。

1977年ZurHausen發(fā)現(xiàn)宮頸癌發(fā)生的一個(gè)重要原因是HPV感染，研究表明由于HR-HPV的E7癌蛋白介導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)失活，p16蛋白強(qiáng)烈過表達(dá)[7]。由于E7是HPV相關(guān)性癌前病變和癌變中維持惡性表型的必要因素，因此p16過表達(dá)與HR-HPV的致癌活性直接相關(guān)，并被認(rèn)為是HPV感染轉(zhuǎn)化的標(biāo)記物[8]。Ki67是一種細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白，只可在增殖細(xì)胞的細(xì)胞核中檢出[4]。Ki67在細(xì)胞增殖的所有階段都可檢出，但G0期的靜止或靜息細(xì)胞不表達(dá)。在正常生理?xiàng)l件下同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)增殖標(biāo)記物Ki67和 p16應(yīng)當(dāng)彼此相互排斥，因此細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)Ki67和 p16可作為細(xì)胞周期調(diào)控失常的一個(gè)指標(biāo)[5,9]。

對HR-HPV(+)婦女進(jìn)行p16/Ki67雙染與TCT檢測，兩種檢測手段檢出CIN2及以上病變的靈敏度相同、特異度較TCT提高了1倍；陽性似然比較TCT明顯升高，陰性似然比較TCT降低，AUC指數(shù)比TCT提高，表明p16/Ki67雙染降低了漏診率；以上數(shù)據(jù)均表明p16/Ki67雙染與TCT相比在HR-HPV(+)婦女中對宮頸病變的檢出價(jià)值更高。與Ebisch[10]等研究結(jié)果中p16/Ki67雙染與TCT檢測有相似的靈敏度，特異度有差異。Wentzensen等[11]發(fā)現(xiàn)，與HR-HPV陽性婦女分診的細(xì)胞學(xué)相比，p16/Ki67雙染的特異度增加，靈敏度保持不變。Luttmer等[12]也證實(shí)p16/Ki67雙染檢測是HR-HPV(+)婦女的分流方法，對檢出CIN3及以上病變的靈敏度、特異度增加。然而在其他的研究中卻有不同的研究結(jié)果[13-14]，p16/Ki67雙染與TCT相比，在HR-HPV(+)婦女中檢出CIN3及以上病變的靈敏度增加10%以上且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異、然而特異度無差異。這兩組研究結(jié)果分別代表KPNC和ATHENA兩項(xiàng)研究。在KPNC研究中細(xì)胞學(xué)診斷采取的是計(jì)算機(jī)輔助篩選的液基薄片，然后由了解患者HPV狀態(tài)的細(xì)胞病理專家進(jìn)行審查，而且最初分類陰性的HR-HPV(+)病例會(huì)被重新篩檢。然而在ATHENA研究中細(xì)胞病理專家并不了解患者的HPV感染情況，這可能導(dǎo)致KPNC研究中的靈敏度較ATHENA研究高。一項(xiàng)研究[15]選擇了ATHENA研究中的一部分?jǐn)?shù)據(jù)，在告知患者HPV感染情況下，細(xì)胞學(xué)和雙染對檢查CIN3及以上病變的敏感性分別提高了8.3%和23%，間接證實(shí)了上述推論。

由于p16/Ki67雙染在HR-HPV(+)和≥30歲兩種不同分組中均存在靈敏度與TCT檢測相似，而特異度明顯提高的特點(diǎn)。為了明確在≥30歲的HR-HPV(+)婦女中p16/Ki67雙染的應(yīng)用價(jià)值，我們將68名符合條件的婦女再次進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雙染的靈敏度與TCT相似，特異度提高。

本次研究不僅對HR-HPV(+)婦女進(jìn)行分析研究外，還首次比較了p16/Ki67雙染與TCT檢測在HR-HPV(-)婦女中檢出CIN2及以上病變的靈敏度、特異度等指標(biāo)。HR-HPV(-)組中p16/Ki67雙染、TCT檢出CIN2及以上病變的靈敏度無差異、而特異度提高；陽性似然比也提高；兩者AUC值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從而表明在HR-HPV(-)婦女中進(jìn)行p16/Ki67雙染有較高的診斷價(jià)值，由于本次HR-HPV(-)婦女僅有12例，入組病例少，需要擴(kuò)大樣本量做更深入的研究。

[1]陳萬青，鄭榮壽，張思維，等. 2013年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中國腫瘤,2017,26(1):1-7.

[2]Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA: A Cancer Journal for Clinicians,2016,66(2):115-132.

[3]王軼英，王悅，喬友林，等. 中國宮頸癌篩查未來之路——細(xì)胞學(xué)初篩的棄或守[J]. 中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2017,33(03):324-326.

[4]Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown[J]. J Cell Physiol,2000,182(3):311-322.

[5]Wentzensen N, Doeberitz M. Biomarkers in Cervical Cancer Screening[J]. Disease Markers,2007,23(4):315-330.

[6]Ordi J, Sagasta A, Munmany M, et al. Usefulness of p16/Ki67 immunostaining in the triage of women referred to colposcopy[J]. Cancer Cytopathol,2014,122(3):227-235.

[7]Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide[J]. J Pathol,1999,189(1):12-19.

[8]Sano T, Oyama T, Kashiwabara K, et al. Expression Status of p16 Protein Is Associated with Human Papillomavirus Oncogenic Potential in Cervical and Genital Lesions[J]. American Journal of Pathology,1998,153(6):1741-1749.

[9]Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D, et al. Overexpression of p16INK4A as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri[J]. Int J Cancer,2001,92(2):276-284.

[10]Ebisch RM, van der Horst J, Hermsen M, et al. Evaluation of p16/Ki-67 dual-stained cytology as triage test for high-risk human papillomavirus-positive women[J]. Mod Pathol,2017,30(7):1021-1031.

[11]Wentzensen N, Fetterman B, Castle PE, et al. p16/Ki-67 Dual Stain Cytology for Detection of Cervical Precancer in HPV-Positive Women[J]. J Natl Cancer Inst, 2015,107(12):257.

[12]Luttmer R, Dijkstra MG, Snijders P, et al. p16/Ki-67 dual-stained cytology for detecting cervical (pre)cancer in a HPV-positive gynecologic outpatient population[J]. Modern Pathology,2016,29(8):870-878.

[13]Wright TC, Behrens CM, Ranger-Moore J, et al. Triaging HPV-positive women with p16/Ki-67 dual-stained cytology: Results from a sub-study nested into the ATHENA trial[J]. Gynecologic Oncology,2017,144(1):51-56.

[14]Gustinucci D, Rossi PG, Cesarini E, et al. Use of Cytology, E6/E7 mRNA, and p16 INK4a-Ki-67 to Define the Management of Human Papillomavirus (HPV)-Positive Women in Cervical Cancer Screening[J]. AJCP,2015,145(1):35-45.

[15]Wright TC, Stoler MH, Aslam S, et al. Knowledge of Patients’ Human Papillomavirus Status at the Time of Cytologic Review Significantly Affects the Performance of Cervical Cytology in the ATHENA Study[J].AJCP,2016,146(3):391-398.