梔子對大鼠腸道菌群及血清細(xì)胞因子的影響

俞 琦 梁建東 王 平 田維毅貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025

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實(shí)驗(yàn)研究

梔子對大鼠腸道菌群及血清細(xì)胞因子的影響

俞 琦 梁建東 王 平 田維毅*
貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025

目的：觀察梔子對大鼠腸道菌群和血清細(xì)胞因子的影響。方法：將40只大鼠隨機(jī)分成正常對照組、抗生素對照組和梔子高/中/低劑量組，抗生素對照組和梔子高、中、低劑量組分別給予鹽酸林可霉素和不同劑量梔子水提物灌胃，正常對照組代以生理鹽水，連續(xù) 14d。觀察各組大鼠一般情況，檢測大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌菌群數(shù)量，及血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)表達(dá)水平。結(jié)果：與正常對照組比較，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠出現(xiàn)腹瀉，體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)；抗生素對照組大鼠腸道內(nèi)4種菌群數(shù)量均發(fā)生明顯改變(P<0.05或P<0.01)；梔子中、高劑量組大鼠腸桿菌菌群數(shù)明顯降低(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無明顯變化；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；梔子高劑量組大鼠血清TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：梔子對腸道菌群有一定影響，但不引起腸道菌群失調(diào)，梔子可下調(diào)血清TNF-α和IL-6水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

梔子；大鼠；腸道菌群；細(xì)胞因子

中藥梔子(GardeniajasminoidesEllis)是茜草科植物梔子的干燥成熟果實(shí)，具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒的功效，臨床主要用于急性黃疸型肝炎、膀胱炎、目赤腫痛、上消化道出血等癥[1]。梔子性味苦、寒，歸心、肺、三焦經(jīng)，為常見的苦寒藥物。歷代醫(yī)藥學(xué)家認(rèn)為其苦寒礙胃，有耗氣傷陰之弊?，F(xiàn)代研究表明[2]，苦寒中藥可通過干預(yù)腸道菌群的種類、數(shù)量、比例、定位等生態(tài)因素，影響腸道代謝和免疫防御等功能。本研究擬建立不同劑量的梔子水提物灌胃模型，觀察梔子對大鼠腸道中4種優(yōu)勢菌群和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、γ-干擾素(IFN-γ)表達(dá)的影響，探討苦寒藥梔子對腸道生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用，為其臨床的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 動(dòng)物 SPF級SD大鼠40只，雌雄各半，體重(200±20)g，購于重慶滕鑫生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK-(軍)2012-0011。

1.2 材料 梔子購于北京同仁堂貴陽藥店，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥教研室鑒定為正品。鹽酸林可霉素注射液(河南天方藥業(yè)有限公司，批號070120049)，雙歧桿菌BS培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂(青島海博生物技術(shù)有限公司)，伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB培養(yǎng)基，杭州微生物試劑有限公司)，大鼠TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA檢測試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3 儀器 SW-CJ-1F超凈工作臺(蘇州凈化)；厭氧培養(yǎng)袋(日本三菱)；371型培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)；高速低溫離心機(jī) 5804D(德國Eppendorf公司)。

2 方法

2.1 中藥水提物的制備 按照規(guī)范制劑要求，常規(guī)制備梔子水提液，調(diào)整濃度相當(dāng)于生藥2g/mL冷藏備用。

2.2 動(dòng)物分組及處理 取40只大鼠隨機(jī)分成正常對照組、抗生素對照組及梔子高、中、低劑量組，每組8只。梔子水提液以成年人(按60kg計(jì)算)常規(guī)用藥劑量的等效劑量為中劑量，大劑量為中劑量 5倍，小劑量為中劑量的 1/5。即梔子高、中、低劑量組分別以7.5、1.5、0.3g/kg灌胃給藥，抗生素對照組給予鹽酸林可霉素灌胃[3]，各組給藥體積為2mL/只，正常對照組給予等體積生理鹽水，每日1 次，連續(xù) 14d。

2.3 一般情況觀察 觀察和記錄各組大鼠活動(dòng)、飲食、排便情況，用藥第1天、第7天、第14天稱量各組大鼠體質(zhì)量，記錄大鼠體質(zhì)量變化。

2.4 主要菌群分析 末次給藥24h后，大鼠股靜脈取血，4℃靜置過夜，離心取上清，置于-20℃冰箱待測。參照文獻(xiàn)[4]，處死各組大鼠，剪開腹腔，無菌操作取盲腸內(nèi)容物0.1g，放入無菌試管內(nèi)，加0.9mL生理鹽水，均勻震蕩15min，將震蕩好的溶液進(jìn)行10倍系列稀釋至10-9，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選用合適的稀釋度，分別接種于各種培養(yǎng)基中，雙歧桿菌：BS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)72 h；乳桿菌：MRS培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h；腸桿菌：EMB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h；腸球菌：膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂，37℃培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后計(jì)數(shù)菌落，根據(jù)稀釋度換算每g糞便中的細(xì)菌數(shù)，結(jié)果以菌落形成單位/克(CFU/g)的對數(shù)表示，即lg CFU/g。

2.5 血清細(xì)胞因子水平檢測 取凍存血清，采用ELISA法，測定TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)意義。

3 結(jié)果

3.1 梔子對大鼠一般情況的影響 正常對照組和梔子低劑量組大鼠進(jìn)食和飲水量正常，被毛光滑致密，無腹瀉；梔子中劑量組大鼠進(jìn)食量逐漸下降，活動(dòng)減少，毛色光澤度降低，出現(xiàn)腹瀉，排稀便。抗生素對照組和梔子高劑量組大鼠進(jìn)食飲水明顯減少，腹瀉較重，畏寒倦怠，被毛凌亂無光澤。灌胃后，隨時(shí)間延長各組大鼠體質(zhì)量逐漸上升，但抗生素對照組、梔子高劑量組上升緩慢，且在用藥后期呈現(xiàn)下降趨勢。與正常對照組比較，用藥第7 天，抗生素對照組和梔子高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著降低(P<0.05)；用藥第14 天，抗生素對照組和梔子中、高劑量組大鼠體質(zhì)量均明顯下降(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化 (x±s,n=8,g)

注：與正常對照組比較,*P<0.05，#P<0.01。

3.2 梔子對大鼠腸道菌群數(shù)量的影響 與正常對照組比較，抗生素對照組大鼠腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌和腸桿菌的數(shù)量發(fā)生明顯改變(P<0.05或P<0.01)；梔子低劑量對大鼠腸道中以上4種菌群無明顯影響；在梔子中、高劑量干預(yù)下，大鼠腸桿菌菌群數(shù)顯著降低(P<0.05或P<0.01)，雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌菌群無明顯變化。見表2。

表2 梔子對大鼠腸道菌群的影響 (x±s,n=8,lgCFU/g)

注：與正常對照組比較，*P<0.05,#P<0.01。

3.3 梔子對大鼠血清細(xì)胞因子的影響 與正常對照組比較，抗生素對照組大鼠血清內(nèi)TNF-α、IL-6和IFN-γ均明顯增加(P<0.01)；梔子中劑量組大鼠血清TNF-α水平明顯下降(P<0.05)；梔子高劑量能顯著降低大鼠血清TNF-α和IL-6水平(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3 梔子對大鼠血清細(xì)胞因子的影響 (x±s,n=8,pg/mL)

注：與對照組比較，*P<0.05,#P<0.01。

4 討論

苦寒藥物是最常用的中藥類別之一，在臨床各科有著廣泛應(yīng)用?？嗪幋蠖嘤袨a下之功，長期或大量使用容易導(dǎo)致腹部隱痛、腹脹、腹瀉等癥狀。人和動(dòng)物胃腸道定居著種類復(fù)雜和數(shù)量龐大的正常微生物群，它們與機(jī)體間形成了互利共生的關(guān)系，保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，并對機(jī)體的物質(zhì)代謝和免疫防御起著重要作用。包括藥物在內(nèi)的某些因素導(dǎo)致正常菌群的數(shù)量和比例發(fā)生大幅度改變時(shí)即為菌群失調(diào)，常引起急慢性腹瀉和免疫功能紊亂等表現(xiàn)[5]。梔子是臨床常用的苦寒中藥，為了探討梔子對腸道微生態(tài)和機(jī)體免疫的影響，本研究觀察了口服梔子水提物對大鼠4種優(yōu)勢腸道菌群和血清細(xì)胞因子表達(dá)的影響。

結(jié)果顯示，梔子中、高劑量可引起大鼠腹瀉、體質(zhì)量減輕，提示連續(xù)服用較大劑量梔子具有明顯的瀉下作用。梔子低劑量對4種腸道優(yōu)勢菌群無影響，中、高劑量對大鼠腸道內(nèi)腸桿菌有一定抑制作用，但不影響雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌的數(shù)量，提示梔子的應(yīng)用沒有導(dǎo)致大鼠菌群失調(diào)，而是起到調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。雙歧桿菌和乳桿菌被認(rèn)為是腸道的益生菌，可維持腸道的健康環(huán)境，并通過競爭性抑制阻礙致病菌的黏附與定植，其產(chǎn)生的有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物還能抑制或殺死有害生物[6]。梔子保持雙歧桿菌、乳桿菌菌群的相對穩(wěn)定，提示該藥對腸粘膜可能有重要的保護(hù)效應(yīng)。

TNF-α、IL-6和IFN-γ是由多種免疫細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子，介導(dǎo)機(jī)體組織細(xì)胞的生長、分化和功能調(diào)控，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫并引起炎癥反應(yīng)。羅霞等[7]、孫必強(qiáng)等[8]認(rèn)為菌群失調(diào)與炎癥因子的釋放水平相關(guān)。研究顯示，抗生素對照組大鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平均顯著升高，提示菌群失調(diào)可能與炎癥反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)，與文獻(xiàn)研究一致[7-8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，梔子未導(dǎo)致明顯菌群失調(diào)，但不同程度地抑制了大鼠血清中TNF-α和IL-6的釋放，提示該藥對機(jī)體細(xì)胞因子的釋放具有不同程度的調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1]傅春升，婁紅祥，張學(xué)順，等.梔子的化學(xué)成分與藥理作用[J].國外醫(yī)藥·植物藥分冊，2004，19(4)：152.

[2] 吳云，陳瑞，田維毅.苦寒中藥對腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的研究進(jìn)展[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，2015，27(2)：235-239.

[3] 于蓮，張靈芝，馬淑霞，等.納米山藥多糖合生元結(jié)腸靶向微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對菌群失調(diào)大鼠細(xì)胞因子和凋亡蛋白表達(dá)影響[J].中國新藥雜志，2016，25(24)：2871-2875.

[4] 林曦，謝曉煌，吳仕嬌，等.甲嘎松湯對急性肝損傷小鼠腸道菌群及細(xì)胞因子的影響[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，22(10)：10-17.

[5] 祝司霞.腸道菌群失調(diào)與疾病[J].科技信息，2012(25):446.

[6] 王福穎.德氏乳桿菌微膠囊性能評價(jià)及對腸道菌群調(diào)節(jié)作用研究[D].哈爾濱: 黑龍江大學(xué)，2014．

[7] 羅霞，羅爽，鄭彥懿，等.腸道菌群失調(diào)增加小鼠腸上皮內(nèi)T淋巴細(xì)胞活化和促炎細(xì)胞因子分泌[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2016，32(8):1031-1035.

[8]孫必強(qiáng)，周英，劉衛(wèi)東，等.不同劑型七味白術(shù)散對腸道菌群失調(diào)小鼠腸黏膜和血清 TNF-α，IL-6的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22(4):95-100.

俞琦(1978-)，女，漢族，博士研究生在讀，副教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail:sgyq.a@163.com

田維毅(1972-),男，漢族，博士，教授，研究方向?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E-mail:743094997@qq.com

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1007-8517(2017)07-0029-03

2017-01-23 編輯：程鵬飛)