基于UPLC/Q—TOF—MS/MS技術(shù)快速分析淫羊藿總黃酮膠囊中的化學(xué)成分

于雪娥+秦建平+李家春+黃文哲+王振中+蕭偉

[摘要] 應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC/Q-TOF-MS/MS），對淫羊藿總黃酮膠囊的化學(xué)成分進行分析和鑒定，采用Agilent SB-C₁₈色譜柱 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相，梯度洗脫，體積流速0.3 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進樣量2 μL。質(zhì)譜采用電噴霧（ESI）離子源，正負離子模式下采集數(shù)據(jù)，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量，二級質(zhì)譜裂解碎片和色譜峰保留時間等信息結(jié)合對照品的碎片裂解規(guī)律和文獻數(shù)據(jù)進行結(jié)構(gòu)鑒定。結(jié)果共鑒定或推測出46個化合物，包括黃酮苷類、酚酸類以及生物堿類化合物。該結(jié)果為淫羊藿總黃酮膠囊的質(zhì)量控制、后期臨床應(yīng)用提供了技術(shù)支持，并為進一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

[關(guān)鍵詞] 淫羊藿總黃酮膠囊；UPLC/Q-TOF-MS/MS；黃酮苷；酚酸；生物堿

[Abstract] To analyze and identify the chemical constituents from Yinyanghuo Zonghuangtong capsule by using UPLC/Q-TOF-MS/MS. Chromatographic separation was carried out on an Agilent SB-C₁₈ column （2.1 mm×100 mm，1.8 μm） at the temperature of 30 ℃. The mobile phase was 0.1% formic acid and acetonitrile by gradient elution，with a flow rate at 0.30 mL·min^-1，and the injection volume of 2 μL. The MS spectrum was acquired in both negative and positive ion modes using ESI ion source. Based on relative accurate molecular weight，secondary mass spectrometry pyrolysis fragments and chromatographic peak retention time，as well as fragmentation regularity summarized from reference substance and the literature，we could effectively identify the chemical structure of the components under test. As a result，a total of 46 compounds，including flavonoid glycosides，phenolic acids and alkaloids，were successfully identified or tentatively predicted. The results provide technical support for quality control and late-stage clinical application of Yinyanghuo Zonghuangtong capsule，and reference for further expound the pharmacodynamic material basis.

[Key words] Yinyanghuo Zonghuangtong capsule；UPLC/Q-TOF-MS/MS；flavonoid glycosides；phenolic acids；alkaloids

doi：10.4268/cjcmm20162417

淫羊藿總黃酮膠囊由小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.的總黃酮提取物制成，具有溫補腎陽、強筋健骨的功效，于2014年獲得新藥證書，臨床用于原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥腎陽虛證。總黃酮作為淫羊藿的主要活性成分，具有廣泛的藥理作用，如壯陽，抗骨質(zhì)疏松，保護神經(jīng)系統(tǒng)，促進免疫系統(tǒng)，抗癌等[1-5]，是最具開發(fā)潛力的中藥有效部位之一。目前，針對淫羊藿藥材化學(xué)成分分析的相關(guān)研究已有不少報道[6-8]，且不同品種的淫羊藿所含化學(xué)成分相差較大，而針對淫羊藿總黃酮膠囊全面的化學(xué)成分分析還未見報道，物質(zhì)基礎(chǔ)的不明確一定程度上限制了其質(zhì)量控制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究。鑒于淫羊藿不同品種化學(xué)成分之間的差異性[7]，現(xiàn)有文獻資料對淫羊藿總黃酮膠囊的質(zhì)量控制以及后續(xù)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)深入研究有一定的參考價值但不具指導(dǎo)意義，為了順利進行淫羊藿總黃酮膠囊進一步的深入研究，加深對產(chǎn)品的認識，為臨床用藥以及學(xué)術(shù)推廣提供科學(xué)依據(jù)，有必要對淫羊藿總黃酮膠囊的化學(xué)成分進行全面、系統(tǒng)的研究。

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC/Q-TOF-MS/MS）技術(shù)具有高分辨率、高靈敏度、用時短、掃描范圍廣等特點，是一種在定性分析中具有獨特優(yōu)勢的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，現(xiàn)已廣泛運用到中藥化學(xué)成分分析、血清藥物化學(xué)、代謝組學(xué)等研究領(lǐng)域中[9-11]。本研究擬采用UPLC/Q-TOF-MS/MS技術(shù)對淫羊藿總黃酮膠囊的化學(xué)成分進行分析，為進一步研究淫羊藿總黃酮膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 1290 超高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫公司）；Agilent 6538 Q-TOF質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；Mettler Toledo XP6電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Mettler Toledo MS-105DU電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-250 DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；H1650-W臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Milli-Q Academic 純水機（美國密理博公司）。色譜乙腈（德國默克公司）；色譜甲酸（美國天地公司）。

淫羊藿苷（批號110737-201516），朝藿定C（批號111780-201503），寶藿苷Ⅰ（批號111852-201102）對照品由中國食品藥品檢定研究院提供；朝藿定A₁（批號MUST-1509113），朝藿定A（批號MUST-15010408），朝藿定B（批號MUST-15010409），淫羊藿次苷Ⅰ（批號MUST-15041511）對照品均由成都曼斯特生物科技有限公司提供；鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ（批號20150320）購自寶雞市辰光生物科技有限公司。

淫羊藿總黃酮膠囊（批號150501）購自江蘇康緣陽光藥業(yè)有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件

Agilent Zorbax SB-C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～14 min，15%～30% B；14～21 min，30%～39% B；21～26 min，39%～44% B；26～35 min，44%～80% B），流速0.3 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進樣量2 μL，檢測波長270 nm。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正/負離子模式，掃描范圍m/z 100～2 000；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣體積流量10 L·min^-1；霧化氣壓力310 kPa；毛細管電壓，負離子模式3 500 V，正離子模式4 000 V；碎片電壓135 V，錐孔電壓65 V；MS/MS分析中的碰撞能根據(jù)不同化合物的需要在10～55 eV設(shè)定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集的頻率為每0.5 s采集1次圖譜；儀器分辨率大于2萬。

2.3 供試品溶液的制備

取本品10粒，去膠囊殼，內(nèi)容物混合研細，取約20 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，甲醇稀釋至刻度，搖勻，12 000 r·min^-1離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 對照品溶液的制備

分別取朝藿定A₁，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ，淫羊藿次苷Ⅰ和寶藿苷Ⅰ對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成含各成分質(zhì)量濃度依次為59.8，52.5，40.7，57.6，47.2，54.3，47.9，47.6 mg·L^-1的單標(biāo)溶液以及含各成分質(zhì)量濃度為10～25 mg·L^-1的混合對照品溶液。

3 結(jié)果與分析

為了便于對淫羊藿總黃酮膠囊中的化學(xué)成分進行系統(tǒng)、快速的分析，首先對現(xiàn)有對照品的質(zhì)譜裂解規(guī)律進行了分析，結(jié)合相關(guān)研究資料推導(dǎo)可能的裂解途徑及規(guī)律。查閱相關(guān)文獻資料及公共數(shù)據(jù)庫，建立已從淫羊藿藥材中分離鑒定得到的化合物數(shù)據(jù)庫，總結(jié)化合物結(jié)構(gòu)特征并分類。再對淫羊藿總黃酮膠囊樣品進行UPLC/Q-TOF-MS/MS分析，通過一級質(zhì)譜給出的精確相對分子質(zhì)量信息進行元素組成分析，得到可能分子式，選擇偏差在5以內(nèi)的進行數(shù)據(jù)庫自動匹配，得到候選化合物。再利用二級質(zhì)譜提供的豐富的碎片離子信息，結(jié)合對照品裂解規(guī)律及相關(guān)文獻資料對目標(biāo)化合物進行鑒定和確證，并對未知化合物的結(jié)構(gòu)進行分析與推測。

淫羊藿總黃酮膠囊供試品溶液及對照品溶液的TIC圖和UPLC圖見圖1，2。大多數(shù)色譜峰在負離子模式下有較高響應(yīng)，個別成分在正離子模式下響應(yīng)較好，選擇負離子模式作為主要分析對象，正離子模式輔助進行化合物的結(jié)構(gòu)鑒定。

3.1 對照品UPLC/Q-TOF-MS/MS裂解規(guī)律解析

朝藿定A₁，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷，淫羊藿次苷Ⅰ，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和寶藿苷Ⅰ均為8-異戊烯基取代的黃酮苷類化合物，是淫羊藿黃酮的特征性成分[12]，結(jié)構(gòu)式見圖3。8個對照品具有相同的苷元母核，anhydroicaritin（8-異戊烯基取代的山柰素），區(qū)別在于3位和7位所連的糖基不同，在MS/MS分析中也表現(xiàn)出了類似的裂解行為。在負離子模式下，均能給出[M-H]^-準(zhǔn)分子離子峰，有的顯示較高豐度的[M+HCOOH-H]^-分子離子峰。另外，發(fā)現(xiàn)負離子模式下朝藿定A₁，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅰ7-位的葡萄糖基很容易丟失而產(chǎn)生豐度很高的[M-glu-H]^-特征離子，可以作為MS/MS分析的前體離子。而正離子模式下，該類化合物更傾向于丟失3位上的糖基，這可能與不同位置酚羥基的酸性不同有關(guān)（7，4′-二羥基>7-或 4′-羥基>3-羥基>5-羥基）[6]。MS/MS分析中，8個化合物均能給出特征性碎片離子m/z 367 [anhydroicaritin-H]^-或m/z 366 [anhydroicaritin-H]^-，由3-位和7-位上的糖基全部丟失得到。不同的是，淫羊藿苷還給出了m/z 409的碎片離子，可能由m/z 529 [M-H-rha]¹7-位上的葡萄糖分子裂解，丟失C₄H₈O₄碎片而得到。特征碎片m/z 367 [anhydroicaritin-H]^-或m/z 366 [anhydroicaritin-H]^-進一步可以裂解得到碎片離子m/z 352或351以及m/z 323，分別歸因于4′-位CH₃和4-位CO的丟失。對比發(fā)現(xiàn)m/z 367 [anhydroicaritin-H]^-和m/z 366 [anhydroicaritin-H]^-的裂解行為并不相同，分別以朝藿定C和淫羊藿次苷Ⅰ為例，推導(dǎo)其可能的裂解途徑，見圖4，5。8個對照品在負離子模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律見表1。

3.2 淫羊藿總黃酮膠囊樣品UPLC/Q-TOF-MS/MS分析及鑒定

淫羊藿總黃酮膠囊樣品的總離子流圖中共檢測出了響應(yīng)較好的化合物峰有49個，通過仔細分析，鑒定出了46種化合物，主要為黃酮苷類，還有3個酚酸類和1個生物堿類成分，見表2。淫羊藿總黃酮膠囊中的黃酮苷類化合物根據(jù)母核構(gòu)架不同可以分為以anhydroicaritin（8-異戊烯基山柰素）、demethylanhydroicaritin（8-異戊烯基山柰酚）、3′-hydroxyicariine（3′-羥基-8-異戊烯基山柰素）、山柰酚以及槲皮素為苷元的黃酮苷類，前三類是已有相關(guān)文獻報道[6-7]的淫羊藿藥材中主要存在的三大類具異戊烯基取代的黃酮苷類化合物，5種苷元結(jié)構(gòu)見圖3。

3.2.1 以anhydroicaritin為苷元的黃酮苷類 這類化合物的苷元離子是m/z 366或m/z 367，結(jié)構(gòu)特點及裂解規(guī)律在3.1項已討論過。峰24～27，29，43，45和48通過與對照品比對，分別確定為朝藿定A₁，朝藿定A，朝藿定B，朝藿定C，淫羊藿苷，淫羊藿次苷Ⅰ，鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ和寶藿苷Ⅰ。通過總結(jié)分析發(fā)現(xiàn)淫羊藿總黃酮膠囊中同為此類型的黃酮苷類化合物還有峰22，28，30，32～34，41，42，44，46以及49。

化合物通過依次丟失3-位和7-位上連接的糖基得到苷元離子，根據(jù)碎片離子的質(zhì)量差，可以判斷所連糖基的類型，結(jié)合正負離子模式的碎片特征，保留時間信息以及相關(guān)文獻數(shù)據(jù)，可對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進行解析。

峰22，母離子為m/z 983 [M-H]^-，根據(jù)元素組成分析，可能的分子式為C₄₅H₆₀O₂₄，通過與數(shù)據(jù)庫對比判斷其可能為acuminatoside。正離子模式下顯示較高豐度的m/z 693 [M+H-2rha]⁺，印證其3-位上連有的2個鼠李糖基，負離子模式下的碎片離子m/z 675 [M-H-glu-rha]^-，m/z 367 [M-H-2glu-2rha]^-則進一步確證了該成分。類似地，峰44鑒定為sagittatoside B。峰32，母離子為m/z 851 [M-H]^-，可能的分子式為C₃₉H₄₈O₂₁，碎片離子m/z 513可能是由母離子丟失1個葡萄糖基（162）和1個葡萄糖醛酸（176）而產(chǎn)生，m/z 513繼續(xù)丟失1個鼠李糖基（146）得到苷元離子m/z 367；正離子模式下碎片離子m/z 531可能是由母離子m/z 853 [M+H]⁺丟失1個葡萄糖醛酸（176）和1個鼠李糖基（146）而得到，結(jié)合正負離子模式的碎片離子信息，推測峰32的可能結(jié)構(gòu)為anhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl-glucuronic acid-7-O-glucopyranoside。類似地，峰49結(jié)構(gòu)式推測為anhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl-furan acid。其中存在不少同分異構(gòu)體，在此只能通過其保留時間的差異結(jié)合文獻數(shù)據(jù)進行區(qū)分，如峰41和42，分子離子峰m/z 675 [M-H]^-，同為淫羊藿苷的同分異構(gòu)體，且具有相同的特征碎片m/z 367，352，323，根據(jù)色譜峰出峰順序[13]，初步鑒定為baohuoside Ⅶ和sagittatoside A；峰28和33，同為朝藿定C的同分異異構(gòu)體，分別鑒定為baohuoside Ⅵ和hexandraside D[7，14]；峰30和34為一對同分異構(gòu)體，通過與相關(guān)文獻數(shù)據(jù)[7]比對，分別鑒定為anhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl（1-4）-furan acid-7-O-glucopyranoside和anhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl（1-2）-furan acid-7-O-glucopyranoside；峰46與鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ表現(xiàn)出了幾乎相同的裂解行為，判斷其為鼠李糖基淫羊藿次苷Ⅱ的一個同分異構(gòu)體。

3.2.2 以demethylanhydroicaritin為苷元的黃酮苷類 峰13～17，23，36，37，39和40具有相同的特征碎片離子m/z 353或352，歸為以demethylanhydroicaritin為苷元的黃酮苷類化合物。demethylanhydroicaritin與上述anhydroicaritin結(jié)構(gòu)相比，少了4′-位的甲基，但質(zhì)譜裂解規(guī)律相似。峰13，14，15，16，17，39和40通過與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫比對，MS/MS解析驗證，分別鑒定為hexandraside E，rouhuoside，epimedoside E，diphylloside B，epimedoside A，demethylanhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl-xylopyranoside和ikarisoside A。峰23為m/z 835 [M-H]^-，特征碎片離子有m/z 673 [M-H-glu]^-，m/z 515 [M-H-xyl-rha（Ac）]^-和m/z 353 [M-H-glu-xyl-rha（Ac）]^-，正離子模式中觀察到較高豐度的m/z 705 [M-H-xyl]^-碎片離子，說明乙?；氖鞘罄钐腔?，故推測該化合物的結(jié)構(gòu)為demethylanhydroicaritin-7-O-glucopyranosyl-3-O-acetylated rhamnopyranosyl-xylopyranoside。峰36和37準(zhǔn)分子離子均為m/z 661 [M-H]^-，且色譜出峰時間相近，MS/MS解析判斷可能為ikarisoside B及其同分異構(gòu)體。

3.2.3 以3′-hydroxyicariine為苷元的黃酮苷類 3′-hydroxyicariine是淫羊藿黃酮的第3種主要苷元類型，在淫羊藿總黃酮膠囊中鑒定出了4種此類型的黃酮苷類化合物。峰19準(zhǔn)分子離子m/z 691 [M-H]^-，可能的分子式為C33H40O₁₆，碎片離子有m/z 545 [M-H-rha]^-，m/z 529 [M-H-glu]^-，m/z 425 [M-H-rha-C₄H₈O₄]^-和m/z 383 [M-H-rha-glu]^-。正離子模式下，m/z 547 [M+H-rha]⁺碎片離子在一級質(zhì)譜中就有較高豐度，說明鼠李糖基可能是連接在3-位的。因此峰19的結(jié)構(gòu)推測為3′-hydroxyicariine-3-O-rhamnopyranosyl-7-O-glucopyranoside （sagittasine C）。峰18的準(zhǔn)分子離子為m/z 837 [M-H]^-，可能的分子式為C₃₉H₅₀O₂₀，其MS/MS裂解行為與峰19相近，比峰19多了1個鼠李糖基，故推測其結(jié)構(gòu)為3′-hydroxyicariine-3-di-O-rhamnopyranosyl-7-O-glucopyranoside。峰35和38的碎片裂解行為也比較相似，相差了1個鼠李糖基，分別鑒定為3′-hydroxyicariine-3-di-O-rhamnopyranoside和3′-hydroxyicariine-3-O-rhamnopyranoside。

3.2.4 其他黃酮苷類 峰12為m/z 677 [M-H]^-，可能的分子式為C₃₂H₃₈O₁₆，MS/MS分析中產(chǎn)生了m/z 530 [M-H-rha]^-，m/z 515 [M-H-glu]^-，m/z 411 [M-H-rha-C₄H₈O₄]^-以及m/z 369 [M-H-rha-glu]^-等碎片離子；正離子模式下，對應(yīng)地產(chǎn)生了m/z 533 [M+H-rha]⁺，m/z 371 [M+H-rha-glu]⁺等碎片離子，判斷其苷元離子為m/z 369 [M-H-rha-glu]^-，比anhydroicaritin多了2個質(zhì)量數(shù)，推測其可能的結(jié)構(gòu)為dihydroanhydroicaritin-3-O-rhamnopyranosyl-7-O-glucopyranoside。峰31準(zhǔn)分子離子為m/z 531 [M-H]^-，產(chǎn)生了碎片離子m/z 384 [M-H-rha]^-，m/z 367 [M-H-rha-H₂O]^-，和m/z 311 [M-H-rha-H₂O-C₄H₈]^-，推測其結(jié)構(gòu)為icaritin-3-O-rhamnopyranoside。

除了具異戊烯基取代的黃酮苷類，淫羊藿總黃酮膠囊中還鑒定出了7個一般黃酮苷類化合物，分別是山柰酚-3-O-鼠李糖-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷或其同分異構(gòu)體（峰4和7），山柰酚-3-O-二鼠李糖苷（峰9），槲皮素-3，7-O-二鼠李糖苷（峰5），金絲桃苷（峰8）和槲皮素-3-O-鼠李糖苷（峰11）。峰20準(zhǔn)分子離子為m/z 465 [M-H]^-，脫去1個鼠李糖基和1分子水后產(chǎn)生m/z 285特征碎片離子；在正離子模式下，母離子為m/z 484 [M+NH₄]⁺，對應(yīng)生成特征碎片m/z 287 [M+H-glu-H₂O]⁺，推測其結(jié)構(gòu)為二氫槲皮素-7-O-葡萄糖苷或其同分異構(gòu)體。

3.2.5 酚酸類和生物堿類化合物 通過與文獻數(shù)據(jù)進行對比，鑒定出了3個酚酸類和1個生物堿類化合物。峰1和3顯示了相同的碎片離子m/z 191，173，對應(yīng)為奎尼酸[quinic acid-H]^-，[quinic acid-H-H₂O]^-的特征碎片，結(jié)合文獻[6]，分別鑒定為綠原酸和5-p-coumaroylquinic acid。峰6準(zhǔn)分子離子m/z 163 [M-H]^-，分子式為C₉H₈O₃，丟失CO₂片段顯示碎片離子m/z 119，推測其結(jié)構(gòu)為對羥基肉桂酸。峰2在正離子模式下的響應(yīng)較負離子模式要好，分子式為C₂₀H₂₃NO₄，結(jié)合文獻[15]數(shù)據(jù)，鑒定為木蘭堿。

4 討論

本實驗采用UPLC/Q-TOF-MS/MS技術(shù)，利用UPLC的高效分離能力和Q-TOF的高分辨率以及其在結(jié)構(gòu)解析上提供的豐富信息，系統(tǒng)、全面地分析了淫羊藿總黃酮膠囊中存在的化學(xué)成分。根據(jù)精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu)和保留時間等信息，結(jié)合對照品的裂解規(guī)律和參考相關(guān)文獻，成功地鑒定或推測了淫羊藿總黃酮膠囊中46個化合物，其中42個化合物為黃酮苷類（35個為具異戊烯基取代的黃酮苷），3個化合物為酚酸類還有1個生物堿類。具異戊烯基取代的黃酮苷類化合物裂解機制呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性，負離子模式下較易丟失7-位上的糖基而正離子模式下更傾向于脫去3-位上的糖基，苷元離子的繼續(xù)裂解主要以脫去4′-位的CH₃，4-位的CO以及8-位異戊烯基的裂解為主。基于總結(jié)的裂解規(guī)律，對4個新化合物（峰12，23，32，49）可能的結(jié)構(gòu)式進行了推測。此外，淫羊藿總黃酮膠囊中尚存在一些響應(yīng)較好的色譜峰為未知成分，有待進一步的研究。本實驗建立的方法，準(zhǔn)確、快速、靈敏，為淫羊藿總黃酮膠囊的質(zhì)量控制提供了新的方法和途徑，實驗結(jié)果為進一步闡明其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機制等提供參考。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]