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    肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡、IL-6的影響

    2017-04-17 13:13:26董菲菲潘宇政彭玲玲鄧淑蓉
    現(xiàn)代養(yǎng)生·下半月 2017年2期
    關(guān)鍵詞:腦細(xì)胞肉桂時(shí)間段

    董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

    廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

    肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡、IL-6的影響

    董菲菲 潘宇政 彭玲玲 鄧淑蓉 張 慧

    廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 廣西壯族自治區(qū)南寧市 530021

    目的:通過觀察肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷大鼠腦細(xì)胞凋亡、血清白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6的影響,探討肉桂對(duì)重型顱腦損傷腦組織的保護(hù)作用。方法:54只SD大鼠隨機(jī)分為三組,根據(jù)Feeney′s自由落體打擊造模法復(fù)制動(dòng)物模型。于傷后6h灌胃。灌胃后24h、72h、168h分別通過TUNEL法、ELISA法檢測腦細(xì)胞凋亡、血清IL-6的含量。結(jié)果:(1)重型顱腦損傷大鼠受傷后血清IL-6明顯升高,持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后,在72h明顯加重血清IL-6的升高,而在168h可以抑制血清IL-6的升高。(2)重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡,這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后,在72h明顯加重這種凋亡,而在168h可以改善腦細(xì)胞凋亡。其作用與IL-6的含量相關(guān)。結(jié)論:肉桂水提取物對(duì)重型顱腦損傷早期用藥會(huì)加劇炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡,三天后用藥則呈現(xiàn)明顯的保護(hù)作用。

    肉桂;重型顱腦損傷;腦細(xì)胞凋亡;IL-6

    中藥肉桂系樟科植物肉桂的干燥樹皮,性辛、甘、大熱,歸腎、肝、心、脾經(jīng),具有補(bǔ)火助陽,散寒止痛,溫通經(jīng)脈等功能;主要用于陽虛、寒凝瘀滯等病癥的治療[1]。當(dāng)代有人發(fā)現(xiàn),肉桂水提液對(duì)非創(chuàng)傷性缺血性腦損傷具有一定的保護(hù)作用[2],可以通過提高神經(jīng)因子的表達(dá),從而促進(jìn)慢性腦缺血后腦組織損傷修復(fù)過程[3]。然而這些研究主要是觀察肉桂對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用,對(duì)創(chuàng)傷性顱腦損傷的保護(hù)作用還未見研究報(bào)道。為此,本實(shí)驗(yàn)通過炎癥反應(yīng)介質(zhì)IL-6和細(xì)胞凋亡等指標(biāo),觀察肉桂對(duì)重型顱腦損傷腦組織修復(fù)的保護(hù)作用。

    1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

    1.1 主要藥品、試劑及儀器

    肉桂(產(chǎn)于廣西)購于廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房;TUNEL試劑盒購自于Roche公司; ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司,編號(hào)∶ERC003。改良的Feeney’s 自由落體打擊裝置;Multiskan FC酶標(biāo)儀(塞默飛世爾儀器有限公司生產(chǎn));高速冷凍離心機(jī)(英國生產(chǎn),型號(hào):英泰TDL5M);正置熒光相差顯微成像鏡(型號(hào):BΧ53+DP73+cellsens)

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、動(dòng)物分組及給藥

    SPF級(jí)雄性SD大鼠56只,體質(zhì)量(230±20)g,購自于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)∶SCΧK(桂)2014-0002。SD大鼠隨機(jī)分成A組(正常對(duì)照組)﹑B組(模型組)﹑C組(肉桂水提取物組)三組,每組各18只。給藥組在造模后6h予肉桂水提取物灌胃,劑量用成人每日常用量5g,換算成大鼠劑量,計(jì)算方法依據(jù)徐淑云藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)公式計(jì)算【劑量=(成人的用量×換算系數(shù)0.018×3.16倍)/2】,正常對(duì)照組與模型組分別在傷后6h以等量生理鹽水灌胃,各組灌胃均每日1次,連續(xù)7天。

    1.3 重型顱腦損傷模型制備

    根據(jù)文獻(xiàn)[4]建立模型。于造模6h后,參照有相關(guān)文獻(xiàn)[5]對(duì)每只動(dòng)物行神經(jīng)功能缺損評(píng)分,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6],采用10 分制、單盲法進(jìn)行評(píng)分;>2 分則說明造模成功,<2 分則剔除。

    1.4 標(biāo)本采集及檢測

    1.4.1 標(biāo)本采集

    各組分別在造模后第24、72、168h三個(gè)時(shí)間段取材,每組每個(gè)時(shí)間段隨機(jī)取6只大鼠。(1)以心臟采血法采血3mL,4℃,2200 r/min離心15min,取上清液,置-80℃冰箱待測IL-6。(2)經(jīng)升主動(dòng)脈灌注250mL的0.9%氯化鈉注射液,直至從右心房流出的液體變清亮為止,再灌注4%多聚甲醛液250mL,斷頭取腦,并迅速浸入4%多聚甲醛液中,固定24h后修成4mm塊,常規(guī)酒精脫水、石蠟包埋待測腦細(xì)胞凋亡。

    1.4.2 腦細(xì)胞凋亡檢測

    以TUNEL原位法檢測損傷區(qū)凋亡細(xì)胞,嚴(yán)格按試劑盒說明步驟進(jìn)行檢測。每組6只大鼠分別選同一冠狀層的切片在高倍鏡下觀察,細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色的為陽性細(xì)胞,8 個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)TUNEL陽性標(biāo)記細(xì)胞,計(jì)算凋亡陽性細(xì)胞百分比,陽性率=陽性細(xì)胞數(shù)/(陽性細(xì)胞數(shù)+ 陰性細(xì)胞數(shù))×100%。

    1.4.3 血清IL-6檢測

    采用ELISA法檢測,嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行檢測。最后使用酶標(biāo)儀450nm波長按順序測量各孔的濃度值。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    表1:各組血清IL-6含量(±s,pg/ml)

    表1:各組血清IL-6含量(±s,pg/ml)

    與A組比較,#P<0.05;與同時(shí)間段B組比較,*P<0.05;與同組168h比較,△P<0.05

    組別N24h72h168h A組1851.03 ±23.7651.02 ±24.3650.03 ±13.76 B組18142.23±52.32#126.53±34.74#102.82±34.50# C組18141.67±6.99#△275.80± 98.67#*△60.09±17.65*

    表2:各組腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率(±s,%)

    表2:各組腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率(±s,%)

    與A組比較,#P<0.05;與同時(shí)間段B組比較,*P<0.05;與同組168h比較,△P<0.05

    組別N24h72h168h A組189.44 ± 2.8610.05± 3.1210.25± 2.90 B組1874.75±10.13#68.55±11.46#68.23± 5.46# C組1872.84±6.90#△81.14± 6.86#*△39.74± 12.26#*

    2.1 血清IL-6含量

    結(jié)果見表1。B、C組與A組比較,血清IL-6含量明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組在72h與B組比較,C組IL-6含量明顯高于B組。C組在168h與B組比較,C組IL-6含量明顯低于B組。C組在168h時(shí)間段與24h、72h兩個(gè)時(shí)間段比較有差異。B組各時(shí)間段比較,無明顯差異(P>0.05)。這些結(jié)果提示,重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6明顯升高,一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后,在24h無變化,在72h血清IL-6水平明顯升高,而在168h血清IL-6水平明顯下降,接近正常組水平。

    2.2 腦組織TUNEL細(xì)胞凋亡率

    結(jié)果見表2。B、C組與A組比較,腦細(xì)胞凋亡率明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C組在72h與B組比較,C組明顯高于B組。C組在168h與B組比較,C組明顯低于B組。C組在168h時(shí)間段與24h、72h兩個(gè)時(shí)間段比較有差異。B組各時(shí)間段比較,無明顯差異(P>0.05)。這些結(jié)果提示,重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡,這種凋亡一直持續(xù)至168h。用肉桂水提取物干預(yù)后,在24h凋亡無變化,在72h凋亡加重,而在168h腦細(xì)胞凋亡則比模型組明顯下降。

    2.3 血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡的關(guān)系

    結(jié)果見圖1。C 組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率相關(guān)關(guān)系Pearson 的系數(shù)r = 0.816,P = 0.000(雙側(cè))。其他各組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率無相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示C組血清IL-6水平與腦細(xì)胞凋亡率有正相關(guān)關(guān)系。

    3 討論

    重型顱腦損傷早期都存在繼發(fā)炎癥反應(yīng),這一炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腦損傷的主要機(jī)制之一[7,8]。IL-6 在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色,Marklund等人[9]認(rèn)為IL-6在損傷發(fā)生后即刻就上升,而且損傷程度越嚴(yán)重,血中IL-6的含量就越高,IL-6含量與腦損傷程度呈正比。本研究發(fā)現(xiàn),重型顱腦損傷大鼠受傷后外周血血清IL-6即明顯升高,這一現(xiàn)象一直持續(xù)至第168h。結(jié)果與Marklund等人的研究結(jié)果基本一致。說明顱腦損傷后一周內(nèi)一直存在明顯的炎癥反應(yīng)。用肉桂水提取物干預(yù)后,在72hIL-6水平比模型組明顯升高,而在168h IL-6水平則明顯降低,接近正常水平。這說明顱腦損傷早期(72h內(nèi))用藥,肉桂會(huì)加劇顱腦損傷的炎癥反應(yīng),從而加重腦組織損傷。而72h后用藥則能夠抑制顱腦損傷的炎癥反應(yīng),呈現(xiàn)保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

    研究表明,顱腦損傷導(dǎo)致的腦細(xì)胞損害除了直接損傷引起的腦細(xì)胞死亡外,還存在繼發(fā)的細(xì)胞凋亡[10-12]。張劍濤[13]等人報(bào)道顱腦損傷傷灶周圍額皮質(zhì)在4h后即開始出現(xiàn)腦細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,以后凋亡細(xì)胞逐漸增加,至3d達(dá)高峰,之后有所下降。腦細(xì)胞凋亡的原因很多,但顱腦損傷繼發(fā)的炎癥反應(yīng)可能是重要原因之一。實(shí)驗(yàn)中觀察到,重型顱腦損傷大鼠在受傷后存在明顯的腦細(xì)胞凋亡,一直持續(xù)到168h。用肉桂干預(yù)后,腦細(xì)胞凋亡在早期明顯加劇,而在72h后明顯減少細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡的趨勢與炎癥反應(yīng)重要指標(biāo)IL-6水平的變化趨勢基本一致。這表明顱腦損傷早期用藥,肉桂會(huì)加劇炎癥反應(yīng),以致加重腦細(xì)胞的凋亡,而72h后用藥則可以抑制炎癥反應(yīng),從而減輕腦細(xì)胞凋亡,起到保護(hù)腦細(xì)胞的作用。

    肉桂對(duì)顱腦損傷炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的影響機(jī)制還不是很清楚??赡芘c肉桂通過抑制炎癥因子降低腦水腫有關(guān)。細(xì)胞因子炎癥反應(yīng)可加重腦水腫、腦組織缺氧使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)一步遭受損害[14]。有人發(fā)現(xiàn)肉桂水提物通過減輕缺血區(qū)腦組織水腫而明顯降低腦含水量,而對(duì)缺血性腦損傷具有一定的保護(hù)作用[2]。楊小鋒[15]等人提出,腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)與顱內(nèi)壓、腦組織含水量在不同時(shí)期呈正相關(guān), 在總體的變化過程中也有正相關(guān)性。

    圖1

    (通訊作者:潘宇政)

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    國家自然科學(xué)基金(NSFC.81460687),廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)(GZLC14-29)。

    董菲菲(1990-),女,碩士研究生。

    潘宇政(1961-),男,碩士生導(dǎo)師。

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