組蛋白修飾的結腸癌臨床預后價值與年齡的相關性研究

賈業(yè)貴，王國樑

組蛋白修飾的結腸癌臨床預后價值與年齡的相關性研究

賈業(yè)貴1，王國樑2

（1.江漢大學附屬醫(yī)院 消化內科，湖北 武漢 430015；2.江漢大學醫(yī)學院，湖北 武漢 430056）

目的 評價組蛋白修飾在TNMⅠ～Ⅲ期結腸癌患者腫瘤細胞中的表達及其預后價值，并進一步探討組蛋白修飾表達預后價值與年齡的相關性。方法 采用免疫組織化學方法檢測254例TNMⅠ～Ⅲ期CRC患者組織芯片中組蛋白修飾表達情況。根據(jù)生存狀態(tài)對患者進行分組，比較各組間組蛋白修飾形態(tài)H3K9ac和H3K27me3表達差異及其與年齡的相關性。結果 隨著年齡增長，組蛋白修飾在隨訪期間存活患者中表達降低，而隨著年齡增長，組蛋白修飾在隨訪期間復發(fā)或死亡患者中表達增加。組蛋白修飾在兩組間的表達差異表明組蛋白修飾在結腸癌中的預后價值與年齡相關。組蛋白修飾細胞核高表達在年齡更低組中提示較好的臨床結局，而在年齡更高組中提示更差的臨床結局。結論 組蛋白修飾物H3K9ac和H3K27me3在細胞核中單獨或聯(lián)合高表達對結腸癌患者具有預后價值。隨著年齡增加表觀遺傳標志物的預后影響不但發(fā)生變化，甚至發(fā)生逆轉。年青和年老結腸癌患者的生物學存在差異，年齡對結腸癌具有重要影響。

結腸癌；預后價值；組蛋白修飾；年齡

年齡老化通常伴有基因轉錄特征改變和基因組不穩(wěn)定，是包括腫瘤在內的眾多人類疾病的主要危險因素?；蚝捅碛^遺傳學機制調控細胞功能是十分復雜而又精確的過程[1-3]。表觀遺傳學類型在年齡老化過程中發(fā)生改變，該現(xiàn)象被稱之為“表觀遺傳學漂移”，例如，隨著年齡增長，DNA主動去甲基化反應（global deme-thylation）明顯降低[4-5]。年齡相關DNA去甲基化也與組蛋白修飾類型變化有關[6]。例如，組蛋白H3賴氨酸第9位點乙?；╝cetylation of histone 3 lysine 9，H3K9ac）和組蛋白H3賴氨酸第27位點三甲基化（trimethylation of histone 3 lysine 27，H3K27me3）等組蛋白修飾隨著年齡增長，在正常細胞內整體表達下降。組蛋白修飾調控染色質結構，從而可調節(jié)轉錄、復制及DNA修復活性等。在正常細胞基因表達過程中，H3K9ac和H3K27me3分別呈陽性和陰性表達。通常組蛋白修飾類型H3K9ac發(fā)生在轉錄更為活躍的基因中。相反，H3K27me3修飾特異性與端粒近端區(qū)域和部分沉默基因相關。但是目前也有研究證實在端粒近端區(qū)域存在H3K9ac。多項研究證實，隨著患者年齡增加，腫瘤細胞全基因組內CpG島甲基化快速增加，而非CpG島甲基化迅速降低。正常組織中70%～90%的CpG位點表達與年齡有關，而在數(shù)種腫瘤中，這些CpG位點表達明顯增加。還有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠中早期抑制DNA甲基化能夠預防腫瘤形成，該研究結果提示老化過程加速或失控能夠導致腫瘤形成。

本文主要探討手術時腫瘤患者年齡和原發(fā)腫瘤中表觀遺傳學類型表達失控的相關性及預后價值。本實驗采用免疫組織化學方法檢測H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細胞核中的表達情況，并分析其表達的臨床和預后意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

254例在江漢大學附屬醫(yī)院住院治療的TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期的結腸癌患者納入本次研究。收集患者手術時年齡、性別、TNM分期、腫瘤部位、腫瘤直徑、微衛(wèi)星狀態(tài)、腫瘤史、輔助治療和復發(fā)等信息，隨訪截止至2014年12月。

1.2 H3K9ac和H3K27me3檢測

患者腫瘤組織芯片由美國生物公司biomax制作。采用免疫組織化學法在組織芯片上檢測H3K9ac（ab61231，美國Abcam公司），H3K27me3（ab6002，美國Abcam公司）表達。采用德國徠卡公司semiautomated Ariolsystem分析H3K9ac和H3K27me3在細胞核中陽性染色情況。每例患者隨機選擇組織芯片中3個點的平均陽性率用于生存分析。根據(jù)患者生存狀態(tài)分層后，包括年齡交互作用在內的線性回歸方法分析手術時年齡和組蛋白修飾的相關性。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，Kaplan-Meier法預測生存率，采用Cox比例風險模型分析H3K9ac或H3K27me3核表達在結腸癌患者中的預后價值。單因素和多因素分析單個標志物對患者結局的影響。所有統(tǒng)計均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 組蛋白標志物表達與年齡的相關性

H3K9ac和H3K27me3表達與標準臨床病理參數(shù)均無相關性，提示腫瘤細胞中H3K9ac和H3K27 me3核表達與年齡無相關性（見表1）。但是根據(jù)患者的生存狀態(tài)分層后，腫瘤細胞中H3K9ac和H3K27 me3等組蛋白修飾表達類型與年齡存在相關性（見圖1A）。在隨訪期結束后仍存活的患者中（生存組），H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長，表達降低，而在隨訪期結束后死亡或復發(fā)的患者中（死亡或復發(fā)組），H3K9ac和H3K27me3隨著年齡增長，表達升高。將生存組不同年齡階段患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達量減去死亡或復發(fā)組患者H3K9ac和H3K27me3的平均表達量，評價兩組患者H3K9ac和H3K27me3平均表達量的差異，結果發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，兩組間差異下降（圖1B和見表2）。H3K9ac和H3K27me3在結腸癌中的表達見圖1C。

2.2 H3K9ac或H3K27me3表達的預后價值

采用 Cox比例風險模型分析 H3K9ac或H3K27me3核表達在結腸癌患者中的預后價值，結果發(fā)現(xiàn)生存組和死亡或復發(fā)組間 H3K9ac或H3K27me3核表達水平和手術時年齡存在相關性。當未考慮年齡交互作用時，單因素方差分析和多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3核表達無預后價值。而將H3K9ac或H3K27me3核表達作為連續(xù)變量進行單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，H3K9ac或H3K27me3核表達對結腸癌患者臨床結局具有顯著年齡依賴的預后價值（見表3）。單因素方差分析

和多因素分析H3K9ac表達及H3K9ac表達與手術時年齡的交互作用表明，H3K9ac表達與疾病特異性生存率（disease-specific survival，DSS）、無局部復發(fā)生存率（recurrence-free survival，LRRFS）和無遠處復發(fā)生存率（distantrecurrence-free survival，DRFS）密切相關，而H3K27me3表達與年齡的交互作用與LRRFS和DRFS有關。此外，交互作用分析還表明H3K9ac或H3K27me3核表達與臨床結局關系隨年齡增長而發(fā)生改變（見圖2A）。在年齡＜65歲的患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較好相關，低于平均水平則與患者預后較差有關。相反，在年齡≥65歲的患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較差相關，低于平均水平則與患者預后較好有關。總之，多因素生存分析表明H3K9ac或H3K27me3的核表達是年齡依賴的結腸癌患者臨床結局的預后因素。

表1 單個標志物狀態(tài)與臨床參數(shù)相關性分析 例（%）

圖1 與死亡或復發(fā)相關的組蛋白修飾在手術時不同年齡組結腸癌患者中的表達差異

表2 相同年齡組生存患者與死亡或復發(fā)患者組蛋白修飾表達的差值比較 （%，x±s）

表3 單因素和多因素分析單個標志物對患者結局的影響

2.3 H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達對臨床結局的影響

H3K9ac和H3K27me3在腫瘤細胞中的陽性表達水平分別為93.2%和92.9%。根據(jù)H3K9ac和H3K27me3的表達水平將患者分為3組：組1：H3K9ac和H3K27me3的表達水平均低于平均水平；組2：H3K9ac或H3K27me3的表達水平均高于平均水平；組3：H3K9ac和H3K27me3的表達水平均高于平均水平。H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達除了與微衛(wèi)星穩(wěn)定狀態(tài)相關外，與其他標準臨床參數(shù)都不相關，隨著高于平均表達水平的組蛋白修飾數(shù)量增加，微衛(wèi)星穩(wěn)定腫瘤的數(shù)量也增加（見表4）。同樣，多元生存分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達及其與手術時年齡的交互作用表明，H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達與總生存期（overall survival，OS）、DSS、LRRFS和DRFS相關。此外，交互統(tǒng)計分析還發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達與臨床結局的相關性也發(fā)生改變。在年齡＜65歲的患者中，高于平均表達水平的組蛋白修飾類型越多與患者臨床結局較好相關。相反，在年齡≥65歲的患者中，高于平均表達水平的組蛋白修飾類型越少與患者臨床結局較好相關（見圖2B）。

表4 單因素和多因素分析H3K9ac和H3K27me3聯(lián)合表達對患者結局的影響

圖2 H3K9ac單獨（A）或聯(lián)合H3K27me3（B）表達對結腸癌患者結局的影響

3 討論

本文實驗結果表明，組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3單獨或聯(lián)合表達是結腸癌患者年齡依賴的預后因素。就筆者所能查閱到的文獻，本研究是國內首次探討表觀遺傳學生物標志物在結腸癌中預后機制與年齡的相關性。免疫組織化學結果顯示，年齡＜65歲患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較好相關，低于平均水平則與患者預后較差有關。相反，年齡≥65歲患者中，H3K9ac或H3K27me3核表達高于平均水平與患者預后較差相關，低于平均水平則與患者預后較好有關。以往也有研究發(fā)現(xiàn)，某些條件或基因、蛋白表達水平對臨床結局有利或不利的影響與患者年齡相關。例如，RAMSEY等[7]識別自閉癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）患者中存在12種血清蛋白具有年齡依賴的生物標志物特征。通過分析ASD患者和其健康同胞中該血清蛋白與年齡的關系，發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長，該蛋白的表達發(fā)生相反的改變，提示該蛋白以年齡依賴方式影響ASD患者。同樣，表觀遺傳學調控對不同年齡段患者的影響也有差異。由于H3K9ac和H3K27me3對基因表達的影響不同，激活組蛋白修飾H3K9ac和沉默組蛋白修飾H3K27me3對結腸癌患者臨床結局應該有相反的作用。然而，蛋白編碼基因僅占基因組很小一部分，本研究發(fā)現(xiàn)H3K9ac和H3K27me3在腫瘤基因組中的表達對臨床結局有相同影響，且都具有年齡依賴性。除了在基因組中整體表達水平，也有研究分析組蛋白修飾在單個基因中的表達情況[8]。由于以往研究主要關注正常細胞基因組中DNA甲基化和特異性組蛋白修飾與年齡相關的整體變化情況，本研究主要分析腫瘤細胞基因組中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3的中表達情況。

研究已經(jīng)證實，正常組織中所有組蛋白修飾全局表達水平隨著年齡增長逐漸下降[9]。本組生存患者中組蛋白修飾H3K9ac和H3K27me3隨年齡增長而表達下降，其可能原因與端粒長度縮短過程有關。正常細胞中端粒隨著年齡增長而不斷縮短，最終導致細胞衰老[10]。端粒長度縮短有助于年齡相關組蛋白總量下降，而年齡相關組蛋白總量下降是人類基因組穩(wěn)定的重要條件，因此隨著年齡增長，正常細胞內修飾組蛋白總量也隨之下降。

本研究隨訪期間死亡或復發(fā)患者中H3K9ac和H3K27me3組蛋白修飾在結腸癌細胞核中表達隨年齡增長而增加，該結果提示表觀遺傳學能夠調控腫瘤細胞復制性永生化。復制性永生化是由端粒延長引起的一種腫瘤特異性生長現(xiàn)象，端粒長度可以通過持續(xù)表達人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase re-verse transcriptase，hTERT）維持，hTERT是端粒酶的催化亞基[11-12]。H3K乙?；潭仍黾雍?，由于缺少募集至hTERT近端啟動子的組蛋白去乙酰化酶2（histone deacetylase 2，HDAC2），導致hTERT表達增加和端粒酶激活，由此促進腫瘤細胞生存。以往研究表明正常細胞過程中由于染色質致密化喪失，引起H3K27me3表達隨年齡增長而下降，由此最終導致基因整體表達水平增加[13]。維持H3K27高水平三甲基化對細胞壽命十分重要[14-15]。本研究死亡或復發(fā)結腸癌患者中H3K27me3表達隨年齡增長而增加，H3K27me3表達增加與腫瘤細胞壽命延長和生存率提高有關，與該發(fā)現(xiàn)一致的是，該患者中H3K9ac表達也增加，而H3K9ac表達增加能夠激活端粒酶。正常細胞內H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而下降，而在腫瘤中當H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而增長時，提示患者死亡復發(fā)風險更高，臨床結局更差。因此，當腫瘤細胞內H3K9ac和H3K27me3表達隨年齡增長而增長與腫瘤細胞壽命更長和生存率更高相關，也與腫瘤侵襲性高相關，由該患者臨床結局更差?？傊?，H3K9ac和H3K27me3表達都與細胞生存和壽命有關，且兩種標志物具有協(xié)同作用，聯(lián)合檢測H3K9ac和H3K27me3表達在結腸癌患者預后中的價值更顯著。

[1]KLIRONOMOS F D,BERG J,COLLINS S.How epigenetic mutations can affect genetic evolution:model and mechanism[J]. Bioessays,2013,35(6):571-578.

[2]YOU J S,JONES P A.Cancer genetics and epigenetics:two sides of the same coin[J].Cancer Cell,2012,22(1):9-20.

[3]劇宏燕,柴秀坤,白文元.結直腸癌的表觀遺傳學[J].世界華人消化雜志,2014,22(15):2128-2133.

[4]JOHNSON A A,AKMAN K,CALIMPORT S R G,et al.The role of DNA methylation in aging,rejuvenation,and age-related disease[J].Rejuvenation Research,2012,15(5):483-494.

[5]BERGMAN Y,CEDAR H.DNA methylation dynamics in health and disease[J].Nature Structural&Molecular Biology,2013,20(3): 274-281.

[6]XU Z,TAYLOR J A.Genome-wide age-related DNA methylation changes in blood and other tissues relate to histone modification, expression and cancer[J].Carcinogenesis,2014,35(2):356-364.

[7]RAMSEY J M,GUEST P C,BROEK J A C,et al.Identification of an age-dependent biomarker signature in children and adolescents with autism spectrum disorders[J].Molecular Autism,2013, 4(1):1.

[8]DE KRUIJF EM,BASTIAANNET E,RUBERTA F,et al.Comparison of frequencies and prognostic effect of molecular subtypes between young and elderly breast cancer patients[J].Mol Oncol 2014,8(2):1014-1025.

[9]HALLAN S I,MATSUSHITA K,SANG Y,et al.Age and association of kidney measures with mortality and end-stage renal disease[J].JAMA,2012,308(9):2349-2360.

[10]GAUDET M M,PRESS M F,HAILE R W,et al.Risk factors by molecularsubtypesofbreastcanceracrossa population-based study of women 56 years or younger[J].Breast Cancer Res Treat,2011,130(21):587-597.

[11]ZHANG Y,LI Q,CHEN H.DNA methylation and histone modifications of Wnt genes by genistein during colon cancer development[J].Carcinogenesis 2013,34(29):1756-1763.

[12]LIQ,CHEN H.SilencingofWnt5aduringcolon cancer metastasis involves histone modifications[J].Epigenetics,2012,7: 551-558.

[13]ENROTH S,RADA-IGLESISAS A,ANDERSSON R,et al. Cancer associated epigenetic transitions identified by genomewide histone methylation binding profiles in human colorectal cancer samples and paired normal mucosa[J].BMC Cancer, 2011,11(13):450-452.

[14]O’SULLIVAN R J,KUBICEK S,SCHREIBER S L,et al Reduced histone biosynthesis and chromatin changes arising from a damage signal at telomeres[J].Nat Struct Mol Biol,2010,17(9): 1218-1225.

[15]HANAHAN D,WEINBERG R A.The hallmarks of cancer[J]. Cell,2000,100(286):57-70.

（張蕾 編輯）

Age-dependent clinical prognostic value of histone modifications in colorectal cancer

Ye-gui Jia1,Guo-liang Wang2
(1.Department of Gastroenterology,the Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430015,China;2.Medical College of Jianghan University,Wuhan,Hubei 430056,China)

Objective To assess the expression of histone modifications in tumor cells of the patients with TNM stage I-III colorectal cancer (CRC)and its clinical outcome and association with age at surgery.Methods To quantify expression,immunohistochemical staining of the histone modifications was performed on a tissue microarray containing colorectal tissues of the 254 patients with TNM stage I-III CRC.The patients were stratified according to survival status and age-related tumor expression patterns of both H3K9ac and H3K27me3 were compared.Results Decreased expression with advancing age was observed in the patients who were alive after follow-up(no-event group),whereas increased expression with advancing age was observed in the patients who presented with a recurrence or death during follow-up(event group).These opposite expression patterns translated into age-dependent prognostic value of the individual histone modifications and their combination in CRC.The prognostic value reversed with increasing age,high nuclear expression associated with good clinical outcome in the young adults,in contrast, with poor clinical outcome in the elderly patients.Conclusions We identified an age-dependent prognostic effect of nuclear expressions of histone modifications H3K9ac and H3K27me3 and their combination in patients with CRC. We have demonstrated for the first time the prognostic impact of an epigenetic marker can not only change but also reverse with increasing age.This observation supports the hypothesis that CRC biology is distinct between young adults and the elderly and emphasizes the importance of focusing on age-related effects in CRC.

colorectal cancer;prognostic value;istone modifications;age

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.007

1005-8982（2017）04-0033-07

2016-05-31