中等強度耐力訓練后心肌損傷標記物及能量代謝通道變化的機制研究

李 欣

(成都大學 體育學院， 四川 成都 610106)

中等強度耐力訓練后心肌損傷標記物及能量代謝通道變化的機制研究

李 欣

(成都大學 體育學院， 四川 成都 610106)

探討了中等強度耐力訓練后大鼠心肌損傷標記物心肌肌鈣蛋白、腦鈉肽和能量代謝通道哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和AMP依賴的蛋白激酶信號通路變化的作用機制.利用健康雄性SD大鼠60只，隨機分為耐力運動組和對照組，建立大鼠耐力運動型心肌肥大模型.使用免疫組化結合計算機圖像處理技術，對心臟形態(tài)結構以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的分布和表達進行觀察和測定；使用real-time PCR技術，對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和AMP依賴的蛋白激酶的mRNA表達進行測定；使用ELISA檢測方法，對大鼠血清心肌肌鈣蛋白T、心肌肌鈣蛋白I、腦鈉肽的表達進行測定.8周中等強度耐力訓練后：E組大鼠心臟組織未見形態(tài)學病理性改變；E組大鼠的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白免疫反應陽性面積和光密度顯著上調(diào)(P<0.05)；E組大鼠AMP依賴的蛋白激酶的mRNA表達未見顯著改變，而哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的mRNA表達顯著上調(diào)(P<0.05)；E組大鼠心臟血漿腦鈉素、血漿肌鈣蛋白T和肌鈣蛋白I表達升高，但未見顯著變化.結果表明：8周中等強度耐力訓練導致的耐力訓練型心肌肥大未發(fā)生心功能惡化和慢性心衰；訓練后心肌肌鈣蛋白和腦鈉肽表達升高并不能直接反映心肌細胞壞死和心功能惡化，其變化應是由心臟形態(tài)結構功能重塑造成的；8周的中等強度耐力訓練未造成大鼠心肌細胞能量環(huán)境的改變；中等強度耐力訓練中，心肌哺乳動物雷帕霉素靶蛋白和AMP依賴的蛋白激酶信號通路的表達與骨骼肌存在顯著差異.

耐力訓練；心肌肌鈣蛋白；腦鈉素；mTOR/AMPK；信號通路

0 引 言

長期大強度耐力訓練后，運動員左心室腔在舒張末期增大，提示了病理性擴張型心肌病發(fā)生的可能，表明耐力運動性心肌肥大具有心血管疾病發(fā)展的風險[1].而中等強度耐力訓練是否也會對心臟結構形態(tài)和功能產(chǎn)生不良影響目前未見系統(tǒng)明確的報道.臨床上通常將血液心肌肌鈣蛋白(I/T)作為判斷心肌細胞壞死最具敏感性和特異性的指標[2]，將腦鈉肽作為判斷心肌功能和預后心衰的最具敏感性和特異性的指標[3].哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/AMP依賴的蛋白激酶(AMPK)信號通路是心肌細胞能量代謝變化的感受器，能感受運動時肌肉收縮所引起的能量變化，從而在機體對運動的適應性反應中發(fā)揮重要作用[4].因此，本研究通過8周中等強度的跑臺訓練后大鼠心臟形態(tài)結構的顯微檢測、mTOR/AMPK信號通路表達的變化以及心臟損傷標志物的表達變化，來確定中等強度耐力訓練導致的心肌肥大性質(zhì)，心臟損傷標志物在運動損傷臨床意義，心肌細胞能量代謝變化情況以及心肌mTOR/AMPK信號通路的變化情況與骨骼肌細胞是否存在不同.

1 對象與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為60只健康雄性SD大鼠，3月齡，質(zhì)量180～210 g，隨機分為耐力訓練組(E組，n=30)和對照組(C組，n=30).每組內(nèi)包括3個平行亞組，即形態(tài)學檢測亞組(C1/E1組，n=10)、實時熒光定量PCR檢測亞組(C2/E2組，n=10)和ELISA檢測亞組(C3/E3組，n=10).大鼠采用標準嚙齒類飼料(四川大學實驗動物中心提供)飼養(yǎng)，自由飲水與活動，室溫22 ℃±2 ℃，濕度45%±10%，晝夜節(jié)律人工控制光照，光照時間為12 h/d.

1.2 跑臺訓練計劃

利用自制動物跑臺建立中等強度耐力訓練動物模型.耐力訓練組大體采用Fenning的訓練計劃[5]，結合Wisloff對最大攝氧量的控制方法[6]，每周訓練6 d，持續(xù)訓練8周.整個訓練過程中，相對運動強度大約維持在60%～65%VO2max.

1.3 形態(tài)學檢測亞組取材與測量

整個訓練計劃結束后24 h，C1組和E1組大鼠苯巴比妥鈉(4 mg/100 g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，心臟灌注固定后取出心臟，電子天平稱重，計算心臟體質(zhì)量指數(shù).心臟石蠟包埋，切片，進行HE染色，觀察組織結構.對mTOR進行免疫組織化學DAB顯色反應實驗，反應結果在顯微鏡下觀察、攝片.圖像分析軟件使用Image-Pro Plus 6.0，參數(shù)值由圖像分析系統(tǒng)自動產(chǎn)生.測量參數(shù)為每個視野各測試指標陽性反應區(qū)域的平均光密度與總面積.

1.4 實時熒光定量PCR檢測

整個訓練計劃結束后24 h，C2和E2組大鼠苯巴比妥鈉(4 mg/100 g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，迅速取出完整心臟，置于液氮中備用.取心臟組織塊50～100 g用液氮在研缽中加Trizol研磨成粉末狀后移入離心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，振蕩，冰上孵育5 min后，4 ℃離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 mL異丙醇，振蕩，冰上孵育5 min后，4 ℃離心10 min，棄上清液，加入1 ml 75%乙醇，振蕩后，4 ℃離心5 min，棄上清液后室溫下使之干燥，加入DEPC處理水10 μL溶解RNA.瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性后，使用RT-PCR將mRNA反轉錄成cDNA待用.使用逆轉錄試劑盒(Farmentas MBI), 并按試劑盒說明書進行操作.加4 μL RNA樣品于冰上放置的EP管中，1 μL的oligo(dT)，加無菌無酶水至總體積為12 μL.混勻后離心5 s，70 ℃溫浴5 min，再于冰上按順序加入：4 μL 5×buffer、1 μL RNasin(20 u/μL)、2 μl 10 mM dNTP mix.混勻后短暫離心，37 ℃孵育.加1 μL的M-MLV(200 u/μL)，至反應終體積為20 μL.42 ℃孵育1 h，70 ℃溫浴10 min，冰上放置.產(chǎn)物-20 ℃保存.

1.5 引物設計與REAL-TIME PCR反應

在Gene Bank中進行目的基因全序列查找，采用Primer Express 3.0設計軟件設計引物，引物序列及其相關信息見表1.

表1 各基因引物序列及相關信息

將各目的基因按照10倍濃度梯度稀釋，選擇1/10、1/100、1/1 000和1/10 000稀釋濃度的樣品作為標準品模板，進行實時熒光定量PCR反應.通過這4個標準品生成的反應數(shù)據(jù)，由Multicolor Real-Time PCR detection system自動生成標準曲線，根據(jù)各標準品拷貝數(shù)的對數(shù)與其對應的Ct值可建立一個方程.當R2>0.95時，可認為標準曲線建立成功[7].

1.6 ELISA檢測亞組取材與實驗

整個訓練計劃結束后24 h，C3組和E3組大鼠苯巴比妥鈉(4 mg/100 g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，左心室心尖部取血，靜置15 min后，離心15 min(4 000 r/min，室溫)，取上清液，-20 ℃保存.使用全波長酶標儀測量血清心肌肌鈣蛋白T/I和腦鈉肽的吸光度，按說明書制作標準曲線，得出回歸方程后，計算各樣品中心肌肌鈣蛋白T/I和腦鈉肽的濃度.

1.7 實驗數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0處理相關數(shù)據(jù)，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為具有顯著性差異.

2 實驗結果

2.1 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的變化

大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)變化如表2所示.

表2 大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)

注：*與C組比較P<0.05.

由表2可知，實驗結束后，E組大鼠心臟質(zhì)量低于C組，但不具有顯著性差異；E組大鼠質(zhì)量顯著低于C組(P<0.05)；E組大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)增大，與C組比較具有顯著性差異(P<0.05).

2.2 心肌組織HE染色觀察

大鼠心肌組織HE染色觀察如圖1所示.

圖1 大鼠心肌組織結構觀察(放大200倍)

由圖1可見，C組大鼠心室肌橫切面纖維結構清晰，呈短柱狀(圖1-A)；縱切面纖維結構清晰，呈不規(guī)則長條形(圖1-B).E組大鼠心肌纖維結構清晰，橫紋明顯，可見肌纖維體積較C組有一定的增粗，未見變性和壞死現(xiàn)象(圖1-C、圖1-D).

2.3 心肌組織mTOR免疫組織化學法結合計算機圖像處理檢測

大鼠心臟組織mTOR免疫染色結果見圖2.

圖2 大鼠心肌組織mTOR免疫組織化學觀察(放大200倍)

由圖2可見，C1組(2-A)大鼠心肌細胞中存在少量mTOR免疫陽性反應染色.E1組(圖2-B)大鼠心肌細胞中存在mTOR免疫陽性反應染色.與C1組相比，免疫陽性反應明顯增強，棕黃色顆粒染色密度明顯增加.計算機圖像處理結果見表3.

表3 大鼠心臟組織mTOR表達圖像分析結果

注：*與C1組相比，P<0.05.

2.4 實時熒光定量PCR檢測結果

目的基因mTOR的Real-time PCR標準曲線見圖3，目的基因AMPK的Real-time PCR標準曲線見圖4.mTOR和AMPK基因相對表達水平見表4.

圖3 mTOR的標準曲線和回歸方程

圖4 AMPK的標準曲線和回歸方程

組 別mTOR表達水平AMPK表達水平C2組(n=9)25．61±3．1740．26±4．00E2組(n=9)35．59±4．09?38．09±2．87

注：*P<0.05.

由表5可知，E2組大鼠mTOR表達顯著高于C2組，P<0.05；E2組大鼠AMPK表達雖然高于C2組，但無顯著性差異.

2.5 心臟血清腦鈉肽和血清肌鈣蛋白T/I ELISA檢測結果

大鼠血清腦鈉肽和血清肌鈣蛋白T/I的標準曲線和回歸方程見圖5～7，各組BNP和血清肌鈣蛋白T/I的表達比較見表5.

圖5 大鼠血清BNP的標準曲線及回歸方程

圖6 大鼠血清心肌肌鈣蛋白T標準曲線及回歸方程

圖7 大鼠血清心肌肌鈣蛋I標準曲線及回歸方程

分組腦鈉肽/(ng/L)心肌肌鈣蛋白T/(ng/L)心肌肌鈣蛋白I/(ng/L)C2組121．36±6．5231．21±1．5668．05±4．20E2組121．53±3．8731．57±1．2268．51±1．73

注：與C組比較P>0.05.

由表5可知，E3組大鼠血清腦鈉肽以及血清心肌肌鈣蛋白T/I的表達雖然高于C3組，但無顯著性差異.

3 分析和討論

3.1 中等強度耐力訓練對心臟組織學形態(tài)的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，實驗動物造模結束后，E組大鼠的質(zhì)量明顯低于C組，心臟質(zhì)量指數(shù)顯著增加，表明大鼠耐力運動型心肌肥大模型建立成功.E組大鼠心臟質(zhì)量未發(fā)生顯著性變化，這與部分實驗結果相符[6].其原因可能是耐力訓練主要造成心室腔的擴大，而心室壁無需過度增厚，心臟質(zhì)量不會發(fā)生顯著性變化，也可能是實驗訓練周數(shù)較短，心臟的絕對質(zhì)量增加程度尚不明顯所致[7].實驗中，E組大鼠的心臟體積增大，心室腔擴大，心肌纖維增粗；形態(tài)學檢測發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌纖維結構清晰，橫紋清楚可見，未見心肌纖維間顯著水腫、嗜酸性染色增強、血管擴張與局限性間質(zhì)水腫等病理性改變.

3.2 中等強度耐力訓練對心臟mTOR/AMPK信號通路表達的影響

mTOR是一個高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是細胞營養(yǎng)狀態(tài)、能量狀態(tài)的傳感器，它處于PI3K/Akt信號通路的下游，在調(diào)節(jié)細胞生長和細胞周期中起非常關鍵的作用[8].AMPK是真核生物能量代謝變化的感受器，能感受運動時肌肉收縮所引起的能量變化，從而在機體對運動的適應性反應中發(fā)揮重要作用[9].由于其細胞能量調(diào)節(jié)器的作用，mTOR/AMPK信號通路在心肌肥大，尤其是病理性心肌肥大中扮演重要角色：一方面，病理性的刺激，如運動中產(chǎn)生的缺血缺氧可迅速激活AMPK，導致心肌糖代謝增加和脂質(zhì)過氧化，而這正是病理性心肌肥大的重要特征；另一方面，AMPK的激活可以抑制下游靶蛋白的活性，從而抑制心肌細胞蛋白合成和肥大進程[10].因此，本實驗通過心臟mTOR和AMPK的表達變化，來判斷中等強度耐力訓練后心肌細胞中能量的變化情況與心肌細胞mTOR/AMPK信號通路的變化情況.

實時熒光定量PCR檢測和免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，E1組和E2組大鼠心臟mTOR的表達較對照組均發(fā)生了顯著性提高，表明在中等強度耐力訓練刺激下大鼠心臟mTOR的激活，而實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，E2組大鼠心臟AMPK的mRNA表達較C2組大鼠的表達均值降低了5.7%，但統(tǒng)計學檢測不具有顯著性差異，說明在中等強度耐力訓練刺激下大鼠心臟AMPK并沒有被激活.由于當細胞內(nèi)出現(xiàn)營養(yǎng)剝奪或缺氧時，細胞內(nèi)AMPK的含量會顯著增高，由此可以推測，中等強度耐力訓練后，心肌細胞的能量消耗不大，細胞內(nèi)未出現(xiàn)營養(yǎng)剝奪或缺氧狀態(tài)，即8周的中等強度耐力訓練并沒有造成大鼠心肌細胞能量環(huán)境的改變.心肌細胞的能量底物來源主要包括脂肪酸代謝和糖代謝，這2個進程都可被AMPK調(diào)節(jié).提示AMPK的激活可能在不同的致肥大機制中扮演雙重角色：當壓力負荷性(或病理性)肥大時，AMPK增多，糖酵解增加，導致病理性心肌肥大繼續(xù)發(fā)生；而當生理性肥大時，AMPK表達降低，蛋白合成增加，促進生理性肥大的繼續(xù)發(fā)生.在本實驗中，AMPK的mRNA表達下降，但沒有顯著性差異，至少可以表明此時的心肌肥大并不是病理性的肥大.

3.3 中等強度耐力訓練對心肌和骨骼肌mTOR信號通路表達影響的異同

體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，相同細胞類型在面對不同機械刺激時，其激活的信號通路是不同的[11]，這提示雖然心肌細胞和骨骼肌細胞都屬于肌細胞，但在運動刺激作用下，兩者經(jīng)mTOR途徑合成蛋白的信號通路變化狀況是不一致的.其中mTOR/p70S6K信號通路作為一條對機械刺激、營養(yǎng)雙敏感的信號通路，很容易被細胞內(nèi)能量狀態(tài)感受器AMPK調(diào)節(jié).目前，對于心肌細胞在運動刺激下mTOR/AMPK信號通路變化情況的研究未見系統(tǒng)的報道，按經(jīng)驗，心肌mTOR表達增高時，AMPK的活性應受到抑制.但在本實驗中，雖然mTOR的表達發(fā)生了顯著升高，卻沒有證據(jù)表明AMPK的活性受到了抑制，相反AMPK的表達還存在一定的提高.此結果提示在中等強度耐力訓練的刺激下，心肌細胞AMPK與mTOR之間可能并不存在著相互抑制關系.而對于骨骼肌細胞來說，不同類型的運動刺激會造成mTOR/AMPK信號通路的不同變化.Nader等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，長時間低強度的耐力訓練造成的營養(yǎng)缺乏或缺氧等因素激活AMPK，下調(diào)mTOR表達.而抗阻訓練則選擇性抑制骨骼肌AMPK通路，從而激活TSC2/mTOR信號通路[13].

3.4 中等強度耐力訓練對心臟損傷標志物的影響

3.4.1 中等強度耐力訓練對腦鈉肽的影響.

8周中等強度耐力訓練后，有2只大鼠血清腦鈉肽含量出現(xiàn)了顯著性上升，但E3組整體腦鈉肽均值只略高于C3組，未出現(xiàn)顯著性差異.大鼠在經(jīng)過8周的耐力訓練后出現(xiàn)了運動性心肌肥大，而血清腦鈉肽濃度未顯著性升高，提示在生理性的運動性心肌肥大中，腦鈉肽可能并未參與該過程.運動后血清腦鈉肽表達上升可能是由于運動對心室壁造成牽張壓力，心肌細胞中儲存的腦鈉肽釋放入血；而經(jīng)過對8周中等強度耐力訓練的適應，心肌細胞中腦鈉肽的基因表達和合成重新編碼，大鼠心臟對容積負荷等刺激產(chǎn)生適應，不再加速釋放腦鈉肽入血，從而使血液中的腦鈉肽表達不再增高[7].本實驗中，8周中等強度耐力訓練后，大鼠出現(xiàn)生理性心肌肥大，未出現(xiàn)心功能惡化與慢性心衰等病理改變，表明腦鈉肽未參與運動心臟重塑的過程，不能直接反映心臟在運動后是否出現(xiàn)病理改變.

3.4.2 中等強度耐力訓練對心肌肌鈣蛋白的影響.

實驗結果發(fā)現(xiàn)，8周中等強度耐力訓練后，E3組中有3只大鼠的血清心肌肌鈣蛋白表達出現(xiàn)了顯著性升高，但整個E3組大鼠血清心肌肌鈣蛋白均值水平與C3組相比，無顯著性差異.對心肌細胞形態(tài)結構的顯微檢測未發(fā)現(xiàn)病理性改變，提示運動后血清肌鈣蛋白表達高于閾值，更可能是一種生理性的可逆性的變化.心肌細胞在對中等強度耐力訓練的適應過程中，會出現(xiàn)與骨骼肌纖維對耐力訓練適應過程中相似的情況，即會在心肌細胞膜上形成一個短暫的細胞傷口，造成運動后的心肌肌鈣蛋白的釋放.Hickman等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，在缺血狀態(tài)下，心肌細胞膜表面會形成一個囊泡，心肌肌鈣蛋白釋放入血，但此時心肌細胞并未壞死；當缺血嚴重或時間過長時，囊泡破裂，心肌細胞凋亡、壞死.這可合理地解釋從適宜強度到過量運動時，心肌細胞形態(tài)和血清心肌肌鈣蛋白表達的變化情況，即運動能誘發(fā)心肌肌鈣蛋白釋放入血，但此時心肌細胞并未發(fā)生凋亡、壞死等病理改變.

目前，心肌肌鈣蛋白表達的顯著升高仍然是臨床判斷心肌細胞壞死的首選病理依據(jù)，而這種判斷依據(jù)在運動醫(yī)學領域是值得商榷的.本研究證實，運動后心肌肌鈣蛋白和腦鈉肽表達升高并不能直接反映心肌細胞壞死和心功能惡化，這種變化應是發(fā)生在心臟形態(tài)結構功能發(fā)生重塑過程中造成的心肌細胞生理性、可逆性的微小損傷.應將血清心肌肌鈣蛋白和腦鈉肽的表達，結合物理檢測及確定心血管疾病癥狀后才能確診運動后心血管功能的病變.

4 結 論

8周中等強度耐力訓練導致的耐力運動型心肌肥大未發(fā)生心功惡化和慢性心衰，8周的中等強度耐力訓練未造成大鼠心肌細胞能量環(huán)境的改變，心肌mTOR/AMPK信號通路的表達與骨骼肌存在顯著差異.訓練后心肌肌鈣蛋白和腦鈉肽表達升高并不能直接反映心肌細胞壞死和心功能惡化，其變化應是由心臟形態(tài)結構功能重塑造成的.

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Research on Mechanism of Markers of Myocardial Injury after Moderate-intensity Endurance Training and Changes of Energy Metabolism Pathway

LIXin

(School of Sports, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to study the working mechanism of the mTOR/AMPK signaling pathway changes and the myocardial injury markers,such as cardiac troponin,BNP and energy metabolism pathway of rats after moderate-intensity training.60 healthy male SD rats are randomly divided into control group and endurance training group.An athletic endurance myocardial hypertrophy model of those rats is established.Immunohistochemistry combined with computer image processing technology is used to observe and detect the morphology of hearts and also the distribution and expression of mTOR.Real-time PCR method is used to test the mRNA expression of mTOR and AMPK.ELISA method is also used to detect the expression of serum cardiac troponin T,cardiac troponin I and BNP of rats.The results show that after 8 weeks of moderate-intensity endurance training,1)heart tissue of rats in group E shows no pathological changes;2)The immune-positive area and optical density of mTOR immunoreaction of rats from group E is significantly enhanced(P<0.05);3)AMPK and mRNA expression of rats from group E shows no significant changes either while the mRNA of mTOR increases dramatically(P<0.05);4)The BNP,cardiac troponin T and cardiac troponin I expression of rats in group E increase but demonstrate no significant changes.The conclusion drawn is that 1)atheltic endurance cardiac hypertrophy caused by 8 weeks of moderate-intensity training does not deteriorate at all and shows no trend of chronic heart failure;2)the slightly elevation of cardiac troponinT/I and BNP after training does not reflect myocardial cell necrosis and cardiac deterioration.All the changes are caused by the remodeling of cardiac morphology and function;3)8 weeks of moderate-intensity endurance training does not lead to environmental changes of the cardiac cell energy;4)there is a significant difference between the mTOR/AMPK signaling pathway expression and cardiac muscle and skeletal muscle under moderate intensity endurance training.

endurance training;cardiac troponin;BNP；mTOR/AMPK；signaling pathway

1004-5422(2017)01-0024-06

2016-12-29.

李 欣(1980 — )， 男， 博士， 副教授， 從事運動與心血管健康研究.

G804.2

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