一株Chitinophaga菌株的鑒定、優(yōu)化及其活性蛋白的初步純化

劉冰花， 楊 林， 羅 玲， 蒲麗娟， 褚應文， 楊 港

(成都大學 醫(yī)學院(護理學院)， 四川 成都 610106)

一株Chitinophaga菌株的鑒定、優(yōu)化及其活性蛋白的初步純化

劉冰花， 楊 林， 羅 玲， 蒲麗娟， 褚應文， 楊 港

(成都大學 醫(yī)學院(護理學院)， 四川 成都 610106)

為確定前期獲得的可產(chǎn)生抗血栓物質(zhì)細菌的分類地位、優(yōu)化發(fā)酵條件及對活性物質(zhì)初步純化.利用形態(tài)學特征、理化性質(zhì)、脂肪酸含量、G+C含量、16S rRNA序列同源性及DNA-DNA雜交率等方法鑒定菌株MJM 38，利用纖維蛋白平板法檢測溶栓活性，利用纖維蛋白原平板法檢測抗凝活性，利用單因素法篩選菌株MJM 38產(chǎn)生抗血栓活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)條件，利用鹽析、超濾及分子篩層析等方法對其活性物質(zhì)進行了初步分離.結果發(fā)現(xiàn)，菌株MJM 38屬于Chitinophaga菌，初步確定抗血栓活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)，其分子量大小在30 kDa～100 kDa之間，菌株MJM 38在培養(yǎng)時間為4 d、培養(yǎng)溫度為25 ℃～30 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為7時產(chǎn)生的抗血栓物質(zhì)的溶栓活性最大.

Chitinophaga；鑒定；優(yōu)化；純化；抗血栓；蛋白

0 引 言

Chitinophaga中文名為曼噬甲殼菌屬或噬幾丁質(zhì)菌屬，于1981年由Sangkhobol等首次提出，并根據(jù)其形態(tài)學和理化性質(zhì)特征把Chitinophaga屬歸類為Myxobacteria[1-3].1999年，Sly等[4]在分子水平上發(fā)現(xiàn)Chitinophaga屬更接近于鞘脂桿菌目的部分細菌，2006年，Kampfer等[5]將Chitinophaga屬的菌株重新歸類為擬桿菌門鞘脂桿菌綱鞘脂桿菌目泉發(fā)菌科.雖然Chitinophaga屬的菌株大多為黃色或橙黃色[2,6]，顏色特征比較明顯，但它們普遍生長緩慢，很容易被其他雜菌污染，不容易分離純化，相關研究主要集中在新菌種的發(fā)現(xiàn)方面，對其產(chǎn)生活性物質(zhì)的研究較少[6-7].為尋找新的抗血栓藥物資源，本研究對前期篩選到的一株可產(chǎn)生抗血栓活性物質(zhì)的細菌做了進一步鑒定，優(yōu)化了其發(fā)酵條件，并對其產(chǎn)生的抗血栓活性蛋白做了分離純化.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 培養(yǎng)基.

酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基：0.3%酵母膏，0.5%蛋白胨，1.6%瓊脂粉，pH值為7.22；酵母膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基：0.5%酵母膏，1.0%蛋白胨，pH值為7.22；其他培養(yǎng)基按照文獻[8]的配方配制.

1.1.2 試劑、菌株及儀器.

1)試劑.尿激酶(麗珠集團麗珠制藥廠)，凝血酶(湖南一格制藥有限公司)，纖維蛋白原1 g/瓶(sigma公司)，脂肪酸標準品Mixture Me 82(Larodon公司)，等.

3)儀器.PCR反應擴增儀(Thermo公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司)，GC-9A氣相色譜儀(島津公司)，等.

1.2 菌株MJM 38的種屬鑒定

1.2.1 菌株的形態(tài)學觀察.

將菌株MJM 38接種在酵母膏蛋白胨平板上，于30 ℃孵箱培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)，同時對菌株進行革蘭氏染色.

1.2.2 菌落的理化性質(zhì)檢驗.

分別在溫度范圍為10 ℃～40 ℃的區(qū)間內(nèi)、pH值在4～10的范圍內(nèi)、NaCl濃度為0%～2%的范圍內(nèi)檢測菌株在酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長情況，并進行糖同化作用實驗、糖發(fā)酵實驗、接觸酶實驗、淀粉水解實驗、V-P測定、馬尿酸鹽水解實驗、明膠水解實驗、硝酸鹽還原實驗等[8].

1.2.3 16S rDNA的鑒定.

將細菌MJM 38在酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，收集菌體，采用凍融法[9]提取其基因組DNA.以通用引物7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′)和1540r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)為引物，以目的細菌的基因組DNA為模板，擴增該菌株的16S rDNA.其反應條件為：25 μL反應體系，94 ℃預變性5 mim；35次循環(huán)(94 ℃ 30 s,55 ℃ 35 s，72 ℃ 1 min)，72 ℃延伸8 min.將擴增產(chǎn)物送上海生物工程公司測序，得到目的細菌的16S rDNA序列.在NCBI GenBank中BLAST，用 MEGA 6軟件以Neighbor-joining法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用DNAMAN 8軟件比對其與其他菌株的相似度.

1.2.4 菌株的脂肪酸含量、(G+C)mol%含量及DNA同源性測定.

1)按照文獻[10]的方法，采用氣相色譜法測定目的菌株的脂肪酸含量.

2)采用熔解溫度(Tm)法測定菌株基因組DNA的(G+C)mol%含量.以E.coliK12為參比菌株，采用凍融法[9]提取目的菌株和E.coliK12的基因組DNA，并制作目的菌株和E.coliK12的變性曲線，根據(jù)熱變性曲線分別求出目的菌株和E.coliK12的熔鏈溫度(Tm)，根據(jù)公式，(G+C)mol%=(G+C)mol%E.coliK12+2.08(Tm未知-TmE.coliK12)，計算目的菌株的(G+C)mol%含量.

1.3 菌株MJM 38抗血栓活性物質(zhì)的檢測及分離純化

1.3.1 菌株MJM 38抗血栓活性物質(zhì)的檢測.

按照文獻[12]的方法制備胞外濃縮液.采用纖維蛋白平板法[13]檢測目的菌株的溶栓活性，采用纖維蛋白原平板法[13]檢測目的菌株的抗凝活性.

1.3.2 菌株MJM 38抗血栓活性物質(zhì)的分離純化.

將目的菌株的胞外濃縮液6 mL，用等體積氯仿萃取，收集上層水相.在水相中加入硫酸銨粉末進行分步鹽析.將鹽析后的樣品用不同截留分子量的超濾離心管進行超濾，超濾后得到200 μL樣品(溶液Ⅰ).將溶液Ⅰ上葡聚糖凝膠G-150層析柱，收集各峰，并檢測各峰的溶栓抗凝活性.

1.4 培養(yǎng)條件對菌株MJM 38生長的影響及發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.4.1 培養(yǎng)條件對菌株MJM 38生長的影響.

1)將菌株MJM 38由酵母膏蛋白胨斜面轉接入裝有100 mL酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)48 h，以此瓶菌液為種子菌液.以2%的接種量將種子菌液轉接入200 mL新的酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以30 ℃、100 r/min培養(yǎng)，每24 h取出5 mL，以去離子水調(diào)零，測其在波長600 nm處的吸光度，連續(xù)測7 d.以培養(yǎng)時間為橫坐標、以吸光度為縱坐標作圖，確定培養(yǎng)時間對目的菌株生長的影響.

2)以同樣接種量將種子菌液轉接入7個裝有100 mL新的酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，將這7個瓶子分別放入20 ℃、25 ℃、28 ℃、30 ℃、33 ℃、35 ℃及40 ℃搖床中，均以100 r/min培養(yǎng)24 h，分別測其在波長600 nm處的吸光度.以溫度為橫坐標、以吸光度為縱坐標作圖，確定溫度對目的菌株生長的影響.

3)以同樣接種量將種子菌液轉接入7個pH值分別為4、5、6、7、8、9、10的100 mL酵母膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，均以30 ℃、100 r/min培養(yǎng)24 h，分別測其在波長600 nm處的吸光度.以pH值為橫坐標、以吸光度為縱坐標作圖，確定培養(yǎng)基初始pH值對目的菌株生長的影響.

1.4.2 菌株MJM 38發(fā)酵條件的優(yōu)化.

1)用單因素法分別考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間及發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對菌株MJM 38產(chǎn)生抗血栓活性物質(zhì)的溶栓活性的影響.分別以5%的接種量將“1.4.1”項中的種子菌液轉接入100 mL酵母膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基中.檢測培養(yǎng)時間對溶栓活性的影響，將培養(yǎng)瓶放入旋轉搖床中以30 ℃、100 r/min培養(yǎng)，每24 h取出一瓶，連續(xù)取7次.

2)檢測培養(yǎng)溫度對溶栓活性的影響，將培養(yǎng)瓶放入旋轉搖床中分別在20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的溫度下100 r/min培養(yǎng)4 d.檢測發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對溶栓活性的影響，將“1.4.1”項中的種子菌液以5%的接種量分別轉接入pH值為4、5、6、7、8、9、10、11的100 mL酵母膏蛋白胨發(fā)酵培養(yǎng)基中，以30 ℃、100 r/min培養(yǎng)4 d.按照“1.3.1”項的方法檢測每瓶發(fā)酵液的溶栓活性.

2 結果與分析

2.1 菌株MJM 38的形態(tài)特征和理化性質(zhì)

菌株MJM 38好氧，在酵母膏蛋白胨平板上可滑動，10 d滑動0.9 cm.菌落橙黃色，表面黏濕，菌落周圍的平板透明，菌落邊緣呈紡織物的毛邊，細桿狀，兩端鈍圓，菌體大小為(0.06～0.11)μm×(0.5～1.25)μm，生長的溫度范圍為12 ℃～40 ℃，pH值范圍為6～10，最適合的pH值為8.菌株MJM 38的理化性質(zhì)如表1所示，同化作用及糖發(fā)酵實驗結果如表2所示.

表1 菌株MJM 38的理化性質(zhì)

表2 菌株MJM 38的同化作用和糖發(fā)酵實驗

菌株MJM 38和Chitinophaga屬近緣模式菌株的鑒別特征如表3所示.

表3 菌株MJM 38和Chitinophaga屬近緣模式菌株的鑒別特征

注：1.MJM 38；2.CS5-B1T；3.ChitinophagajaponensisT;4.ChitinophagaeiseniaeYC6729T; 5.ChitinophagaterraeT，第1,2列的數(shù)據(jù)來自于本研究；第3、4、5列的數(shù)據(jù)分別來自于參考文獻[14]、[15]和[16]；ND表示無數(shù)據(jù)來源.

2.2 16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育學分析

測序后，發(fā)現(xiàn)菌株MJM 38的16S rDNA共有1 515 bp，將其序列輸入NCBI GenBank中blast，用MEGA 6.05軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)菌株MJM 38與模式菌株Chitinophagarupissp.CS5-B1T(FM865977)聚到了同一個分支，親緣關系最近(見圖1).利用DNAMAN 8軟件比對相似性，發(fā)現(xiàn)菌株MJM 38和模式菌株Chitinophagarupissp.CS5-B1T(FM865977)的相似度為99.79%，菌株MJM 38和模式菌株Flexibacter japonensis T(AB078055)的相似度為97.0%.

注：圖中序列來自于GenBank數(shù)據(jù)庫，括號中的數(shù)字為GenBank登陸號，Neighbor-joining法，反復抽樣1 000次，分支點上的數(shù)值表示步長支持百分比，比例尺表示每100個核苷酸中有2個核苷酸不同.

圖1 菌株MJM 38的基因同源性系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株的脂肪酸含量、G+C含量及DNA雜交率

實驗測得菌株MJM 38所含的主要脂肪酸種類及含量如表4所示.

結合菌株的菌體及菌落形態(tài)、生理生化特性、進化樹、16S rRNA 基因序列的比對結果、脂肪酸含量、G+C含量及DNA-DNA雜交率，確定菌株MJM 38為模式菌株Chitinophagarupissp. CS5-B1T(FM865977)的變種，即菌株MJM 38屬于擬桿菌門鞘脂桿菌綱鞘脂桿菌目泉發(fā)菌科的曼噬甲殼菌屬[17].

表4 菌株MJM 38和慢噬甲殼菌屬其他模式菌株的脂肪酸組成比較

注：1.MJM 38(數(shù)據(jù)來自于本研究);2.C.rupisCS5-B1T(數(shù)據(jù)來自于本研究);3.C.costaiiA37T2T;4.C.pinensisDSM 2588T；5.C.(Flexibacter)sanctiIFO 15057T；表中的數(shù)值表示總脂肪酸的百分比；第3列的數(shù)據(jù)來自于Diogo Neves Proenca，et al.(2014)；第4、5列的數(shù)據(jù)來自于Kmpfer et al.(2006),只列出了含量大于10%的脂肪酸；“-”表示含量小于總脂肪酸的1%.

2.4 菌株MJM 38胞外液的抗凝溶栓活性及活性成分的初步純化

2.4.1 菌株MJM 38胞外液的抗凝溶栓活性.

纖維蛋白平板實驗顯示菌株MJM 38的胞外液有明顯的溶栓活性，如圖2所示.按照文獻[12]的方法測得菌株MJM 38胞外濃縮液纖溶酶活力單位為5 649 U/mL.纖維蛋白原平板實驗顯示菌株MJM 38的胞外液也有一定的抗凝活性.

①表示3 U尿激酶；②表示15 U尿激酶；③表示30 U尿激酶；④表示75 U尿激酶；⑤表示150 U尿激酶；⑥表示30 μL菌株MJM 38的胞外濃縮液(37 ℃培育3 h).

圖2 菌株MJM 38的胞外液在纖維蛋白平板上的透明圈

2.4.2 菌株MJM 38抗血栓活性物質(zhì)的初步純化.

硫酸銨分步沉淀的結果是硫酸銨飽和度為30%～70%之間的部分有抗血栓活性.超濾后發(fā)現(xiàn)分子量在30 kDa～100 kDa之間的部分(溶液Ⅰ)有抗血栓活性.溶液Ⅰ經(jīng)過葡聚糖凝膠G-150柱的層析圖譜如圖3所示，經(jīng)過纖維蛋白平板和纖維蛋白原平板檢測，發(fā)現(xiàn)只有峰1具有溶栓抗凝活性.

圖3 溶液Ⅰ的葡聚糖凝膠G-150柱層析圖譜

2.5 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件對菌株MJM 38生長的影響，菌株MJM 38產(chǎn)生抗血栓活性物質(zhì)的發(fā)酵條件的優(yōu)化，培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基初始pH值對菌株MJM 38生長的影響及對所產(chǎn)生的抗血栓物質(zhì)的溶栓活性的影響如圖4～圖6所示.

從圖4可知，菌株MJM 38從第2 d開始進入對數(shù)生長期，第4 d末對數(shù)期結束，無明顯穩(wěn)定期，從第5 d開始進入衰亡期；當培養(yǎng)時間為4 d時，透明圈和加樣孔直徑的比值最大，表明菌株MJM 38產(chǎn)生溶栓活性物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時間為4 d.從圖5可知，當溫度為30 ℃時，菌株在波長600 nm處的光吸收值最大，表明菌株MJM 38生長的最適溫度為30 ℃；菌株在25 ℃、28 ℃及30 ℃時透明圈和加樣孔直徑的比值最大，表明菌株MJM 38產(chǎn)生溶栓活性物質(zhì)的最佳溫度為25 ℃～30 ℃.從圖6可知，菌株在pH值為7時的吸光度最大，表明菌株MJM 38生長的最佳pH值為7；同時，菌株在pH值為7時透明圈和加樣孔直徑的比值最大，表明菌株MJM 38產(chǎn)生溶栓活性物質(zhì)的最佳pH值為7.

3 討 論

圖4 培養(yǎng)時間對溶栓活性的影響及對MJM 38生長的影響

圖5 培養(yǎng)溫度對溶栓活性的影響及對MJM 38生長的影響

圖6 發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值對溶栓活性的影響及對MJM 38生長的影響

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Identification,Optimization and Preliminary Purification of Active Protein of Chitinophaga Strain

LIUBinghua,YANGLin,LUOLing,PULijuan,CHUYingwen,YANGGang

(School of Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

The paper is going to determine the taxonomic status of the strain which can produce antithrombotic material,optimize the fermentation conditions and preliminarily purify the active substance.The strain MJM 38 is identified by morphological characteristics,physical and chemical properties,fatty acid content,G+C content,16S rRNA sequence homology, phylogenetic tree and DNA-DNA hybridization rate.The fibrinolysis activity is detected by the fibrin plate and the anticoagulant activity is detected by fibrinogen plate.The optimum culture condition for MJM 38 to produce antithrombotic substance is selected by single-factor method.The initial prefractionation of the active substance is done briefly by salting out,hyperfiltration and molecular sieve chromatography,etc.The results show that the strain MJM 38 belongs to Chitinophaga.The antithrombotic activity substance is initially identified as protein and its molecular weight is between 30～100 kDa.It is also found that when the optimum culture conditions for strain MJM38 to produce antithrombotic protein are 4 d,25～30 ℃,and pH 7,the fibrinolysis activity of the antithrombotic substance achieves the maximum.

Chitinophaga;identification;optimization;purification;antithrombotic;protein

2016-12-13.

四川省教育廳自然科學重點課題(12ZA207)資助項目.

劉冰花(1970 — )， 女， 碩士， 教授， 從事藥用微生物研究.

1004-5422(2017)01-0001-06

Q939.124

A