石蠟包埋軟骨組織中DNA提取方法的改良

喬 梁，周 盛，楊 軍，滕華建，蔣 青

石蠟包埋軟骨組織中DNA提取方法的改良

喬 梁1，周 盛1，楊 軍2，滕華建3，蔣 青1

軟骨；石蠟包埋；DNA

隨著基因遺傳學(xué)的發(fā)展，DNA檢測(cè)技術(shù)也日臻完善，而對(duì)某些特定疾病的基因分析能為探究疾病的發(fā)病機(jī)制以及遺傳概況提供可靠的方法學(xué)依據(jù)。各大醫(yī)院的病理科均存留著大量的組織蠟塊，從這些石蠟標(biāo)本中提取DNA可以在短時(shí)間內(nèi)獲得足夠的目標(biāo)疾病DNA。目前已有多位學(xué)者對(duì)從石蠟包埋樣本中提取DNA的方法學(xué)進(jìn)行了大量的探索和研究[1]，對(duì)于不同組織，提取DNA的難易程度會(huì)有很大不同：從細(xì)胞數(shù)量比較多的肺組織和腸組織中提取DNA已易做到，但對(duì)于軟骨組織，這一類密度很低而且細(xì)胞數(shù)目很少的組織中提取DNA仍存在一定困難。針對(duì)這一問題本文現(xiàn)探究從石蠟軟骨組織切片中提取DNA并用于基因檢測(cè)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2012年～2015年南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院存檔的軟骨瘤和軟骨肉瘤福爾馬林固定后的石蠟組織包埋塊。軟骨瘤34例，其中男性18例，女性16例，年齡14～72歲，平均43.7歲。軟骨肉瘤31例，其中男性17例，女性14例，年齡22～79歲，平均44.0歲。所有患者均經(jīng)經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師明確診斷。標(biāo)本來自股骨、脛骨、肋骨、骨盆等全身各處軟骨組織。

1.2 方法 對(duì)于每塊蠟塊均先切除表面兩層已污染和氧化的部分[2]，然后切取一張2 μm厚切片用于HE染色，最后根據(jù)標(biāo)本的大小切取3～6張10 μm厚切片用于DNA提取。為了精確提取軟骨及軟骨腫瘤的組織，所有樣本的HE切片均經(jīng)經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師鏡下畫出軟骨及軟骨腫瘤部分，根據(jù)HE切片的畫取部分，選擇性地刮取切片樣本用于提取DNA。

1.3 DNA提取方法和試劑 參考袁亞婷等[3-6]總結(jié)的方法，選擇改良TES水浴脫蠟-酚氯仿法作為傳統(tǒng)的提取方法。該方法對(duì)肺組織和腸組織均能很好地提取出DNA，然而對(duì)于軟骨組織的DNA提取效果不佳，所提出的平均濃度僅有12 ng/μL。濃度太低難以達(dá)到后續(xù)的PCR及測(cè)序的要求。

本實(shí)驗(yàn)采用Qiagen公司的QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒提取法。方法如下：(1)將固定在載玻片上的切片標(biāo)本分別浸入二甲苯缸脫蠟20 min，浸入乙醇缸洗二甲苯15 min。(2)將標(biāo)本刮入EP管內(nèi)，加入180 μL Buffer ATL和20 μL蛋白酶K，在56 ℃和90 ℃先后孵化1 h。(3)加入200 mL buffer AL和200 mL乙醇，震蕩混勻。(4)將全部的溶液轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)，8 000 r/min離心1 min，丟棄濾液。加入500 mL Buffer AW1，8 000 r/min離心1 min，丟棄濾液。加入500 mL Buffer AW2，8 000 r/min離心1 min，再次丟棄濾液。再次離心，甩干所有液體。(5)把純化柱放入新的EP管內(nèi)，加入50 μL Buffer ATE。14 000 r/min離心1 min所得即為DNA。

本實(shí)驗(yàn)采用此試劑盒所提取的DNA濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一些傳統(tǒng)方法提取的濃度，且提取時(shí)間也大為縮短。但由于一些組織存放時(shí)間太久或者細(xì)胞含量太少所提取濃度也偏低，為了提高提取濃度，本文總結(jié)了兩種對(duì)試劑盒提取改良方法。方法一：在實(shí)驗(yàn)開始的時(shí)候?qū)τ谕粯颖咀?份，最后在步驟(4)加入純化柱時(shí)把2份同一樣本的濾液合在一個(gè)純化柱里離心，可以達(dá)到提高濃度的效果。方法二：直接將石蠟樣本切蠟卷放在EP管里，脫蠟再提取DNA。即更改步驟(1)為：加入1 mL二甲苯在裝有樣本的EP管內(nèi)，蓋上蓋子充分震蕩10 s，14 000 r/min離心2 min，棄上清。加入1 mL乙醇(96%～100%)，充分震蕩10 s，14 000 r/min離心2 min，棄上清。打開EP管蓋，室溫下靜置10 min至乙醇完全揮發(fā)。

2 結(jié)果

2.1 提取結(jié)果 1例軟骨瘤樣本因經(jīng)過脫鈣處理后DNA濃度太低無法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，剩余33例軟骨瘤樣本DNA平均OD260/280=1.848，平均濃度為64.504 ng/μL(圖1)。31例軟骨肉瘤樣本DNA平均OD260/280=1.868，平均濃度為63.644 ng/μL(圖2)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNA提取的濃度結(jié)果受軟骨石蠟標(biāo)本的保存時(shí)間、標(biāo)本組織的大小以及軟骨細(xì)胞的影響。

圖1 軟骨瘤DNA提取結(jié)果分布左下角DNA極低的個(gè)例即是脫鈣處理的樣本

圖2 軟骨肉瘤DNA提取結(jié)果分布

2.2 PCR測(cè)序結(jié)果 本次提取的DNA主要用來檢測(cè)LKB1基因在這些軟骨瘤及軟骨肉瘤樣本中是否有突變[7-8]。64例樣本均完成基因檢測(cè)，但未檢測(cè)出任何突變結(jié)果(圖3)。

圖3 軟骨組織石蠟標(biāo)本提取DNA的測(cè)序圖截取部分

12例樣本選用常規(guī)試劑盒法提取，平均濃度為35.325 ng/μL，其中8例樣本由于濃度過低無法后續(xù)實(shí)驗(yàn)，再次換用改良的提取方法。對(duì)于標(biāo)本體積較大而腫瘤組織部分較少者選擇改良方法一，刮取2份樣本，最后再放在同一純化柱里離心，共27例，平均濃度82.435 ng/μL。對(duì)于樣本體積較小而腫瘤組織比例較大者選擇改良方法二，直接切成蠟卷放入EP管里進(jìn)行脫蠟提取，共33例，平均濃度為66.815 ng/μL。從濃度上看改良方法一的提取濃度高于改良方法二，但由于兩種方法所選擇的樣本不同，所以并不能認(rèn)為改良方法一優(yōu)于改良方法二。

3 討論

每個(gè)醫(yī)院的病理科均存有大量的石蠟標(biāo)本，對(duì)于基因遺傳學(xué)的研究來說這些標(biāo)本均是極其容易獲取的巨大財(cái)富。因此能夠熟練成功地從石蠟標(biāo)本中提取DNA并用于基因檢測(cè)對(duì)基因遺傳學(xué)的研究十分重要。

但是由于組織的特異性，不同組織的石蠟標(biāo)本提取DNA的難易程度也有很大不同。從腸或肺組織中提取DNA可以很容易獲取高濃度的DNA。但是對(duì)于骨和軟骨這樣的組織成分比較多，細(xì)胞成分卻很少的特殊組織，從石蠟包埋的樣本中提取DNA存在著一定難度。有學(xué)者總結(jié)了從骨組織中提取DNA的方法[9-11]。對(duì)于軟骨組織，采用蛋白酶K-Chelex100法用于大塊軟骨組織提取的DNA能得到比較滿意的結(jié)果[12-13]，但是用于石蠟包埋軟骨組織中提取DNA難度卻很大。對(duì)于新鮮且組織量較大的石蠟包埋軟骨組織，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒能獲取較好的DNA。

對(duì)于試劑盒常規(guī)使用仍不能夠提取足夠濃度DNA的情況，作者總結(jié)了兩種改良方法。方法一：由于試劑與EP管容積的限制，每次使用樣本數(shù)量有限制，為了提高產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)在開始的時(shí)候?qū)τ谕粯颖咀?份，即同一標(biāo)本選擇6～12張切片，平均分在2個(gè)EP管內(nèi)，同時(shí)進(jìn)行前3個(gè)步驟。在步驟(4)加入純化柱時(shí)再合在一個(gè)純化柱里可以達(dá)到提高濃度的效果。方法二：直接切3～6張蠟卷放在EP管里脫蠟再提取，這樣既可增加軟骨組織的量又能避免脫蠟引起的損失。該方法也能較好地提高提取DNA的濃度，缺點(diǎn)是無法對(duì)照HE切片精確選擇軟骨部分。

不過該試劑盒及改良方法對(duì)于脫鈣的軟骨樣本提取仍存在著很大的困難，常用的脫鈣方法主要是強(qiáng)酸脫鈣和EDTA脫鈣兩種。強(qiáng)酸脫鈣效率高但是會(huì)嚴(yán)重破壞DNA的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致DNA提取結(jié)果濃度很低而且碎片化很嚴(yán)重，很難用于下一步的PCR和基因測(cè)序。EDTA脫鈣一般不會(huì)破壞組織的DNA，但是缺點(diǎn)是耗時(shí)太長(zhǎng)。而病理科為了提高效率基本使用強(qiáng)酸脫鈣，所以病理科脫鈣的樣本往往不能挑選使用。

本實(shí)驗(yàn)第一次探討了能否從石蠟包埋的軟骨組織中提取DNA進(jìn)行基因檢測(cè)以及如何提高DNA的提取濃度。本實(shí)驗(yàn)除1例脫鈣標(biāo)本由于提取濃度過低DNA片段太小以外，其余的64例樣本均成功提取了DNA并順利地進(jìn)行了PCR和基因測(cè)序。該方法可以為軟骨腫瘤相關(guān)基因?qū)W研究，快速提取到大量的DNA進(jìn)行基因檢測(cè)提供一些指導(dǎo)意義。

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1南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)與成人重建外科、2病理科，南京 2100083南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所骨與關(guān)節(jié)疾病遺傳研究實(shí)驗(yàn)室，南京 210061

喬 梁，男，碩士研究生，醫(yī)師。Tel: (025)83106666-61031，E-mail: smartmedq@163.com 蔣 青，男，博士，主任醫(yī)師，通訊作者。E-mail: jiangqing112@hotmail.com

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1001-7399(2017)02-0215-03

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.02.025

接受日期：2016-09-18