吲哚克酮酸的合成及其作為光聲成像造影劑的初步研究

魯 亮, 郭 麗, 胡曰富, 齊慶蓉

(四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041)

·研究論文·

吲哚克酮酸的合成及其作為光聲成像造影劑的初步研究

魯 亮, 郭 麗, 胡曰富, 齊慶蓉*

(四川大學 華西藥學院，四川 成都 610041)

以克酮酸和2,3,3-三甲基-3H吲哚為原料，經縮合反應合成了吲哚克酮酸(ICR)，其結構經1H NMR和MS確證。并將ICR作為光聲成像造影劑進行了初步研究。結果表明：ICR在近紅外區(qū)的吸收強烈且尖銳，最大吸收波長為755 nm，發(fā)射波長為775 nm，摩爾吸光系數為4.14×105L·mol-1·cm-1； ICR的體外光聲成像造影效果遠大于吲哚菁綠(ICG)，在濃度為21.6 μmol·L-1時，ICR的光聲強度是ICG的52萬倍。

克酮酸; 2,3,3-三甲基-3H吲哚; 吲哚克酮酸; 合成; 光聲成像; 近紅外區(qū); 吲哚菁綠

光聲成像(Photoacoustic imaging， PAI)技術是21世紀興起并發(fā)展迅速的一種新型非入侵式生物醫(yī)學成像模式[1]，結合了光學成像和聲學成像的優(yōu)點，可得到深層組織高分辨率和高對比度的圖像，是目前臨床診斷的研究熱點之一。但人體許多組織都是強散射或強吸收介質，而光在強散射組織中的成像深度只能達到1 mm左右[2]，為了實現深部診斷，采用光聲造影劑對光聲成像信號進行增強是其中一個主要的發(fā)展趨勢[3-5]。但目前研究報道的造影劑較少，主要為基于金納米棒[6]的納米材料和有機功能染料吲哚菁綠(indocyanine green， ICG， Chart 1)。 ICG是目前唯一被FDA批準用于臨床的染料分子，但其在水溶液中不穩(wěn)定及光穩(wěn)定性較差，且在體內清除快[7]。因此開展新型光聲成像造影劑的研究意義重大。

Scheme 1

Chart 1

吲哚克酮酸(ICR)是克酮酸菁染料的一種，其最大吸收波長為755 nm，發(fā)射波長為775 nm，且吸收峰尖銳，摩爾吸光系數大[8]。相對于ICG的多甲川鏈，ICR引入了環(huán)狀的克酮酸結構，提高了分子的剛性和空間位阻,不利于單線態(tài)氧的進攻，因此，ICR較ICG更穩(wěn)定[9]。李忠玉[8,10]等進行了ICR三階非線性光學性質的研究，結果表明：ICR具有大的三階非線性極化率和快的非線性光學響應，在非線性光學材料方面有潛在的應用價值。Encinas等[11]提出了ICR可應用于光學傳感器上的pH敏感組件。Punzi[12]等研究了克酮酸染料作為分子材料在晶體管中的應用。但到目前為止，還沒有文獻報道ICR在生物醫(yī)學尤其是光聲成像方面應用的研究。

本文參考文獻[13]方法，以克酮酸和2,3,3-三甲基-3H吲哚為原料，經縮合反應合成了ICR(Scheme 1)，其結構經1H NMR和MS確證。利用小動物活體成像儀首次對其進行了體外光聲成像測試，并與ICG作了對比。結果表明：ICR比ICG有更好的成像效果，為光聲成像造影劑的研究提供了思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

自制毛細管熔點測定儀；SPD UV-3600型紫外分光光度計；Lumina型熒光光譜儀；Varian InovaA400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；Agilent1946B ESI-MS型質譜儀；iThera Medical型小動物活體成像儀。

胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；瓊脂粉，天津市科密歐化學試劑有限公司；20%脂肪乳注射液，華潤制藥有限公司；2,3,3-三甲基-3H吲哚，湖北巨勝科技有限公司；克酮酸，東京化成工業(yè)株式會社；甲苯、正丁醇、甲醇、二氯甲烷和二甲基亞砜，分析純；實驗用水為去離子水。

1.2 ICR的合成

在三口瓶中依次加入克酮酸0.10 g(0.70 mmol)， 2,3,3-三甲基-3H吲哚0.22 g(1.40 mmol)，甲苯15 mL和正丁醇45 mL，攪拌使其溶解；利用分水器除去反應生成的水，回流(110 ℃)反應6 h[TLC檢測，展開劑：環(huán)己烷/丙酮=3/1(V/V)]。減壓蒸除部分溶劑，殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑：V(二氯甲烷) ∶V(甲醇)=100 ∶1]純化得墨綠色固體ICR 0.13 g，收率43.9%；1H NMR(400 MHz)δ： 7.58(d,J=7.2 Hz, 2H), 7.51(d,J=7.1 Hz, 2H), 7.37(t,J=14.4 Hz, 2H), 7.23(t,J=14.0 Hz, 2H), 6.0(s, H), 5.97(s, H), 1.5(s, 12H)； MSm/z： 424.7{[M+H]+}。表征數據與文獻[13]報道一致。

1.3 光學性質測定

精密稱量ICR配制10 mmol·L-1DMSO溶液備用。用甲醇稀釋為1.25 μmol·L-1測定其紫外-近紅外吸收光譜及熒光發(fā)射光譜。

1.4 體外光聲成像測試

(1) 仿體模型的制備

取1.30 g瓊脂粉、20%脂肪乳注射液5 mL和去離子水94 mL加至250 mL燒杯中，加熱煮沸2 min；冷卻至50 ℃，沿壁倒入20 mL注射器中，在中心垂直放置一根塑料管(4 cm×3 mm)，使其浸沒長度為3 cm，冷卻后將塑料管緩慢取出，溶液備用。

(2) 溶液的配制

分別稱取ICR 11.4 mg和ICG 21.0 mg溶于適量甲醇中，分別用水、血清稀釋至10 mL，再精確移取1 mL稀釋至25 mL，制成濃度為0.108 mmol·L-1溶液備用。

(3) 體外光聲成像測試

取1.4(2)溶液分別稀釋為10.8, 21.6, 32.4, 43.2, 54.0, 64.8和75.6 μmol·L-1，分別以去離子水和血清為空白對照，各自取樣逐一放入仿體模型的孔洞中，再置于小動物活體成像儀中，以680～960 nm(以每5 nm的幅度增加)脈沖激光照射，采集信號，獲得光譜圖與數據。

2 結果與討論

2.1 光譜性質

ICR在甲醇中的的吸收光譜(A)與發(fā)射光譜(B)見圖1。由圖1可見，ICR在甲醇中最大吸收波長為755 nm，發(fā)射波長為775 nm，均與文獻[13]報道一致。Stokes shifts為20 nm；摩爾吸光系數為4.14×105L·mol-1·cm-1。表明ICR的最大吸收和發(fā)射均在近紅外區(qū)，且摩爾吸光系數較大。

2.2 體外成像效果

分別以水和血清為溶劑考察了ICG和ICR同一濃度溶液的光聲成像效果，結果見圖2。由圖2可見，在同等條件下，ICR比ICG有更強的顯影效果。在以血清為溶劑時，光聲成像信號強度略小于在水中的信號強度，可能是因為在血清中的溶解度偏低，使熒光強度減弱。

λ/nm

λ/nm

進一步考察了ICR與ICG以水為對照時不同濃度的光聲效果，結果見圖3。由圖3可以看出，隨著濃度增加，ICR與ICG的信號強度不斷增強，但ICR增加的幅度和成像效果優(yōu)于ICG。

以水為溶劑測定ICR與ICG的光聲成像結果，結果見表1。由表1可知，在相同濃度下ICR的光聲強度遠大于ICG，在濃度為21.6 μmol·L-1時，ICR的光聲強度是ICG的52萬倍。同時，根據表1中的濃度和光聲強度作圖，經計算可知，在21.6～75.6 μmol·L-1濃度范圍內，ICR的相關系數R為0.99， ICG的相關系數R為0.92，可見在此濃度范圍內ICR比ICG有更好的濃度相關性。

ICG(水為溶劑)

ICG(血清為溶劑)

ICR(水為溶劑)

ICR(血清為溶劑)

c/μmol·L-1PAamplitudeComp10．821．632．443．254．064．875．6ICR845．8563745．2371177．5883286．8390210．47103562．36107653．02ICG0．06800．12120．14430．16070．19070．23530．3553比值12439525951493261518275473049440129302992

圖3 不同濃度的ICR與ICG光聲成像效果圖*

3 結論

合成了吲哚克酮酸(ICR)，對其進行了結構確證和光學特性表征，并在相同條件下與ICG的體外光聲成像效果進行了對比。結果表明：在同一濃度下ICR的光聲成像強度遠遠大于ICG，有望成為新型光聲成像造影劑。

[1] Wang H N, Liu C B, Gong X J,etal.Invivophotoacoustic molecular imaging of breast carcinoma with folate receptor-targeted indocyanine green nanoprobes[J].Nanoscale,2014,6(23)：14270-14279.

[2] 張建英,謝文明,曾志平,等. 光聲成像技術的最新進展[J].中國光學,2011,2(4)：111-117.

[3] Gutrath B S, Beckmann M F, Buchkruner A,etal. Size-dependent multispectral photoacoustic response of solid and hollow gold nanoparticles[J].Nanotechnology,2012,23(22)：225707-225716.

[4] Ku G, Zhou M, Song S L,etal. Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm[J].ACS Nano,2012,6(8):7489-7496.

[5] Wang C, Ma X X, Ye S Q,etal. Protamine functionalized single-walled carbon nanotubes for stem cell labeling andinvivoraman/magnetic resonance/photoacoustictriple-modal imaging [J].Advanced Functional Materials, 2012,22(11)：2363-2375.

[6] Agarwal A, Huang S W, O’Donnell M,etal. Targted gold nanorod contrast agent for prostate cancer detection by photoacustic imaging[J].Journal of Applied Physics,2007,102(6):064701-064704.

[7] Wang Y W, Fu Y Y, Peng Q L,etal. Dye-enhanced grapheme oxide for photothermal therapy and photoacoustic imaing[J].Materials Chemistry B:Materials for Biology and Medicine,2013,1(42):5762-5767.

[8] 李忠玉,徐松,黃新,等. 一種近紅外光記錄與存儲材料——克酮酸染料的三階非線性光學性質[J].感光科學與光化學,2007,25(4):241-248.

[9] 楊松杰,田禾. 菁染料光穩(wěn)定性的研究進展 [J].感光科學與光化學,1999,17(3)：275-283．

[10] Li Z Y, Jin Z H, Kasatani K,etal. Resonat third-order optical nonlinearities of 1，3-bis[(3,3-dimethylindolin-2-ylidene)methyl]croconine[J].Physica B,2006,382(1):229-234.

[11] Encinas C, Otazo E, Rivera L,etal. Croconines:New acidochromic dyes for the near infrared region[J].Tetrahedron Letters,2002,43(46):8391-8393.

[12] Punzi A, Capozzi M A M, Fino V,etal. Croconaines as molecular materials for organic electronics:Synthesis,solid state structure and use in transistor devices[J].Journal of Materials Chemistry C,2016,4(15):3138-3142.

[13] 王蘇,李忠玉,趙寶麗,等. 基于吲哚克酮酸染料的Ag+比色/熒光識別探針[J].精細化工,2014,31(12):512-1516.

Synthesis and Preliminary Study of Indole Croconium as Photoacoustic Imaging Contrast Agent

LU Liang, GUO Li, HU Yue-fu, QI Qing-rong*

(West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Indole croconium(ICR) was synthesized by condensation reaction of croconic acid with 2,3,3- trimethylindolenine. The structure was confirmed by1H NMR and MS. The preliminary study of ICR as a photoacoustic imaging contrast agent was investigated. The results showed that ICR exhibited a sharp and strong absorption in the near infrared region, the maximum absorption wavelength was 755 nm and emission wavelength was 775 nm, and the molar absorption coefficient was 4.14×105L·mol-1·cm-1. The photoacoustic imaging effect of ICR was far better than that of the indocyanine green(ICG). Photoacoustic intensity of ICR was 520 000 times of that of ICG at the concentration of 21.6 μmol·L-1.

croconic acid; 2,3,3-trimethylindolenine; indole croconium; synthesis; photoacoustic imaging; near infrared region; indocyanine green

2016-12-13；

2017-02-22

重大新藥創(chuàng)制：石藥集團心腦血管藥物創(chuàng)新綜合平臺建設(2013ZX09402103-1)

魯亮(1991-)，男，漢族，湖北仙桃人，碩士研究生，主要從事藥物合成的研究。 E-mail: 840299792@qq.com

齊慶蓉，副教授， Tel. 028-85502157, E-mail: qiqinrong@scu.edu.cn

R914; O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16311