筋骨草和茯苓配伍合用抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用及初步機制研究

王晶晶，彭 博，賀 蓉，徐啟華，韓靖雅，李建榮

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116000 ；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

筋骨草和茯苓配伍合用抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移作用及初步機制研究

王晶晶1，彭 博2，賀 蓉2，徐啟華2，韓靖雅2，李建榮2

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116000 ；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700)

目的 研究筋骨草和茯苓聯(lián)合用藥對高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231(三陰型乳腺癌)和SK-BR-3(HER-2過表達(dá)乳腺癌)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及分子機制。方法 以筋骨草有效部位——總環(huán)烯醚萜類化合物和茯苓有效部位——三萜類化合物為研究對象。采用細(xì)胞黏附實驗、細(xì)胞劃痕和Transwell 侵襲實驗檢測細(xì)胞黏附、運動和侵襲能力。Western blot 法檢測上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)相關(guān)蛋白和MAPK通路蛋白表達(dá)。結(jié)果 筋骨草和茯苓合用對MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲能力有明顯的抑制作用，配伍比例為10 ∶1時具有較好的協(xié)同效應(yīng)。兩藥合用還可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞EMT，主要表現(xiàn)在上皮性標(biāo)志物β-catenin、E-cadherin、ZO-1表達(dá)增加，間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩藥合用明顯降低p-ERK1/2、p-JNK和p-p38的蛋白表達(dá)。結(jié)論 筋骨草和茯苓合用能有效地抑制高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231 和SK-BR-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，作用機制可能與其調(diào)控MAPK通路，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT有關(guān)。

乳腺癌；茯苓；筋骨草；腫瘤轉(zhuǎn)移；MAPK通路；侵襲

乳腺癌在中醫(yī)學(xué)中被稱為“乳巖”、“乳石癰”等，其發(fā)病率和死亡率位居女性惡性腫瘤之首[1]，目前臨床上有30～40%的乳腺癌復(fù)發(fā)并導(dǎo)致肺、骨、肝等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[2]。因此，防治和控制乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有積極重要的臨床意義。

“筋骨草-茯苓”藥對是根據(jù)中醫(yī)臨床經(jīng)驗，針對乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵核心病機是“熱毒內(nèi)蘊，痰毒流注”的觀點[3]，以清熱解毒、利濕化痰法組方用于預(yù)防和治療乳腺癌及其轉(zhuǎn)移的中藥復(fù)方。筋骨草是代表“清熱解毒”治則的中藥，性寒，味苦，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、涼血消腫的功效；郁仁存《中醫(yī)腫瘤學(xué)》中記載其常用于治療乳腺癌、乳腺炎和肺癌[3]。茯苓是代表“利濕化痰”治則使用頻率最高的一味中藥[4]，性甘、淡、平，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕的功效。臨床實踐證明，兩者配伍應(yīng)用能預(yù)防和延緩乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，提高患者的生存率和生存質(zhì)量[3]。文獻(xiàn)報道及本課題組前期體內(nèi)外實驗均證實，筋骨草和茯苓均有明顯的抑制腫瘤生長的作用，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分別為筋骨草總環(huán)烯醚萜類化合物(iridoids inAjugadecumbens，HBG)和茯苓三萜類化合物(triterpenes inPoriacocos，F(xiàn)L)[5-7]；兩藥合用明顯抑制小鼠乳腺癌4T1的侵襲和轉(zhuǎn)移。但是目前對于兩藥合用抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移是否具有協(xié)同效應(yīng)，作用特點及其機制尚不明確。

因此，本實驗通過研究HBG、 FL單用和聯(lián)合用藥對高轉(zhuǎn)移性乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，旨在探討兩藥合用抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用特點及其分子機制，為其潛在臨床應(yīng)用于乳腺癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試藥品 筋骨草總環(huán)烯醚萜提取物(HBG)，由本所制劑室提供，筋骨草全草水提取物經(jīng)大孔樹脂精制，減壓干燥后得筋骨草總環(huán)烯醚萜類提取物，以乙酰哈巴苷計，總環(huán)烯醚萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)為61.57%。茯苓三萜類提取物(FL)，茯苓藥材經(jīng)乙醇回流提取后得三萜類提取物，測定三萜類化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為>50%。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌 MDA-MB-231和SK-BR-3 購自北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，使用含10% FBS，0.1 U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基， 置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。

1.3 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和0.25%胰酶購自Gibco公司；人工基質(zhì)膠 matrigel購自BD公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒(K0202)購自南京凱基生物公司；BCA蛋白濃度試劑盒(QG219579)、ECL 高靈敏度化學(xué)發(fā)光試劑盒(NL181598)購自Thermo公司； Transwell小室購自 Corning公司；二甲基亞砜(2255C398)購自Amersco公司。本研究一抗：ERK1/2、p-JNK、ZO-1、Vimentin、β-catenin購自CST公司；p-ERK1/2、p-p38MAPK購自中杉金橋；JNK、E-cadherin購自碧云天；二抗：山羊抗小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記、山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記購自中杉金橋。 臺式高速離心機 (5415R) 購自Eppendorf 公司，CO2培養(yǎng)箱 (HERAcell 150i)購自Thermo公司；顯微鏡(IX71) 購自O(shè)lympus公司，IncuCyteTMZOOM長時程動態(tài)活細(xì)胞成像系統(tǒng)購自Essen Bioscience公司，多功能酶標(biāo)儀(Thermo Varioskan Flash)購自Thermo公司。

1.4 FL和HBG貯存液的配制 稱取100 mg FL或HBG藥物粉末，加入1 mL DMSO 溶解，即配成100 g·L-1的母液，4℃保存待用。實驗過程中按需要進(jìn)行稀釋。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞毒性 以每孔1×104個將人乳腺癌 MDA-MB-231、SK-BR-3細(xì)胞接種到96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度FL(終濃度分別為 2.5～20 mg·L-1)，不同濃度HBG(終濃度分別為5～200 mg·L-1)，不同濃度兩藥合用(HBG和FL配比分別為1 ∶1，5 ∶1和10 ∶1)，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔加MTT溶液至終濃度為0.5 g·L-1，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心棄去上清液，每孔加DMSO 200 μL，震蕩10 min，使紫色結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測570/650 nm處的吸光度(OD)，細(xì)胞增殖抑制率/%=(1-OD給藥/OD對照)×100%。

1.6 細(xì)胞黏附實驗 將matrigel膠按1 ∶30稀釋后包被96孔板，4 ℃過夜，PBS洗板3次。加入1% BSA室溫封閉2 h，PBS 洗板3次待用。以不同濃度FL(終濃度分別為2.5～20 mg·L-1)，不同濃度HBG(終濃度分別為25～200 mg·L-1)，不同濃度兩藥合用(HBG和FL配比比例分別為5 ∶1和10 ∶1)處理細(xì)胞。收集受試藥品處理24 h的乳腺癌細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以每孔5×104個細(xì)胞接種于matrigel包被的96孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，PBS洗去未黏附的細(xì)胞，甲醇固定后0.1%結(jié)晶紫染色5 min，水沖洗2～3遍，干燥照相后，每孔加入10%乙酸100 μL振蕩5～10 min，592 nm處測定OD值，計算細(xì)胞黏附抑制率/%=(1-OD給藥/OD對照)×100%。

1.7 劃痕實驗 對數(shù)生長期細(xì)胞按每孔5×104個細(xì)胞接種于96孔板，孵育24 h后，劃痕，PBS洗去掉落的細(xì)胞，更換無血清培養(yǎng)基，按“2.6”的給藥方法加入不同濃度的受試藥物。以IncuCyte ZOOM 2013B軟件動態(tài)觀測劃痕愈合情況，以相對劃痕密度作為評價指標(biāo)(Relative Wound Density, RWD)。

1.8 細(xì)胞侵襲力實驗 matrigel膠1 ∶8稀釋后包被8 μm Transwell小室，37 ℃孵育2 h成膠。將對數(shù)生長期MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，按每孔5×104個細(xì)胞/100 μL接種于Transwell上室，同時加入不同濃度的HBG、FL及兩藥合用(HBG和FL配比為10 ∶1)，下室加含10% FBS的培養(yǎng)基600 μL，培養(yǎng)24 h～48 h。用棉簽擦去上室細(xì)胞，穿膜細(xì)胞以5%戊二醛固定后0.1%結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡拍照。染色細(xì)胞用10%醋酸溶解，592 nm處測定OD值，計算細(xì)胞侵襲率/%=OD給藥/OD正?！?00%。

1.9 Western blot分析 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液400 μL冰上充分裂解15 min。14 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，收集上清液，采用BCA法測定蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，4 ℃、350 mA濕轉(zhuǎn)15 min，5% BSA室溫封閉1 h。分別用一抗(1 ∶1 000) 4 ℃孵育過夜；洗膜后，HRP標(biāo)記二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h， ECL Western blot 化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色檢測，以Actin、GAPDH為內(nèi)參。

1.11 相互作用結(jié)果判定 細(xì)胞增殖、黏附和遷移實驗采用中效法以Compusyn軟件計算HBG和FL兩藥合用的聯(lián)合用藥指數(shù)(combination index，CI)。根據(jù)Soriano等[8]的判斷方法，0.9≤CI≤1.1為相加作用，0.8≤CI<0.9為低度協(xié)同作用，0.6≤CI<0.8為中度協(xié)同作用，0.4≤CI<0.6為高度協(xié)同作用，0.2≤CI<0.4為強協(xié)同作用。細(xì)胞侵襲實驗采用金氏Q值法計算合用效應(yīng)，按照以下公式：Q=EA+B/(EA+EB-EA×EB)，其中EA+B代表兩藥合用的實際效應(yīng)值, EA代表A藥單用時的效應(yīng), EB代表B藥單用時的效應(yīng)。以Q<0.85為拮抗，0.85≤Q≤1.15為相加，Q>1.15為協(xié)同。

2 結(jié)果

2.1 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響 采用MTT法對HBG和FL單用及合用對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和SK-BR-3的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，HBG、FL單用及其合用對乳腺癌細(xì)胞均顯示不同程度的抑制細(xì)胞增殖的作用。參考藥物的IC50，選擇FL和HBG的濃度范圍為1/10 IC50-2 IC50，通過Compusyn軟件計算兩藥在不同濃度配比下作用于兩種乳腺癌細(xì)胞的聯(lián)合用藥指數(shù)(combination index，CI)，結(jié)果顯示，在Fa值為0.5時，HBG和FL按1 ∶1、5 ∶1和10 ∶1不同配比，抑制兩種乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞增殖作用的CI值分別為1.25/0.98(1 ∶1)、0.85/0.91(5 ∶1)、0.58/0.48(10 ∶1)。根據(jù)Soriano等的判斷方法，兩藥按5 ∶1配比合用達(dá)到低度協(xié)同作用；按10 ∶1配比合用達(dá)到高度協(xié)同作用。后續(xù)實驗根據(jù)以上結(jié)果選擇HBG單用的藥物濃度為25～200 mg·L-1；由于FL本身溶解性差，在濃度大于25 mg·L-1時表現(xiàn)為非特異性細(xì)胞毒性作用， FL單用的藥物濃度為2.5～20 mg·L-1；兩藥按5 ∶1配比合用的劑量為30～120 mg·L-1，按10 ∶1配比合用的劑量為27.5～220 mg·L-1，在此濃度下藥物對乳腺癌細(xì)胞增殖基本無影響。

2.2 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞黏附能力的影響 為明確HBG、FL及其合用是否對人乳腺癌細(xì)胞的黏附能力有抑制作用，采用細(xì)胞黏附實驗測定不同濃度HBG、FL單用及其合用對乳腺癌MDA-MB-231及SK-BR-3細(xì)胞的黏附能力的影響。結(jié)果顯示(Fig 1)，HBG、FL單用及其合用能明顯抑制兩種乳腺癌細(xì)胞的黏附能力，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。在本實驗選擇的給藥劑量下，黏附實驗中的效應(yīng)局限在50%以內(nèi)，在此條件下根據(jù)中效法計算兩藥聯(lián)合用藥指數(shù)CI值。在Fa值為0.4時， HBG和FL按5 ∶1和10 ∶1不同配比，抑制兩種乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞黏附作用的CI值分別為0.87/0.86(5 ∶1)和0.2/0.71(10 ∶1)。根據(jù)Soriano等的判斷方法，兩藥按5 ∶1配比合用達(dá)到相加作用；按10 ∶1配比合用在兩種細(xì)胞中分別達(dá)到強協(xié)同作用和中協(xié)同作用。

Fig 1 Effects of HBG, FL and their combination on breast cancer cell adhesion

MDA-MB-231 and SK-BR-3 cells were pretreated with different concentrations of HBG, FL and the combination for 24 h. 5×104cells/well were seeded on matrigel-precoated wells and incubated at 37 ℃ for 30 min. After washing, adherent cells were fixed with methanol and stained with 0.1% crystal violet(magnification ×100). The stain was eluted by 10% acetic acid, and the absorbance at 592 nm was measured.*P<0.05,**P<0.01vsHBG or FL only treated group.

Fig 2 Effects of HBG, FL and their combination on breast cancer cell migration using scratch motility assay

5×104cells were seeded into 96-well plate. After 24 h, a wound was scratched into confluent monolayer and cells were treated with various concentrations of HBG, FL and the combination in serum-free medium for 24 h. The relative wound density(RWD) was measured by Incucyte ZOOM.

兩者按10 ∶1固定比值配比，當(dāng)Fa值0.2～0.5時，對于MDA-MB-231細(xì)胞，CI值<1；且隨劑量的增加，效應(yīng)隨之增加，CI值為0.87～0.2，表現(xiàn)出從低協(xié)同作用變?yōu)閺妳f(xié)同作用的趨勢。對于SK-BR-3細(xì)胞，對應(yīng)的CI值<1; 且隨劑量的增加，效應(yīng)隨之增加，CI值為0.2～0.86，表現(xiàn)出從強協(xié)同作用變?yōu)榈蛥f(xié)同作用的趨勢。

2.3 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響 通過對人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行劃痕實驗可觀察到，對照組細(xì)胞在24 h后幾乎完全愈合，而經(jīng)HBG、FL及其合用處理過的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制(Fig 2)。通過Compusyn軟件計算兩藥在不同濃度配比下的CI值，在Fa值為0.5時， HBG和FL按5 ∶1和10∶1不同配比，抑制兩種乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞遷移作用的CI值分別為0.56(5 ∶1)和0.28(10 ∶1)。根據(jù)Soriano等的判斷方法，兩藥按5 ∶1配比合用達(dá)到高度協(xié)同作用；按10 ∶1配比合用達(dá)到強協(xié)同作用。

2.4 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 采用Transwell小室法對HBG、FL單用及合用對乳腺癌細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行研究。根據(jù)細(xì)胞黏附和遷移能力的實驗結(jié)果，細(xì)胞侵襲實驗中兩藥按10 ∶1配比合用。結(jié)果顯示(Fig 3)，HBG、FL單用及合用24～48 h后能明顯抑制乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR3細(xì)胞侵襲能力，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系。與同等劑量的HBG和FL單用相比，兩藥合用抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的能力明顯增強(P<0.05)。Q值評價結(jié)果顯示，合用劑量為110 mg·L-1時，MDA-MB-231細(xì)胞和SK-BR-3細(xì)胞的Q值分別為1.26和1.83，可見HBG和FL合用對抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲能力上所呈現(xiàn)的主要是協(xié)同作用。

2.5 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用，因此我們采用Western blot法檢測藥物對乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞EMT關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 4)，對于MDA-MB-231細(xì)胞，HBG、FL單用和合用均能不同程度的增加上皮性標(biāo)志物ZO-1、β-catenin和E-cadherin的表達(dá)，降低間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)，且作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性關(guān)系(不包括E-cadherin)；對于SK-BR-3細(xì)胞，兩藥合用能增加ZO-1、E-cadherin表達(dá)，降低Vimentin的表達(dá)。提示HBG和FL合用通過增加上皮性標(biāo)志蛋白表達(dá)，降低間質(zhì)性標(biāo)志蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)EMT作用，從而發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，且兩藥合用具有協(xié)同作用。

2.6 HBG、FL及其合用對人乳腺癌細(xì)胞中MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為了探究藥物抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用機制，我們進(jìn)一步測定HBG和FL單用及合用對MAPK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見Fig 5)，對于三陰型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，100 mg·L-1和200 mg·L-1HBG單用能明顯降低p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平，但是對于p-p38MAPK和p-JNK表達(dá)未見明顯影響；10 mg·L-1和20 mg·L-1FL單用能明顯降低p-ERK1/2和p-p38的蛋白表達(dá)水平，對p-JNK表達(dá)未見明顯影響；兩藥合用能明顯抑制p-ERK1/2和p-p38的蛋白表達(dá)，且有協(xié)同作用，對p-JNK表達(dá)未見明顯影響。對于HER2過表達(dá)型乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，HBG單用、FL單用以及兩藥合用均能不同程度的降低p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的蛋白表達(dá)水平；同HBG或FL單用相比，兩藥合用后抑制MAPK通路相應(yīng)蛋白表達(dá)的作用有明顯的協(xié)同效應(yīng)。

Fig 3 Effects of HBG, FL and their combination on breast cancer cell invasion

5×104cells in 0.1 mL serum-free conditional medium containing different concentrations of HBG, FL and the combination were seeded on the upper compartment of the matrigel-precoated chamber, 0.6 mL of medium with 10% FBS was added to the lower compartment. After incubation for 24～48 h, the cells on the lower surface of the filter were fixed in 5% glutaraldehyde and stained with 0.1% crystal violet(magnification×100). The dye was eluted with 10% acetic acid, the absorbance was measured at 592 nm.*P<0.05vsnon-drug treated control group；#P<0.05vsHBG/FL combination treated group.

Fig 4 Effects of HBG, FL and their combination on expressions of EMT markers in breast cancer cells by Western blot

MDA-MB-231 and SK-BR-3 cells were pretreated with different concentrations of HBG, FL and the combination for 24 h～48 h. Total proteins were extracted and used for Western blot. 50μg protein/ well was loaded. Primary antibodies(vimentin, ZO-1,β-catenin and E-cadherin)(1 ∶1 000) were incubated 4℃ overnight. HRP labeling secondary antibodies(1 ∶2 000) were incubated for 1 h at room temperature. actin was used as a loading control.

Fig 5 Effects of HBG, FL and their combination on expressions of MAPK markers in breast cancer cells by Western blot

MDA-MB-231 and SK-BR-3 cells were pretreated with different concentrations of HBG, FL and the combination for 24 h～48 h. Total proteins were extracted and used for Western blot. 50 μg protein/ well was loaded. Primary antibodies(p-ERK,p-ERK1/2;p-JNK,JNK;p-p38,p38)(1 ∶1 000) were incubated 4℃ overnight. HRP labeling secondary antibodies(1 ∶2 000) were incubated for 1 h at room temperature. GAPDH was used as a loading control.

3 討論

本研究根據(jù)乳腺癌中醫(yī)治療“清熱解毒，祛水利濕”的治則配伍組成“筋骨草-茯苓”組方。茯苓三萜是茯苓抗腫瘤作用的主要有效成分之一，對包括皮膚癌、肺癌、卵巢癌、直腸癌、膀胱癌、胰腺癌[6-7]、乳腺癌[9]和白血病[10]等多種腫瘤具有明顯的抑制作用。其作用機制可能與抑制DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成[10]；阻滯細(xì)胞周期[7]；通過線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[11-12]；抑制NF-κB 信號通路，從而降低基質(zhì)金屬蛋白酶的水平，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[9,13]有關(guān)。另外，長期的臨床應(yīng)用和體內(nèi)外實驗研究均證明筋骨草對肝癌、肺癌、皮膚癌和乳腺癌有抗腫瘤作用[14-17]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類化合物是其發(fā)揮抗乳腺癌及其轉(zhuǎn)移作用的主要有效成分，作用機制主要是調(diào)節(jié)MMPs-TIMPs平衡，抑制乳腺癌4T1細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移[5]。本研究結(jié)果也證實HBG和FL單用能不同程度的抑制乳腺癌MDA-MB-231和SK-BR-3細(xì)胞的黏附、運動和侵襲能力(Fig 1～3)，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性。HBG和FL按固定比例(1 ∶1、5 ∶1和10 ∶1)配伍合用對乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力有明顯的抑制作用，且作用明顯強于HBG或FL單用(P<0.05) ；并且通過中效法和金氏Q值法對合并用藥效果進(jìn)行分析評價，兩藥按5 ∶1和10 ∶1比例配比合用抑制乳腺癌細(xì)胞黏附、運動和侵襲的作用表現(xiàn)為相加或協(xié)同效應(yīng)，其中按10 ∶1配比合用顯示為高度協(xié)同作用?；谝陨辖Y(jié)果，我們進(jìn)一步對兩藥按10 ∶1配伍比例合用抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用機制進(jìn)行研究。

腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是乳腺癌轉(zhuǎn)移的主要原因，EMT是具有極性的細(xì)胞獲得自由移動于細(xì)胞基質(zhì)間的能力，從而使得腫瘤細(xì)胞獲得更強的移動和侵襲能力，穿過細(xì)胞外基質(zhì)及血管基底膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。此過程以上皮表型缺失和間質(zhì)表型獲得為主要特征[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，HBG、FL單用及其合用有明顯的逆轉(zhuǎn)EMT的作用，主要表現(xiàn)在上皮性標(biāo)志物ZO-1、β-catenin和E-cadherin表達(dá)增加，間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)降低。同HBG和FL單用相比，兩藥合用(10 ∶1)具有協(xié)同逆轉(zhuǎn)EMT的作用(Fig 4)。在本實驗中，通過Western blot法在SK-BR-3細(xì)胞中未檢測出β-catenin蛋白表達(dá)，與文獻(xiàn)報道結(jié)果相似[19-20]，可能與此細(xì)胞中β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)非常低[21]有關(guān)。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 通路是介導(dǎo)細(xì)胞外刺激到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞內(nèi)主要有3種激酶亞型：ERK1/2、JNK以及p38，參與腫瘤細(xì)胞的生長、增殖、凋亡、運動、黏附、EMT以及細(xì)胞外基質(zhì)降解等過程，在腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移中其重要的作用[22]。有研究報道，包括肺癌、卵巢癌、皮膚癌等的多種惡性腫瘤中均存在MAPK信號通路的異常表達(dá)[23-24]，其中ERK1/2和JNK被認(rèn)為可作為乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素[25]。因此本實驗對兩藥合用對MAPK信號通路的影響進(jìn)行分析，從而確定藥物抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBG和FL單用及合用對p-ERK1/2、p-p38和p-JNK的表達(dá)均有不同程度的抑制作用，并且兩藥合用具有協(xié)同效應(yīng)。提示，兩藥合用通過抑制MAPK信號通路的過度激活發(fā)揮協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞黏附、運動和侵襲能力的作用。此外，F(xiàn)ig 5結(jié)果也顯示，在兩種乳腺癌細(xì)胞中，HBG對p-p38表達(dá)未見明顯抑制作用，但是相同劑量下HBG與FL配伍合用后能明顯抑制p38 MAPK通路的過度激活，以上結(jié)果也體現(xiàn)了兩藥配伍合用的作用優(yōu)勢。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，對于三陰型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，HBG和FL單用及合用對p-JNK表達(dá)未見明顯影響；但相同給藥劑量下，對于HER-2過表達(dá)型乳腺癌SK-BR-3細(xì)胞，HBG和FL單用及合用能明顯抑制p-JNK表達(dá)。由此推測，HBG和FL合用對兩種不同分子亞型乳腺癌細(xì)胞MAPK通路的差異作用可能與兩種細(xì)胞的HER-2的差異表達(dá)有關(guān)，但是HER-2在介導(dǎo)兩藥合用抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用及其與MAPK通路的相互關(guān)系尚需要進(jìn)一步深入研究。

結(jié)合藥物對MAPK信號通路和EMT相關(guān)靶蛋白的影響，我們發(fā)現(xiàn)HBG和FL單用以及合用對ERK/p38 MAPK信號通路靶蛋白(p-ERK1/2和p-p38)的表達(dá)和對EMT相關(guān)標(biāo)志物(Vimentin、ZO-1、β-catenin和E-cadherin)的蛋白表達(dá)的影響趨勢和程度一致；此外，雖然兩藥合用對不同乳腺癌細(xì)胞均有明顯逆轉(zhuǎn)EMT，抑制細(xì)胞黏附、運動和侵襲的能力，但是在SK-BR-3細(xì)胞中明顯抑制p-JNK表達(dá)，在MDA-MB-231細(xì)胞中未見對p-JNK有明顯影響，推測HBG和FL兩藥合用逆轉(zhuǎn)EMT的作用可能與ERK/MAPK途徑和p38/MAPK途徑密切相關(guān)，但是對于MAPK通路3種亞型激酶在兩藥合用逆轉(zhuǎn)EMT中的作用需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，筋骨草總環(huán)烯醚萜和茯苓三萜兩藥合用可能通過抑制MAPK信號通路的激活，從而逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的黏附、運動和侵襲能力，最終發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用；并且同筋骨草總環(huán)烯醚萜和茯苓三萜單用相比，兩藥合用具有協(xié)同效應(yīng)。本研究提示筋骨草和茯苓合用在預(yù)防和治療乳腺癌轉(zhuǎn)移中的有效性，為“茯苓-筋骨草”藥對在乳腺癌治療中的應(yīng)用及潛在候選藥物的發(fā)現(xiàn)提供一定的實驗依據(jù)。

(致謝：本研究是在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所完成，在此衷心感謝實驗室彭博、賀蓉老師對課題設(shè)計、實驗操作和文章修改給予的支持和幫助。)

[1] Torre L A，Bray F，Siegel R L，et al. Global cancer statistics，2012[J].CACancerJClin，2015，65(2)：87-108.

[2] Eroles P，Bosch A，Perez-Fidalgo JA，et al. Molecular biology in breast cancer：intrinsic subtypes and signaling pathways[J].CancerTreatRev，2012,38：698-707.

[3] 郁仁存.中醫(yī)腫瘤學(xué)[M]. //北京：科學(xué)出版社，1983.

[3] Yu R C.TraditionalChinesemedicine(TCM)oncology[M].//Beijing：Science press，1983.

[4] 盧雯平, 姜翠紅.古方治療乳腺癌的用藥規(guī)律[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16:133-4.

[4] Ru W P，Jiang C H. Ancient medication rules for the treatment of breast cancer[J].ChinJExpeFormulChinMed，2010，16：133-4.

[5] 彭 博，賀 蓉，徐啟華,等.筋骨草提取物抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移與MMPs和TIMPs表達(dá)的關(guān)系研究[J].中國中醫(yī)藥雜志，2011，36(24)：3511-4.

[5] Peng B，He R，Xu Q H，et al.Correlation between antimetastatic action of Ajuga decumbens and expression of MMPs and TIMPs[J].ZhongguoZhongYaoZaZhi,2011，36(24)：3511-4.

[6] Ríos J L. Chemical constituents and pharmacological properties of Poria cocos [J].PlantaMed，2011，77(7):681-91.

[7] Jiang W G，Sanders A J，Katoh M，et al. Tissue invasion and metastasis: Molecular, biological and clinical perspectives[J].SeminCancerBiol，2015，35：S244-75.

[8] Soriano A F, Helfrich B, Chan D C,et al. Synergistic effects of new chemopreventive agents and conventional cytotoxic agents against human lung cancer cell lines[J].CancerRes, 1999,59(24):6178-84.

[9] Ling H，Zhang Y，Ng K Y，et al.Pachymic acid impairs breast cancer cell invasion by suppressing nuclear factor-κB-dependent matrix metalloproteinase-9 expression[J].BreastCancerResTreat，2011，126(3)：609-20.

[10]許 津，呂 丁，鐘啟平,等.茯苓素對小鼠L1210細(xì)胞的抑制作用[J],中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，1988，10(1):45-9.

[10]Xu J，Lyu D，Zhong Q P，et al. Poria cocos inhibiting effect on L1210 cell of mice[J].JChinAcadMedSci，1988，10(1)：45-9.

[11]Kikuchi T，Uchiyama E，Ukiya M，et al.Cytotoxic and apoptosis-inducing activities of triterpene acids from Poria cocos[J].JNatProd，2011，74(2)：137-44.

[12]Ma J，Liu J，Lu C，et al.Pachymic acid induces apoptosis via activating ROS-dependent JNK and ER stress pathways in lung cancer cells[J].CancerCellInt，2015，15：78.

[13]Cheng S，Eliaz I，Lin J，et al. Triterpenes from Poria cocos suppress growth and invasiveness of pancreatic cancer cells through the downregulation of MMP-7[J].IntJOncol，2013，42：1869-74.

[14]Takasaki M，Tokuda H，Nishino H，et al.Cancer chemopreventive agents(antitumor-promoters) from Ajuga decumbens[J].JNatProd，1999，62(7)：972-5.

[15]Konoshima T，Takasaki M，Tokuda H，et al.Cancer chemopreventiveactivity of an iridoid glycoside，8-acetylharpagide，from Ajuga decumbens[J].CancerLett，2000，157(1)：87-92.

[16]李 東，姜 淼.中藥白毛夏枯草水提液體外抗腫瘤研究[J].吉林中醫(yī)藥，2009，29(5)：434.

[16]Li D，Jiang M. Anti-tumor research of Traditional Chinese medicine(TCM)，Ajuga decumbens with watering extraction[J].JJilinTraditChinMed，2009，29(5)：434.

[17]曾茂貴，賈 銣，吳符火.筋骨草對小鼠S180肉瘤的抑瘤試驗[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2003，13(2)：30.

[17]Zeng M G，Jia R，Wu F H. Tumor suppression test of Ajuga decumbens for S180 sarcoma in mice[J].JFujianCollTraditChinMed，2003，13(2)：30.

[18]Yilmaz M，Christofori G.EMT，the cytoskeleton, and cancer cell invasion[J].CancerMetastasisRev，2009，28(1-2)：15-33.

[19]Schickling B M，England S K，Aykin-Burns N，et al. BKCa channel inhibitor modulates the tumorigenic ability of hormone-independent breast cancer cells via the Wnt pathway[J].OncolRep，2015，33:533-8.

[20]He B，You L，Uematsu K，et al. A monoclonal antibody against Wnt-1 induces apoptosis in human cancer cells[J].Neoplasia，2004，6:7-14.

[21]Pishvaian M J，F(xiàn)eltes C M，Thompson P，et al. Cadherin-11 is expressed in invasive breast cancer cell lines[J].CancerRes，1999，59(4)：947-52.

[22]Dhillon A S，Hagan S，Rath O，et al.MAP kinase signalling pathways in cancer[J].Oncogene，2007，26：3279-90.

[23]Kim E K，Choi E J. Compromised MAPK signaling in human diseases: an update[J].ArchToxicol，2015，89: 867-82.

[24]劉 虹,馬 艷,邵榮光. 磷酸化蛋白EBP50通過降低ERK1/2活性抑制乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖能力[J]. 中國藥理學(xué)通報,2015,31(1):55-9.

[24]Liu H, Ma Y, Shao R G. Phosphoprotein EBP50 suppresses proliferation of breast cancer by inhibiting activity of ERK1/2 in MCF-7 cell line [J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(1):55-9.

[25]吳向華，陸云飛，黃名威.ERK及JNK/MAPK通路在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31(14)：1841-3.

[25]Wu X H，Lu Y F，Huang M W. Expression and clinical significance in the recurrence of breast cancer in ERK and JNK/MAPK pathway[J].GuangdongMed，2010，31(14)：1841-3.

Preliminary research on effect of combination of Ajuga decumbens and Poria cocos on invasion and metastasis of breast cancer

WANG Jing-jing1，PENG Bo2，HE Rong2, XU Qi-hua2，HAN Jing-ya2，Li Jian-rong2

(1.SchoolofLifeSciences,LiaoningNormalUniversity,DalianLiaoning116000,China;2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100700,China)

Aim To investigate the effect of Ajuga decumbens(HBG), Poria cocos(FL) and their combination on the metastasis of invasive breast cancer cells and the related mechanisms.Methods We conducted several assays including cell adhesion assay, scratch assay and transwell invasion assay. Western blot analysis was employed to detect the expression of associated proteins of EMT and MAPK signaling pathway.Results FL,HBG and their combination could significantly inhibit the adhesion, migration and invasion of MDA-MB-231 and SK-BR-3 cells. HBG and FL had markedly synergistic effect, and the best compatibility ratio was 10 ∶1. HBG, FL and their combination could reverse EMT of breast cancer cells, which increased the levels of epithelial biomarkers, such as β-catenin, E-cadherin and ZO-1, and reduced the levels of mesenchymal biomarkers, such as vimentin. Moreover, treatment of the cells with HBG, FL and their combination resulted in marked inhibition of phosphorylation of ERK1/2, JNK and p38. Conclusions The combination of HBG and FL have the ability to inhibit breast cancer cell invasion by targeting the expression of MAPK pathway as well as suppressing the epithelial-to-mesenchymal transition.

breast cancer; iridoids in Ajuga decumbens; triterpenes in Poria cocos; metastasis; MAPK pathway; invasion

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1248.052.html

2016-12-10,

2017-01-15

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81302981，81374058);中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所基本科研業(yè)務(wù)費自主選題(No ZZ2014004，ZXKT15021)

王晶晶(1991-)，女，碩士生，研究方向：中藥腫瘤藥理學(xué)，E-mail：974333143@qq.com； 彭 博(1979-)，女，副研究員，研究方向：中藥腫瘤藥理學(xué)，E-mail：pumcpb@sina.com; 李建榮(1956-)，女，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)和毒理學(xué)，通訊作者，E-mail：jrongliem@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.026

A

1001-1978(2017)04-0581-08

R282.71；R289.1?；R329.24；R737.902.2；R977.6