哈巴苷對急性腦缺血及線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號通路的影響

樓燁亮，陳夢靜，王 可，龔雪媛，龔恒佩，鐘曉明，程汝濱，黃 真

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311401)

哈巴苷對急性腦缺血及線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號通路的影響

樓燁亮，陳夢靜，王 可，龔雪媛，龔恒佩，鐘曉明，程汝濱，黃 真

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 311401)

目的 探討哈巴苷對急性腦缺血及線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路的影響。方法 采用MCAO法建立小鼠急性腦缺血模型，造模后各組立即尾靜脈注射(iv)哈巴苷(4、8、12 mg·kg-1)、依達(dá)拉奉(3.2 mg·kg-1)，模型組及假手術(shù)組同法給予等量生理鹽水，0.1 mL·(10 g)-1。造模6h后，觀測小鼠神經(jīng)功能評分、腦梗死體積及腦組織形態(tài)病理學(xué)變化；采用Western blot法測定各組腦組織線粒體中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3的含量。結(jié)果 造模6 h后，哈巴苷各劑量組均能明顯降低因缺血而增加的小鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積(P<0.01，P<0.05)；均能不同程度減輕腦組織神經(jīng)元核固縮、核溶解程度，改善腦組織因缺血造成的病理損傷；能明顯上調(diào)腦組織線粒體中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3的表達(dá)。結(jié)論 哈巴苷對急性腦缺血具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用可能與抑制線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號通路相關(guān)。

哈巴苷；急性腦缺血；線粒體；caspase依賴性細(xì)胞凋亡；細(xì)胞色素C；pro-caspase-3

腦缺血(cerebral ischemia)是指腦內(nèi)血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致大腦區(qū)域性的缺血缺氧[1]。據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示，2012年全球因卒中死亡總?cè)藬?shù)約670萬；據(jù)2015年10月25日中國卒中協(xié)會發(fā)布的中國卒中流行報告顯示，目前我國每年死于腦卒中的患者約130萬，新發(fā)卒中患者270萬，腦卒中已成為我國居民死亡的首要原因。目前，線粒體介導(dǎo)的凋亡通路在腦缺血的研究中日益受到重視，本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)玄參中的主要活性成分哈巴苷可通過增加線粒體內(nèi)SOD和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性、下調(diào)缺血區(qū)capase-3陽性細(xì)胞的表達(dá)從而發(fā)揮一定的抗腦缺血作用[2-3]。本研究通過建立急性腦缺血模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)，旨在探討哈巴苷對急性腦缺血的保護(hù)作用及其對線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞凋亡信號通路的影響，為臨床應(yīng)用哈巴苷治療急性腦缺血疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物 ICR小鼠，SPF級，♂，體質(zhì)量23～25 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(滬)：2013-2016。飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度45%～70 %，晝夜周期12 h/12 h，喂以普通飼料，自由飲水。

1.2 藥物及試劑 哈巴苷(批號：15030621，上海同田生物技術(shù)股份有限公司)；依達(dá)拉奉(批號：86-141106，南京先聲東元制藥有限公司)；氯化三苯基四氮唑(TTC)(批號：2191C072，美國Amresco公司)；線粒體蛋白提取試劑盒(批號：20151228，凱基生物技術(shù)股份有限公司)；BCA蛋白定量檢測試劑盒(批號：10121，北京康為生物科技有限公司)；5×蛋白上樣緩沖液(批號：LMYG 15502，杭州諾森德生物技術(shù)有限公司)；預(yù)染蛋白Marker(批號：00135995，美國賽默飛世爾科技有限公司)；Cyt C兔抗人單克隆抗體，caspase-3兔抗人單克隆抗體稀釋液，兔抗GADPH抗體(批號：4272S-0006，9662S-0017，5174P-0004，美國CST公司)；β-actin單克隆抗體(批號：3700S-10，美國Abcam公司)；山羊抗兔熒光二抗，山羊抗鼠熒光二抗(批號：C50113-05，C50331-05，美國LI-COR公司)。

1.3 儀器 HM560型冷凍切片機(jī)(美國賽默飛世爾科技有限公司)；Nikon SMZ745正置生物顯微鏡(日本尼康公司)；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；Power Wave X340型酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司)； VE180 微型垂直電泳槽，VE186 轉(zhuǎn)移電泳槽，EPS600 電泳儀(上海天能科技有限公司)；0.22μm PVDF膜(批號：PR03259，美國Millipore公司)；Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥 實驗前小鼠禁食不禁水12 h，按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉3.2 mg·kg-1組及哈巴苷4、8、12 mg·kg-1組。4 %水合氯醛麻醉[(0.1 ml·(10 g)-1，腹腔注射]，參考改進(jìn)的Zea Longa法[4]建立小鼠MCAO模型。各組小鼠造模后立即經(jīng)尾靜脈注射給予相應(yīng)藥物[0.1 ml·(10 g)-1]，假手術(shù)組及模型組同法給予等量生理鹽水。

2.2 神經(jīng)功能評分 參照Bederson[5-6]確立的5級評分法，造模6 h后，對小鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評分。評分在1～3級者定為造模成功小鼠，0級和4級者棄去。

2.3 腦梗死體積測定 造模6 h后，迅速斷頭取腦，去掉嗅球、小腦及低位腦干，腦組織于-20 ℃迅速冷凍15 min后行冠狀切面，利用小鼠腦切片模具切片(2 mm/片，共5片)。將切片置于5 mL含有2% TTC的磷酸緩沖溶液中，37 ℃避光溫孵15 min，染色期間翻面。染色后4%多聚甲醛避光固定，立即用數(shù)碼相機(jī)拍照，采用Image J 1.48U系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析，計算腦梗死體積。

2.4 腦組織病理形態(tài)學(xué)觀察 造模6 h后，迅速斷頭取腦，小鼠經(jīng)心臟灌流生理鹽水繼以4 %多聚甲醛后取腦，4 %多聚甲醛4 ℃固定12 h后，置20 %蔗糖溶液脫水，標(biāo)本沉底后轉(zhuǎn)移到30 %蔗糖溶液中，標(biāo)本脫水后行冰凍切片機(jī)切片，片厚8 μm，行常規(guī)蘇木精-伊紅染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察腦組織病理形態(tài)學(xué)變化。每張切片隨機(jī)選擇3個400倍鏡視野對形態(tài)完整的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行分析。

2.5 Western blot法檢測線粒體中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3的蛋白表達(dá) 造模6 h后，各組小鼠脫頸處死，立即于冰上取大腦，仔細(xì)分離左側(cè)大腦皮層及海馬組織，按線粒體蛋白提取試劑盒說明書分別制備線粒體蛋白提取液及胞質(zhì)蛋白提取液。按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量蛋白并以PBS調(diào)整蛋白濃度一致，加入5×上樣緩沖液(蛋白液：5×上樣緩沖液=4 ∶1)后100 ℃變性10 min，室溫冷卻后，4 ℃保存，備用。每泳道以30 μg蛋白上樣，Cyt C及pro-caspase-3分別經(jīng)12 %及10 % SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Cyt C以GAPDH為內(nèi)參照，pro-caspase-3以β-actin為內(nèi)參照)，待目的蛋白電泳至距膠上側(cè)2/3位置時停止電泳。100 V、轉(zhuǎn)膜時間110 min，將蛋白從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜上。5 %BSA封閉2 h后，TBST 緩沖液漂洗膜3次，5 min/次。分別加入Cyt C兔抗人單克隆抗體稀釋液(1 ∶1 000)、caspase-3兔抗人單克隆抗體稀釋液(1 ∶1 000)，4 ℃過夜。 回收一抗后，TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，5 min/次；加入兔二抗，于搖床上室溫孵育2 h后，TBST 緩沖液漂洗膜3次，5 min/次，應(yīng)用Odyssey熒光掃描成像系統(tǒng)對蛋白結(jié)果進(jìn)行分析。以目的蛋白的灰度值與對應(yīng)的內(nèi)參蛋白 GAPDH或β-actin的灰度值的比值作為該樣品中目的蛋白的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 哈巴苷對MCAO小鼠神經(jīng)功能評分的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠神經(jīng)功能評分為1～3級，表明造模成功；與模型組相比，哈巴苷4、8 mg·kg-1劑量組小鼠神經(jīng)功能評分明顯降低(P<0.05，P<0.01)(Fig 1)。

3.2 哈巴苷對MCAO小鼠腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦梗死體積呈明顯升高(P<0.01)，表明造模成功。與模型組相比，哈巴苷各劑量組小鼠腦梗死體積均呈明顯降低(P<0.05，P<0.01)(Fig 1，Tab 1)。

Fig 1 Effect of harpagide on volume of cerebral ischemia in MCAO mice

A： Contol； B： Model； C： Edaravone 3.2 mg·kg-1；D: Harpagide 4 mg·kg-1； E： Harpagide 8 mg·kg-1; F: Harpagide 12 mg·kg-1

3.3 哈巴苷對MCAO小鼠大腦皮層病理組織學(xué)的影響 假手術(shù)組腦組織神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核仁明顯可見，未見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死及炎細(xì)胞浸潤等明顯病理變化。模型組腦組織神經(jīng)元結(jié)構(gòu)模糊、構(gòu)型紊亂，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核體不規(guī)則。哈巴苷各劑量組與模型組相比均有不同程度的緩解恢復(fù)，其中哈巴苷8 mg·kg-1劑量組腦組織神經(jīng)元核固縮、核體不規(guī)則程度與模型組相比有明顯的減輕，軟化灶明顯減少。定量分析形態(tài)完整的大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)。與模型組相比，哈巴苷各劑量組大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)均明顯增加(P<0.01，P<0.05)(Fig 2，Tab 1)。

Fig 2 Effect of harpagide on pathological changes of cerebral tissue in MCAO mice(HE staining，× 400)

A： Control； B： Model； C： Edaravone 3.2 mg·kg-1；D： Harpagide 4 mg·kg-1； E： Harpagide 8 mg·kg-1; F: Harpagide 12 mg·kg-1

Tab 1 Effects of harpagide on neurological severity scores,volume of cerebral ischemia and number of nerve cells in MCAO mice(±s，n=10 )

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel.

3.4 哈巴苷對MCAO小鼠腦組織線粒體中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3的蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織線粒體中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3蛋白表達(dá)均呈明顯下調(diào)；與模型組相比，哈巴苷8、12 mg·kg-1劑量組可明顯上調(diào)腦組織中Cyt C及胞質(zhì)中pro-caspase-3的蛋白表達(dá)(P<0.05，P<0.01)(Fig 3，4，Tab 2)。

Fig 3 Effects of harpagide on contents of Cyt C in mitochondrion

A： Control； B: Model； C： Edaravone 3.2 mg·kg-1； D： Harpagide 4 mg·kg-1； E： Harpagide 8 mg·kg-1； F：Harpagide 12 mg·kg-1

Fig 4 Effects of harpagide on contents of pro-caspase-3 in endochylema

A： Control； B： Model； C： Edaravone 3.2 mg·kg-1； D： Harpagide 4 mg·kg-1； E： Harpagide 8 mg·kg-1； F： Harpagide 12 mg·kg-1

Tab 2 Effects of harpagide on contents of cytochrome C (Cyt C) in mitochondrion and pro-caspase-3 in endochylema(±s，n=6)

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

4 討論

缺血性腦血管疾病占腦血管疾病的80%～85%，其發(fā)病率高、致殘率高，嚴(yán)重影響到中老年人的身體健康與生活質(zhì)量。大腦中動脈是人類卒中的多發(fā)部位，因此MCAO模型已成為研究腦缺血模型發(fā)病機(jī)理和治療藥物的主要模型之一[7]。本文通過建立MCAO模型研究哈巴苷對急性腦缺血的影響，結(jié)果表明，哈巴苷可明顯降低MCAO小鼠神經(jīng)功能評分及腦梗死體積；各劑量組能不同程度減輕MCAO小鼠大腦神經(jīng)細(xì)胞的損傷，進(jìn)而發(fā)揮一定的抗腦缺血作用。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血疾病造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要機(jī)制，其通路主要包括線粒體、死亡受體通路等?；谏窠?jīng)細(xì)胞凋亡與腦缺血損傷關(guān)系的深入研究，抗凋亡治療已成為治療腦缺血疾病的重要途徑[8]。細(xì)胞凋亡主要通過內(nèi)源性的線粒體凋亡、外源性的死亡受體信號途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑實現(xiàn)。內(nèi)源性的線粒體凋亡途徑又包括caspase依賴性及caspase非依賴性細(xì)胞凋亡[9-11]。線粒體介導(dǎo)的caspase依賴性細(xì)胞凋亡主要為線粒體功能受損，使Cyt C釋放入胞質(zhì)中，并與細(xì)胞凋亡激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，活化caspase-9前體，進(jìn)而激發(fā)caspase-3，引起細(xì)胞凋亡，其中Cyt C與caspase-3在此過程中發(fā)揮了重要作用[12-13]。因此，本研究選擇上游線粒體中的Cyt C及下游胞質(zhì)中的pro-caspase-3作為評價神經(jīng)細(xì)胞凋亡及哈巴苷抗急性腦缺血作用的指標(biāo)[14-15]，研究結(jié)果顯示，哈巴苷能減少腦缺血小鼠腦組織線粒體Cyt C的釋放，并減少胞質(zhì)中pro-caspase-3的活化，改善由缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，表明哈巴苷能通過抑制Caspase依賴性細(xì)胞凋亡，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腦缺血作用。

綜上所述，本研究建立MCAO模型后立即iv給藥治療，符合發(fā)病特點和臨床治療原則，在一定程度上體現(xiàn)藥物治療效果。結(jié)果表明哈巴苷可通過減少腦缺血小鼠腦組織線粒體Cyt C的釋放，抑制pro-caspase-3的活化，降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，通過抑制線粒體介導(dǎo)的Caspase依賴性細(xì)胞凋亡途徑進(jìn)而發(fā)揮抗腦缺血作用。

(致謝:本文的實驗地點：浙江省杭州市浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源研究所，非常感謝鐘曉明及黃真教授在實驗過程中所給予的指導(dǎo)，以及陳夢靜、王可、龔雪媛、龔恒佩、程汝濱在實驗過程中所給予的幫助。)

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Effects of harpagide on cerebral ischemia and mitochondria mediated Caspase dependent apoptotic signaling pathway in mice

LOU Ye-liang, CHEN Meng-jing, WANG Ke, GONG Xue-yuan, GONG Heng-pei,ZHONG Xiao-ming, CHENG Ru-bin, HUANG Zhen

(ZhejiangChineseMedicalUniversity,CollegeofPharmacy,Hangzhou311401,China)

Aim To investigate the effects of harpagide on cerebral ischemia and the mitochondria mediated Caspase dependent apoptotic signaling pathway in mice. Methods The MCAO was employed to establish MCAO model. When the models were established, the mice were given harpagide (4, 8, 12 mg·kg-1) and edaravone (3.2 mg·kg-1) [0.1 ml·(10 g)-1] by tail vein injection after MCAO immediately. And the model and control mice were given equivalent normal saline by the same way. After MCAO for 6 h, the behavior, volume of cerebral ischemia and pathological changes in the brain were observed. Westernblot was employed to determine the contents of Cyt C in mitochondrion and pro-caspase-3 in endochylema. Results Compared with the model group, harpagide (4, 8, 12 mg·kg-1) could significantly decrease the increased nerve functional score, brain index, brain water content and volume of cerebral ischemia induced by cerebral ischemia. Harpagide (4, 8, 12 mg·kg-1) could reduce the contents of Cyt C in mitochondrion and pro-caspase-3 in endochylema. Conclusion Harpagide may have protective effect on the cerebral ischemia injury in mice, which might be related to the inhibition of the cerebral mitochondria mediated Caspase dependent apoptotic signaling pathway.

harpagide; cerebral ischemia; mitochondrion; Caspase dependent apoptosis; Cytochrome C; pro-caspase-3

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.044.html

2016-10-26，

2016-12-30

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81573643)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No LY15H280004)

樓燁亮(1992-)，男，碩士生，研究方向：中藥品質(zhì)評價與資源開發(fā)利用， E-mail：carllouye@sina.com； 黃 真(1963-)，男，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥品質(zhì)評價與資源開發(fā)利用，通訊作者， E-mail：huangzhen@zcmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.022

A

1001-1978(2017)04-0563-05

R-332；R284.1；R322.81；R329.25；R743.310.22