嗎啡誘導的大鼠條件性位置偏愛模型中關鍵腦區(qū)PEBP及ERK活性的變化

邊佳明，吳 寧，李 錦

(1.陸軍總醫(yī)院藥理科，北京 100700；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

嗎啡誘導的大鼠條件性位置偏愛模型中關鍵腦區(qū)PEBP及ERK活性的變化

邊佳明1，吳 寧2，李 錦2

(1.陸軍總醫(yī)院藥理科，北京 100700；2.軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所，北京 100850)

目的 研究大鼠阿片精神依賴狀態(tài)下，相關腦區(qū)磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)及ERK活性的變化。方法 建立條件性位置偏愛(CPP)模型模擬嗎啡精神依賴的不同階段，觀察依賴相關重要腦區(qū)在大鼠CPP形成、熄滅及重建時PEBP表達和ERK活性的變化。結果 海馬、前額葉皮層、紋狀體、伏隔核等4個腦區(qū)，CPP各階段均未見PEBP表達水平有明顯變化；但在CPP形成時，前額葉皮層的ERK活性明顯升高，而CPP重建后，海馬的ERK活性明顯降低。結論 嗎啡成癮不同階段，藥效-環(huán)境關聯(lián)性記憶的形成和喚起涉及不同神經通路，ERK活性在其中十分關鍵，但PEBP可能并未參與ERK活性調節(jié)。

磷脂酰乙醇胺結合蛋白； ERK； 嗎啡； 成癮； 條件性位置偏愛； 阿片依賴

磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein，PEPB)結構上高度保守，分子量23 ku，研究發(fā)現(xiàn)其具有調節(jié)ERK、NF-κB、GPCR等多個信號通路的功能[1]。嗎啡通過GPCR調節(jié)細胞信號傳導，繼而影響整個神經通路，產生獎賞效應，但持續(xù)錯誤的獎賞導致軀體和精神雙重依賴。研究已證實ERK活性調節(jié)在阿片依賴過程中扮演了十分重要的角色，在依賴不同階段，不同腦區(qū)，ERK活性變化不完全相同[2]。本研究通過嗎啡誘導的條件位置偏愛(conditioned place preference，CPP)模型，觀察依賴相關腦區(qū)在關聯(lián)性記憶不同階段，PEBP表達以及ERK活性變化，探討阿片依賴過程中PEBP和ERK之間可能存在的調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SD大鼠(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，二級動物，動物合格證編號：SCXK-[(軍)2007-004]，♂，160 g～180 g，6只/籠，自由攝食飲水，室溫控制18 ℃～24 ℃，日光燈照明，每12 h晝夜交替。

1.2 主要試劑 鹽酸嗎啡(青海制藥廠，批號：910907，中國)；兔抗PEBP 單克隆抗體(Abcam，ab76582，lot.658640，英國)；小鼠抗pERK單克隆抗體(Santa Cruz，sc-7383，lot. I1009，美國)；兔抗ERK2多克隆抗體(Santa Cruz，sc-154，lot.I0408，美國)；小鼠beta-actin單克隆抗體(北京中杉金橋，TA-09，lot.091016)；羊抗小鼠HRP-二抗(北京中杉金橋，中國)；羊抗兔HRP-二抗(北京中杉金橋，中國)。

1.3 主要儀器 動物行為分析系統(tǒng)(寧波·安來，行為分析軟件：Anilab 2.2，中國)；EPS601型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Amersham，美國)；DYCZ-24D垂直電泳槽，DYCP-40C石墨半干轉移槽(北京六一儀器廠，中國)；EnVision2104多功能酶標儀 (Perkin Elmer，美國)；5810R 型低溫高速離心機(Eppendorf，美國)；凝膠成像分析儀(Alpha，美國)；VCX-130超聲破碎儀(Sonics，美國)。

1.4 實驗方法

1.4.1 條件性位置偏愛模型的建立 所用裝置設計與許月芳等[3]相同，但箱體更大，黑、白箱(40×40×65) cm3，中間箱(40×15×65) cm3。訓練方式(Fig 1)：d 1、2為動物適應期，d 3、4上午9:00開始前測(initial test)，時間15 min，根據(jù)自然偏愛結果(2次前測平均值)，采用抗衡設計分為嗎啡組和鹽水對照組，使偏愛白箱的大鼠用黑箱伴藥訓練，偏愛黑箱的大鼠用白箱伴藥訓練，最終使嗎啡組和鹽水對照組均為一半伴白箱訓練，一半伴黑箱訓練。每天訓練1輪，每輪上下午各注射1次(嗎啡10 mg·kg-1s.c.，或生理鹽水s.c.)，每次訓練45 min，共8輪。d 13為測試期，打開通道，動物放入中間箱任其自由穿梭，記錄15 min內在伴藥側停留時間，測試CPP形成。熄滅：飼養(yǎng)條件不變，每周1次將動物放進中間箱，打開通道，任其自由穿梭15 min并記錄，連續(xù)2 d的測試結果陰性認為CPP完全熄滅。重建：熄滅后的兩組動物給予嗎啡(2.5 mg·kg-1)后立即放入中間箱，測試15 min，檢測CPP是否被誘導重建。

Fig 1 CPP experimental flow

1.4.2 樣品制備 取材：分別在CPP形成測試后、完全熄滅測試后、重建測試后2 h內取材。大鼠斷頭，剝離大腦，冰的生理鹽水中略漂洗，冰上分離海馬(Hip)、前額葉皮層(PFC)、伏隔核(NAc)和紋狀體(Str)，取材后立即-70℃保存待用。樣品制備：每100 mg濕重組織加1 mL裂解液(Tris，50 mmol·L-1；NaCl，150 mmol·L-1；EDTA，1 mmol·L-1；EGTA，1 mmol·L-1；NP40，1 g·L-1；Aprotinin，1 mg·L-1； Pepstatin，1 mg·L-1；Leupeptin，1 mg·L-1；PMSF，1 mmol·L-1；DTT，1 mmol·L-1；NaF，1 mmol·L-1；Na3VO4，1 mmol·L-1；pH=8.0)，冰上超聲破碎勻漿，裂解20 min，4℃，12 000 r·min-1，20 min離心，取上清，-70℃保存。

1.4.3 蛋白免疫印跡 蛋白濃度統(tǒng)一調至2.5 g·L-1，取40 μg總蛋白用12%的變性電泳聚丙烯酰胺凝膠分離，具體操作參照文獻[4]進行。

2 結果

2.1 嗎啡誘導的大鼠CPP 8輪訓練后的測試結果顯示(Fig 2A)：與前測比較，嗎啡組在伴藥側停留時間明顯延長，鹽水對照組動物則無差異，表明嗎啡成功誘導了大鼠CPP形成，而不具備獎賞效應的生理鹽水不能引起大鼠位置偏愛或偏惡。3周自然熄滅后的測試結果(Fig 2B)顯示：與前測比較，嗎啡組和鹽水對照組在伴藥側停留的時間差異均無顯著性，表明CPP已經完全熄滅。CPP效應熄滅后，立即注射嗎啡誘導CPP重建，結果顯示(Fig 2C)：嗎啡組大鼠在伴藥側的停留時間與前測比較明顯延長，而注射嗎啡的鹽水對照組與前測比較無統(tǒng)計學差異，表明2.5 mg·kg-1嗎啡成功喚起了大鼠將非條件性刺激(注射嗎啡)與試驗箱可辨別線索的關聯(lián)記憶。

Fig 2A The residence time in drug-pairing box on CPP formation(n=24)**P<0.01 vs control

Fig 2B The residence time in drug-pairing box on CPP extinction(n=16)

2.2 CPP不同階段依賴相關腦區(qū)PEBP表達分析 蛋白免疫印跡分析結果顯示，在大鼠CPP的3個不同階段，與對照組比較，海馬、前額葉皮層、伏隔核、紋狀體4個腦區(qū)均未見PEBP表達明顯變化(Fig 3A、B、C)。

2.3 CPP不同階段依賴相關腦區(qū)ERK活性分析 蛋白免疫印跡分析結果顯示，CPP形成后，前額葉皮層pERK水平較對照組明顯升高(1.6倍)，其他腦區(qū)未見ERK活性明顯變化；CPP熄滅后，與對照組比較，4個腦區(qū)均未見ERK活性明顯變化；CPP重建后，海馬pERK水平較對照組明顯降低(0.6倍)，其他腦區(qū)未見ERK活性明顯改變(Fig 4A、B、C)。

Fig 2C The residence time in drug-pairing box on CPP reinstatement(n=8)*P<0.05 vs control

Fig 3A PECP expression in different brain regions on CPP formation(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group

3 討論

我們前期在嗎啡慢性處理模型上的研究顯示，PEBP在嗎啡遞增給藥誘導的大鼠依賴模型上出現(xiàn)表達升高的現(xiàn)象，用反義核酸下調海馬PEBP表達可導致嗎啡依賴加重，提示PEBP參與了阿片依賴的病理過程[5]。但這一模型不能用于評價依賴過程中關聯(lián)性記憶的形成，因此我們采用CPP模型進一步評價阿片精神依賴中關聯(lián)性記憶的形成、消退以及重新喚起對PEBP的影響。另外，ERK活性調節(jié)在依賴形成過程中具有不可或缺的作用[6]，PEBP已被證實為ERK的內源性抑制蛋白[7]，因此同時研究PEBP和ERK在成癮不同階段相關重要腦區(qū)的變化具有重要意義。

Fig 3B PECP expression in different brain regions on CPP extinction(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group

Fig 3C PECP expression in different brain regions when CPP reinstatement(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group

CPP模型是利用條件性線索研究關聯(lián)性學習記憶的一種動物模型，通過一段時間將條件性線索與藥物效應(非條件刺激)關聯(lián)的訓練，使這種條件線索能夠誘發(fā)動物對非條件刺激的記憶[8]。本實驗采用完全抗衡設計，將所有受試動物的自然偏性均衡分配，并設生理鹽水組做同步對照。在訓練周期安排上，也充分考慮訓練次序、箱號、時間的影響，做出相應的均衡設計，盡可能排除因實驗設計不合理和實驗裝置的個體差異對結果造成的影響。訓練8輪后的測試表明大鼠形成CPP，窗口大約100 s左右。3周后該關聯(lián)性記憶已經消退，再用小劑量嗎啡注射誘導則可重建原有關聯(lián)記憶。整個實驗過程中，生理鹽水對照組大鼠在CPP形成、熄滅和重建的不同階段其平均伴藥箱停留時間都穩(wěn)定在200～250 s左右，且兩組動物的體質量在整個實驗過程中同等程度和趨勢增加，狀態(tài)無異常，表明CPP實驗條件非常穩(wěn)定，實驗結果可信賴。

Fig 4A Acticity of ERK in different brain regions on CPP formation(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group,*P<0.05vscontrol

Fig 4B Acticity of ERK in different brain regions on CPP extinction(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group

Fig 4C Acticity of ERK in different brain regions on CPP reinstatement(n=8)

C，Con：saline control group；M，Mor：morphine group,*P<0.05vscontrol

與前期嗎啡慢性處理模型上觀察到的結果不同，在CPP模型上沒有檢測到PEBP表達的變化，這可能與兩個模型中嗎啡給藥劑量和方式密切相關。前者采用遞增給藥的方式，即從d 1至d 8按照10、20、20、30、30、40、40、50 mg·kg-1遞增給藥，每日皮下注射3次。與CPP訓練采用的劑量相比，軀體依賴模型中每只大鼠的總給藥劑量比CPP大鼠高9倍，且藥物的蓄積更加嚴重，所產生的生理效應以及在最終生化指標的反映上兩者可能會不同。此外，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PEBP在海馬的升高程度與嗎啡攝入量相關，因此在CPP模型中未觀察到PEBP表達變化或可從給藥劑量上予以部分解釋。

記憶需要蛋白質的合成，ERK作為一種重要的轉錄激活因子，其激活在長時程記憶中是必要條件，因此在成癮性藥物相關的記憶中有重要作用[9]。大腦皮層是信號整合的高級中樞，我們推測前額葉皮層發(fā)生的ERK活性升高是訓練伴隨產生的記憶而導致的。目前對原有關聯(lián)性記憶喚起的機制知之甚少，但比較一致的觀點認為海馬對于環(huán)境關聯(lián)性記憶的喚起至關重要[10]。急性給予嗎啡不會造成海馬ERK活性的變化[11]，但這里檢測到CPP效應重建后海馬ERK活性的明顯降低，提示海馬腦區(qū)出現(xiàn)的ERK活性降低與關聯(lián)性記憶的喚起有關。海馬接受隔區(qū)的GABA能傳入，這些GABA能神經末梢共同構成對海馬錐體細胞、齒狀回顆粒細胞的調控，負性調控的結果導致鈣電流受到抑制，從而可能導致ERK活性降低。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)PEBP在關聯(lián)性學習記憶的建立和喚起過程中沒有參與調控ERK活性，關于PEBP在阿片依賴中的調節(jié)機制還需要進一步研究。

(致謝:本研究在軍事醫(yī)學科學院毒物藥物所完成，除本文作者外，還特別感謝研究所李斐、趙太云副研究員在分子生物學實驗方面的指導，感謝香港中文大學陳文強博士、海軍總醫(yī)院李亮博士對CPP實驗的指導。)

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Analysis of brain PEBP and ERK in morphine-induced CPP model in rats

BIAN Jia-ming1, WU Ning2,LI Jin2

(1.DeptofPharmacology,PLAArmyGeneralHospital,Beijing100700,China;2.InstituteofPharmacologyandToxicology,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)

Aim To analyze the expression of phosphatidylethanolamine-binding protein(PEBP) and ERK in critical brain regions of psychological dependence rats.Methods Morphine-induced rats conditioned place preference(CPP) model was established to mimic different stages of morphine psychological dependence, during which PEBP expression and ERK activity were assayed in different brain regions.Results PEBP expression in hippocampus, prefrontal cortex, striatum and nucleus accumbens showed no change at three stages of psychological dependence. However, ERK activity increased notably in prefrontal cortex on CPP formation, and decreased remarkably in hippocampus on CPP reinstatement.Conclusions The formation and retrieval of associated memory between morphine effects and environment involve different neural circuits, in which ERK activity is critical, and PEBP might not be involved in such a memory-related ERK regulation.

phosphatidylethanolamine-binding protein; ERK; morphine; addiction; conditioned place preference; opioid dependence

時間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.036.html

2016-11-20,

2016-12-20

國家高技術研究發(fā)展計劃(973項目)資助項目(No 2009CB522008)；國家自然科學基金資助項目(No 30772563)；北京市自然科學基金資助項目(No 7082075)

邊佳明(1976-)，男，博士，副主任藥師，研究方向：阿片依賴，遺傳藥理學，藥學信息，E-mail：bianbenjamin@163.com; 李 錦(1957-)，男，博士，研究員，博士生導師，研究方向：阿片依賴，分子藥理學，E-mail： jinli9802@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.018

A

1001-1978(2017)04-0542-05

R-332；R322.81；R341；R749.61；R971.2