香葉醇對(duì)神經(jīng)痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究

邢自力，韓琪園，馮兆賀，許長(zhǎng)江，賈韋國(guó),2

(1.上海中藥創(chuàng)新研究中心藥理室，上海 201203;2.英屬哥倫比亞大學(xué)腦研究中心，溫哥華，BC V6T 2B5，加拿大)

香葉醇對(duì)神經(jīng)痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制研究

邢自力1，韓琪園1，馮兆賀1，許長(zhǎng)江1，賈韋國(guó)1,2

(1.上海中藥創(chuàng)新研究中心藥理室，上海 201203;2.英屬哥倫比亞大學(xué)腦研究中心，溫哥華，BC V6T 2B5，加拿大)

目的 研究香葉醇對(duì)神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛效用，并初步研究其發(fā)揮效用的可能機(jī)制。方法 制作大鼠保留性神經(jīng)痛(spared nerve injury, SNI)模型，在行為學(xué)水平檢測(cè)給藥前后大鼠機(jī)械痛閾的變化；體外急性分離SNI模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(dorsal root ganglion，DRG)，膜片鉗檢測(cè)Na通道的活性變化；體外采用膜片鉗技術(shù)分別檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hNav1.7通道和TRPA1通道的HEK293細(xì)胞，記錄給藥前后通道的活性變化。結(jié)果 香葉醇能夠快速發(fā)揮對(duì)SNI模型大鼠機(jī)械痛敏的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，對(duì)急性分離的SNI模型大鼠DRG細(xì)胞Na通道表現(xiàn)明顯抑制作用，對(duì)HEK293細(xì)胞株表達(dá)的hNav1.7通道表現(xiàn)明顯抑制作用，對(duì)HEK293細(xì)胞株表達(dá)的hTRPA1通道無抑制作用，高濃度下表現(xiàn)促進(jìn)AITC激活hTRPA1通道作用。結(jié)論 香葉醇可能通過抑制DRG細(xì)胞的Nav1.7通道起到對(duì)SNI大鼠機(jī)械痛敏的鎮(zhèn)痛作用。

香葉醇；神經(jīng)性疼痛；保留性神經(jīng)痛模型；背根神經(jīng)節(jié)；鈉通道；膜片鉗

神經(jīng)性疼痛是一種神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)損害或功能障礙引起的慢性疼痛疾病，常見于糖尿病性神經(jīng)痛(Diabetic neuropathic pain, DNP)、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(post-herpetic neuralgina, PHN)、艾滋病相關(guān)的神經(jīng)性疼痛、神經(jīng)性腰背部疼痛、癌癥相關(guān)的神經(jīng)痛、復(fù)合性局部疼痛綜合征和術(shù)后神經(jīng)痛等疾病。由于許多神經(jīng)性疼痛確切病因較為復(fù)雜，可選擇的針對(duì)神經(jīng)性疼痛的治療藥物也較為有限，且大多療效不確切。

研究提示，芳香類藥用植物中的某些單萜類、倍半萜、三萜類等芳香成分具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[1]。其中，天然的呈香化合物香葉醇，又名“牻牛兒醇”，化學(xué)名稱為反-3, 7-二甲基-2, 6-辛二烯-1-醇，是橙花醇的順式異構(gòu)體，結(jié)構(gòu)上屬于單萜烯醇類化合物，具有單萜類化合物的某些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可能具有潛在的鎮(zhèn)痛效用。香葉醇天然存在于牻牛兒苗科天竺葵屬香葉天竺葵(Pelargonium gravedens Her)，禾本科香茅屬(Cymbopogon)亞香茅、檸檬草、楓茅、爪哇香茅等，樟科木姜子屬(Litsea Lam.)山蒼子的果實(shí)，薔薇科薔薇屬(Rosaceae)玫瑰的花，茜草科梔子屬(Gardenia)梔子(GardeniajasminoidesEllis.)等250 多種植物中。天然提取物中，以香葉(精)油[oil of geranium(Pelargonium gravedens Her.)]中的香葉醇含量較高，廣泛應(yīng)用于藥物、煙草、食品配料等領(lǐng)域[2-4]。已有研究發(fā)現(xiàn)香葉醇在抗腫瘤、平喘、抗菌，驅(qū)蚊等方面具有潛在的藥學(xué)應(yīng)用價(jià)值[4]。但目前還少見香葉醇對(duì)鎮(zhèn)痛作用的研究報(bào)道。

我們?cè)趯?duì)香葉醇的研究中，發(fā)現(xiàn)了其對(duì)實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)病理性疼痛的良好鎮(zhèn)痛效果，本文將展示香葉醇在實(shí)驗(yàn)性神經(jīng)痛模型上的鎮(zhèn)痛效果和并對(duì)可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討，測(cè)試其對(duì)痛覺相關(guān)的鈉離子通道和瞬時(shí)受體電位通道的影響,以期通過我們的努力，深入挖掘香葉醇的藥用價(jià)值，推動(dòng)其作為藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛新藥的可能性，同時(shí)也為神經(jīng)病理性疼痛癥的治療提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為成年SD大鼠，♂，(200±20)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SYXK(滬)2013-0040。飼養(yǎng)條件為封閉式通氣籠分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水，室溫保持在20℃～25℃，濕度60%，每日光照與黑暗時(shí)間均為12 h。飼養(yǎng)和手術(shù)操作等按照國(guó)家動(dòng)物福利與保護(hù)相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞株 穩(wěn)定表達(dá)重組hNav1.7通道蛋白的HEK293(pcDNA3.1-hNav1.7)細(xì)胞株，穩(wěn)定表達(dá)重組hTRPA1通道蛋白的HEK293(pcDNA3.1-hTRPA1)細(xì)胞株，由中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所提供。

1.3 試劑耗材 香葉醇(TCI)、鹽酸利多卡因一水合物(Sigma)，植物油(國(guó)產(chǎn)葵花子油)、氨芐青霉素(鼎國(guó)生物)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Poly-D-lysine(分子質(zhì)量70 000～150 000)(Sigma)，胰蛋白酶(含EDTA)(sigma)，抗體anti-NeuN MAb(Milipore Anti-NeuN，Clone A60)，熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗小鼠IgG-Cy3，其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。細(xì)胞培養(yǎng)皿、移液管等(Greiner)，醫(yī)用真絲編織線，規(guī)格：3-0(上海金環(huán))，帶線縫合針(規(guī)格4-0，滅菌型)(上海金環(huán))等。

1.4 儀器設(shè)備 電子Von frey足底測(cè)試儀(Ugo basile)，Axon常規(guī)膜片鉗系統(tǒng)Axopatch 200B(Molecular Devices)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物剔毛器，CO2通氣恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermofisher)，倒置式臺(tái)式熒光顯微鏡(OLYMPUS CKX41)，-80℃超低溫冰箱(Thermo)，眼科剪、眼科鑷、顯微鑷等手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械批發(fā)部)。

2 方法

2.1 坐骨神經(jīng)保留性損傷(spared nerve injury, SNI)模型的建立 參考Richner等[5]以及Shields等[6]的方法，使用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(按40 mg·kg-1體質(zhì)量給藥)麻醉成年SD大鼠，剔除左后肢外側(cè)面坐骨神經(jīng)相應(yīng)位置被毛，縱向切開剔毛區(qū)皮膚，鈍性分離股二頭肌，暴露坐骨神經(jīng)及其3個(gè)分支：脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)和腓腸神經(jīng)；分別雙重結(jié)扎脛神經(jīng)、腓總神經(jīng)，在雙重結(jié)扎的中央切斷，并分別去除末端2～4 mm的神經(jīng)干；術(shù)中避免接觸或牽拉腓腸神經(jīng)，保持其完整；術(shù)后分層縫合傷口，抗生素抗炎。假手術(shù)對(duì)照組則只暴露坐骨神經(jīng)及其分支而不切斷不結(jié)扎，其余過程同手術(shù)組。術(shù)后連續(xù)喂養(yǎng)2周以上，待手術(shù)傷口痊愈后，測(cè)定左后肢足底的機(jī)械痛閾水平，左后肢足底的機(jī)械痛閾水平明顯低于右后肢足底時(shí)，且手術(shù)組左后肢足底的機(jī)械痛閾水平明顯低于假手術(shù)對(duì)照組相應(yīng)位置的機(jī)械痛閾水平時(shí)，SNI模型達(dá)到預(yù)期效果。本研究中，術(shù)后第3周開始相關(guān)給藥及檢測(cè)。

2.2 大鼠機(jī)械痛閾的行為學(xué)測(cè)定 機(jī)械痛閾測(cè)定：根據(jù)手術(shù)分組和試驗(yàn)?zāi)康?，測(cè)試時(shí)間安排在8點(diǎn)～16點(diǎn)，參照Dixon的方法[7]，使用電子觸覺測(cè)量?jī)x(electronic Von Frey，eVF)進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)定。將大鼠置于升高的金屬網(wǎng)上，并蓋以透明的有機(jī)玻璃罩，適應(yīng)20min，用eVF儀器的壓力感受針垂直刺激足底2、3跖趾間皮膚敏感處，逐漸加壓直至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)縮足反應(yīng)，儀器自動(dòng)記錄瞬時(shí)的峰值壓力，而身體活動(dòng)所引起的縮足反應(yīng)不記入統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。每次刺激間隔10s，每只動(dòng)物重復(fù)刺激5次。

劑量-效應(yīng)關(guān)系試驗(yàn)分組：① 假手術(shù)對(duì)照組；② SNI模型溶劑對(duì)照組；③～⑨ SNI模型不同香葉醇劑量注射組。每組6只大鼠，每只大鼠檢測(cè)5次。SNI術(shù)后第3周開始給藥，給藥后30 min檢測(cè)，采取分組給藥、分組測(cè)定的方法。

時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系試驗(yàn)分組：① 溶劑對(duì)照組(植物油)；② 利多卡因20 mg·kg-1體質(zhì)量組；③ 香葉醇200 mg·kg-1體質(zhì)量組。測(cè)定時(shí)間點(diǎn)定為：10、30、60、120、180、240、300 min。每組6只大鼠，每只大鼠檢測(cè)5次。采取分組給藥、分組測(cè)定的方法。

2.3 急性分離背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元及鑒定 參照Yu等[8]的方法，將大鼠擊昏、斷頭，迅速分離胸至腰段脊柱，并將脊柱沿椎管上緣背面中線兩側(cè)縱向剪開，去除脊椎骨，暴露脊髓，小心摘除脊髓，取出兩側(cè)椎體外側(cè)隱窩中的球形透亮的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)，置0℃通氧飽和的DMEM培養(yǎng)液中，并仔細(xì)剪去兩側(cè)的神經(jīng)索，然后剪碎DRG，加入等體積0.25%胰蛋白酶(含EDTA)，置37℃，消化20 min，隨后加入終濃度10%的胎牛血清終止消化，用吸管吹吸打散組織塊，制成細(xì)胞懸液，1 500 r·min-1離心3 min，棄去上清液，加入無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，使用70 μm尼龍濾器過濾細(xì)胞懸液，濾液分別移入多聚賴氨酸包被過的直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，靜置30 min，細(xì)胞貼壁后用氧飽和的細(xì)胞外液替換培養(yǎng)液，可直接用于全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)。

少部分細(xì)胞分散液加到6孔板預(yù)先準(zhǔn)備好的包被過多聚賴氨酸的蓋玻片上，37℃培養(yǎng)3 d，制作細(xì)胞爬片，爬片使用anti-NeuN MAb(10 mg·L-1)的抗體溶液孵育，加入羊抗小鼠IgG-Cy3二抗特異性熒光顯色，Hoechst 33258復(fù)染，熒光顯微鏡觀察記錄細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果。

2.4 大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道電流記錄 載有神經(jīng)元的蓋玻片轉(zhuǎn)移到倒置式顯微鏡載物臺(tái)上的培養(yǎng)皿中，室溫下用人工腦脊液潤(rùn)洗，選擇中等直徑(25～40 μm)的大鼠背根神經(jīng)結(jié)(DRG)神經(jīng)元。使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，尖端電阻為2～5 MΩ左右的玻璃微電極連接至MultiClamp 200B(Molecular Devices) 膜片鉗放大器，先將采集模式設(shè)在默認(rèn)的細(xì)胞貼附模式(ON-CELL)，待電極尖端與細(xì)胞膜之間形成高阻抗封接(>1 GΩ)后, 將采集模式改成全細(xì)胞模式(WHOLE-CELL)，加負(fù)壓破膜，使電極內(nèi)液與電極內(nèi)液相通，記錄所有的經(jīng)過該神經(jīng)元離子通道的電流。

細(xì)胞外液：140 mmol·L-1NaCl，3 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1CaCl2，1 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1HEPES和20 mmol·L-1Glucose，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.3。電極內(nèi)液：140 mmol·L-1CsF，10 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1HEPES，1.1 mmol·L-1EGTA和20 mmol·L-1Glucose，用CsOH調(diào)節(jié)pH 至7.3。全細(xì)胞記錄模式下, 鉀電流被Cs+阻斷, 鈣電流被胞內(nèi)EGTA、F離子和相對(duì)高濃度的Mg2+阻斷，通過這種藥理學(xué)方式可以分出Na+電流。

2.5 電壓門控鈉離子通道hNav1.7電流記錄 在室溫下，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄異源表達(dá)于HEK293細(xì)胞中的hNav1.7通道電流。尖端電阻為2～5 MΩ左右的玻璃微電極連接至Multi Clamp 200B(Molecular Devices)膜片鉗放大器。鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由pClamp 10軟件通過電腦控制和記錄，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。在全細(xì)胞記錄模式下，將細(xì)胞鉗制于-80 mV，后給予時(shí)程20 ms，0 mV的測(cè)試電壓誘發(fā)hNav1.7電流，刺激頻率為0.2 Hz，檢測(cè)化合物灌流前后的電流變化百分比。每個(gè)濃度至少測(cè)試3個(gè)細(xì)胞(n≥3)。實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞外液和電極內(nèi)液配方與DRG神經(jīng)元Na+通道電流記錄方法中使用的配方相同。

2.6 瞬時(shí)受體電位通道TRPA1電流記錄 在室溫下，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄異源表達(dá)于HEK293細(xì)胞中的TRPA1通道電流。尖端電阻為2～5 MΩ的玻璃微電極連接至HEKA EPC10膜片鉗放大器。鉗制電壓和數(shù)據(jù)記錄由PatchMaster軟件通過電腦控制和記錄，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。每個(gè)濃度至少測(cè)試3個(gè)細(xì)胞(n≥3)。

試樣準(zhǔn)備：測(cè)試當(dāng)天，將香葉醇母液(1 mol·L-1)用細(xì)胞外液稀釋得到1 mmol·L-1檢測(cè)濃度。測(cè)試化合物的DMSO含量不超過0.1%，此濃度的DMSO對(duì)檢測(cè)的離子通道電流沒有影響。細(xì)胞外液配方：140 mmol·L-1NaCl，5 mmol·L-1KCl，1 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1EGTA，10 mmol·L-1HEPES和10 mmol·L-1Glucose，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4。電極內(nèi)液配方：140 mmol·L-1CsCl，0.1 mmol·L-1CaCl2，10 mmol·L-1HEPES，5 mmol·L-1EGTA和1 mmol·L-1MgCl2，用CsOH調(diào)節(jié)pH至7.2。

3 結(jié)果

3.1 香葉醇鎮(zhèn)痛作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系 如Fig 1所示，經(jīng)腹腔注射給予溶劑(植物油)的SNI模型組(vehicle)大鼠手術(shù)側(cè)足底縮爪反射閾值(paw withdrawal threshold, PWT)(27.98±5.19) gf較假手術(shù)組(sham)大鼠同側(cè)足底PWT(44.57±6.31) gf明顯降低。腹腔注射12.5 mg·kg-1體質(zhì)量～300 mg·kg-1體質(zhì)量香葉醇的其它SNI模型組，給藥30 min后進(jìn)行手術(shù)側(cè)足底機(jī)械痛閾P(yáng)WT檢測(cè)，結(jié)果顯示隨著香葉醇劑量的提高，大鼠PWT逐步升高，高于50 mg·kg-1體質(zhì)量香葉醇后，SNI模型大鼠手術(shù)側(cè)足底的PWT水平可恢復(fù)到并超過假手術(shù)組大鼠同側(cè)足底PWT。200 mg·kg-1體質(zhì)量劑量下香葉醇的效用達(dá)到頂點(diǎn)[PWT=(67.44±23.92) gf]，PWT均值較溶劑對(duì)照組提高了2.4倍，并明顯高于假手術(shù)組的水平。給予高于200 mg·kg-1體質(zhì)量香葉醇不能進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的PWT值。

Fig 1 Effect of doses of geraniol on neuropathic pain(±s，n=6)

*P<0.05vssham group

3.2 香葉醇鎮(zhèn)痛作用的效應(yīng)時(shí)程 香葉醇在大鼠SNI模型上表現(xiàn)出快速起效的特點(diǎn)。如Fig 2所示，香葉醇腹腔注射后2 h內(nèi)(120 min)大鼠手術(shù)側(cè)足底機(jī)械刺激的PWT值均高于給藥前測(cè)定的基礎(chǔ)閾值(baseline)，給藥后30 min內(nèi)效果最強(qiáng)，30 min后閾值逐漸回落，刺激部位對(duì)機(jī)械性刺激的敏感性逐漸加強(qiáng)。在效應(yīng)表現(xiàn)最強(qiáng)的10 min到60 min期間，PWT從基礎(chǔ)值(14.8±2.51) gf提高到(49.87±20.49) gf，提高了3.37倍。溶劑對(duì)照組(植物油)的PWT在檢測(cè)時(shí)間內(nèi)變化不大，注射后足底PWT測(cè)定值基本保持穩(wěn)定，注射操作后30 min內(nèi)相對(duì)注射前閾值還有一定程度降低，可能與注射動(dòng)作本身對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的刺激性影響有關(guān)。陽性藥物利多卡因按照20 mg·kg-1體質(zhì)量腹腔注射給藥，表現(xiàn)出一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，最高效用出現(xiàn)的時(shí)間也在30 min左右，PWT從基礎(chǔ)值(16.86±1.35) gf，提高到(37.7±4.96) gf，提高了2.23倍。

Fig 2 Time phase of analgesic effect of geraniol(±s，n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsvehicle group

3.3 香葉醇對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓門控鈉離子通道的作用 在進(jìn)入全細(xì)胞記錄狀態(tài)后，DRG細(xì)胞鉗制于-80 mV，后給予步幅+5 mV的階躍刺激方波，時(shí)程50 ms，由-80 mV去極化至+15 mV，刺激頻率為0.2 Hz。以急性分離制備的SNI模型大鼠中等直徑的DRG神經(jīng)元膜電位為橫坐標(biāo)，分別對(duì)給藥前后經(jīng)給藥前最大峰電流值標(biāo)準(zhǔn)化的系列峰電流值(I/Imax)作圖，疊加得到SNI模型大鼠DRG神經(jīng)元給藥前后的I-V曲線對(duì)比圖(Fig 3A)。結(jié)果顯示，DRG神經(jīng)元INa激活電壓均在-40 mV左右，給藥前SNI模型DRG神經(jīng)元電壓門控Na+通道最大峰電流值(Imax)對(duì)應(yīng)刺激電壓為-10 mV，加入300 μmol·L-1香葉醇后，DRG神經(jīng)元I-V曲線發(fā)生上移，越靠近最大峰電流的激活電壓，峰電流值的上移幅度越大，并且給藥后最大峰電流值的對(duì)應(yīng)刺激電壓相對(duì)于給藥前稍稍左移。

在全細(xì)胞記錄模式下，DRG細(xì)胞鉗制于-80 mV，后給予時(shí)程30 ms，0 mV的測(cè)試電壓誘發(fā)Na+通道電流，刺激頻率為0.2 Hz，檢測(cè)香葉醇灌流前后的電流變化百分比。對(duì)比正常大鼠DRG神經(jīng)元以及SNI模型大鼠DRG神經(jīng)元在香葉醇灌流前后Na+電流變化，如Fig 3B所示，急性分離的SNI模型DRG神經(jīng)元經(jīng)0 mV測(cè)試電壓誘發(fā)的Na+電流峰值明顯高于正常大鼠DRG神經(jīng)元，300 μmol·L-1香葉醇近乎完全阻斷了DRG神經(jīng)元的Na+通道電流。在測(cè)試的50 μmol·L-1～600 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，經(jīng)曲線擬合計(jì)算得出，香葉醇對(duì)DRG神經(jīng)元電壓門控Na+通道的半數(shù)抑制濃度為0.1815 mmol·L-1(Fig 3C)。

Fig 3 Geraniol inhibited activated Na+ channels in DRG neuron

A:Effect of step stimulation voltage on sodium channel current;B:Effect of geraniol on sodium channel current at 0 mV test potential;C:Effect of dose of geraniol on activated Na+channels

3.4 香葉醇對(duì)hNav1.7通道的作用 形成穩(wěn)定的全細(xì)胞記錄模式后，HEK293(hNav1.7)細(xì)胞鉗制于-80 mV，后給予0 mV的測(cè)試電壓誘發(fā)Na+通道電流(INa)，時(shí)程50 ms，刺激頻率為0.2 Hz，在細(xì)胞外液中分別加入終濃度1/27 mmol·L-1、1/9 mmol·L-1、1/3 mmol·L-1、1 mmol·L-1和3 mmol·L-1的香葉醇，待電流變化穩(wěn)定后記錄加藥后的INa，計(jì)算香葉醇灌流前后的電流變化百分比。結(jié)果見Fig 4，不同濃度香葉醇對(duì)INa的抑制率分別為:(7±1)%、(17±2)%、(41±4)%、(94±1)%和(100±0)%(n=3)，其中, 各濃度組抑制率之間差異均有顯著性, 表明香葉醇對(duì)INa的抑制呈濃度依賴性關(guān)系。經(jīng)數(shù)據(jù)擬合計(jì)算，香葉醇對(duì)表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的重組人源性鈉離子通道hNav1.7的半數(shù)抑制濃度IC50約為424 μmol·L-1。

Fig 4 Inhibition of geraniol on activated hNav1.7 channels in HEK293

3.5 香葉醇對(duì)TRPA1通道的作用 測(cè)試起始，HEK293(hTRPA1)細(xì)胞膜電位鉗制于0 mV，每2 s給予一個(gè)-100 mV到+100 mV時(shí)程300 ms的斜坡電壓。0 s～30 s：?jiǎn)渭兗?xì)胞外液(EC)灌流，不加入其它成分；30 s-測(cè)試終點(diǎn)(250 s)：加入50 μmol·L-1AITC持續(xù)灌流，使細(xì)胞外液中AITC濃度保持在50 μmol·L-1；90 s-測(cè)試終點(diǎn)(250 s)：加入終濃度1 mmol·L-1香葉醇，保持灌流直至檢測(cè)終點(diǎn)。取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)-100 mV和+100 mV電壓相對(duì)應(yīng)的電流值，對(duì)記錄時(shí)間作圖，得到Fig 5A。如圖中所示，TRPA1電流由50 μmol·L-1AITC誘發(fā)，誘發(fā)的TRPA1內(nèi)向和外向電流隨時(shí)間進(jìn)程逐漸加大，經(jīng)60 s后1 mmol·L-1香葉醇的加入致使AITC誘發(fā)的TRPA1通道電流發(fā)生突變，內(nèi)外向電流均陡增，到108 s時(shí)誘發(fā)的TRPA1電流波動(dòng)達(dá)到頂峰，隨后逐漸走弱，越來越低，到測(cè)試終點(diǎn)250 s時(shí)接近于誘發(fā)前水平。

以達(dá)到最大振幅處的hTRPA1誘發(fā)電流，對(duì)-100 mV到+100 mV間的相應(yīng)斜坡電壓作圖，得到I-V曲線圖(Fig 5B)。圖中顯示，加入1 mmol·L-1香葉醇的細(xì)胞I-V曲線斜率明顯高于只加AITC 的對(duì)照組細(xì)胞TRPA1通道的I-V曲線斜率；兩條曲線交于0 mV電壓處，0 mV電壓條件下AITC和香葉醇均沒有誘發(fā)TRPA1通道電流效應(yīng)；偏離0 mV電壓越遠(yuǎn)誘發(fā)TRPA1通道電流的作用越強(qiáng)，且在負(fù)電壓下誘發(fā)的內(nèi)向TRPA1通道電流遠(yuǎn)高于同等數(shù)值的正電壓下誘發(fā)的外向TRPA1通道電流；香葉醇只改變I-V曲線斜率，并沒有使曲線偏離0 mV原點(diǎn)，沒有改變TRPA1通道本身的電流特性。我們未列出數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)測(cè)定表明，低于1 mmol·L-1的香葉醇沒有擴(kuò)大AITC誘發(fā)的TRPA1通道電流幅度作用，只有濃度達(dá)到1 mmol·L-1以上才有類似效應(yīng)，且可以確定在低于1 mmol·L-1濃度條件下香葉醇也不能直接誘發(fā)TRPA1通道電流。

4 討論

本研究在復(fù)制大鼠保留性損傷模型(SNI)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用電子von frey足底測(cè)試儀測(cè)試機(jī)械痛閾，確定了香葉醇在病理性神經(jīng)痛模型上的鎮(zhèn)痛作用；并使用急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元、重組表達(dá)hNav1.7通道蛋白的HEK293細(xì)胞株以及重組表達(dá)hTRPA1通道蛋白的HEK293細(xì)胞株，使用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)針對(duì)可能與香葉醇鎮(zhèn)痛作用相關(guān)的離子通道進(jìn)行了初步探討，研究結(jié)果提示香葉醇可能通過抑制DRG神經(jīng)元上分布的Nav1.7通道蛋白起到對(duì)SNI模型機(jī)械痛覺超敏的改善作用。

Fig 5 Effect of geraniol on hTRPA1 channels in HEK293

A:I-t plot; B:I-V plot

目前比較常用的神經(jīng)病理性疼痛模型主要有3種，分別是大鼠坐骨神經(jīng)保留性損傷模型(spared nerve injury，SNI)、坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronic constriction injury，CCI)和脊神經(jīng)選擇結(jié)扎模型(the spinal nerve ligation model，SNL)[9]。SNI模型和SNL模型主要形成機(jī)械性痛敏[10]，SNI具有復(fù)制容易，模型動(dòng)物個(gè)體之間的痛敏差異小的優(yōu)點(diǎn)。CCI模型可同時(shí)具備機(jī)械性痛敏和熱痛敏效果，但存在模型動(dòng)物個(gè)體差異大，對(duì)制作熟練度要求高的限制。在已證實(shí)香葉醇對(duì)SNI模型鎮(zhèn)痛效果的基礎(chǔ)上，未來可以使用對(duì)病理性神經(jīng)痛更具有代表性的CCI模型進(jìn)一步進(jìn)行效果驗(yàn)證。

背根神經(jīng)節(jié)是感覺神經(jīng)痛覺信息由外周向中樞傳遞的主要節(jié)點(diǎn)，尤其Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9幾種痛覺相關(guān)Na+通道亞型在DRG部位集中分布。Nav1.7主要分布在大直徑DRG神經(jīng)元(直徑>40 μm)和中等直徑的DRG神經(jīng)元(直徑在25～40 μm之間)，Nav1.8和Nav1.9主要分布在小直徑DRG神經(jīng)元(直徑<25 μm)。本研究中使用數(shù)量占比較高的中等大小DRG神經(jīng)元，代表了Nav1.7分布較多的那部分DRG神經(jīng)元的反應(yīng)特點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)中并未通過實(shí)驗(yàn)手段區(qū)分其中主要起作用的Na+通道亞型，有待在進(jìn)一步的研究中利用Nav1.7通道的河豚毒素敏感(tetrodotoxin- sensitive，TTX-S)特性，在排除Nav1.7通道作用的條件下，觀察香葉醇對(duì)河豚毒素抗性(tetrodotoxin-resistance，TTX-R)的Nav1.8，Nav1.9的影響[11]。

本研究中，發(fā)現(xiàn)1 mmol·L-1香葉醇對(duì)AITC誘導(dǎo)TRPA1通道電流有協(xié)同作用，增強(qiáng)TRPA1激活帶來的冷刺激感受，而低濃度的香葉醇沒有檢測(cè)到類似效應(yīng)。TRPA1通道為冷刺激感受通道，TRPA1激動(dòng)劑的一個(gè)應(yīng)用是能激動(dòng)周圍感覺神經(jīng)元上的TRPA1離子通道,隨后長(zhǎng)時(shí)間脫敏離子通道,并產(chǎn)生由此介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用。文獻(xiàn)報(bào)道在DRG中97%的TRPA1和TRPV1共表達(dá)[12-13]。薄荷醇、樟腦、冰片等單萜類化合物大部分都對(duì)TRPs家族的離子通道蛋白有激活或抑制作用[14-16]，是否香葉醇在對(duì)TRPA1通道協(xié)同誘導(dǎo)的同時(shí)，對(duì)同是TRPs家族的辣椒素受體通道TRPV1有抑制效應(yīng)，進(jìn)而對(duì)熱痛或辣椒素等引起的燒灼感有抑制作用，有待進(jìn)一步研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在上海中藥創(chuàng)新研究中心藥理研究室和中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所神經(jīng)藥理學(xué)研究國(guó)際科學(xué)家工作站實(shí)驗(yàn)室完成，感謝所有提供技術(shù)平臺(tái)和技術(shù)協(xié)作的同事和老師們。)

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Abirritation of geraniol on neuropathic pain model rat and possible mechanism

XING Zi-li1,HAN Qi-yuan1,FENG Zhao-he1,XU Chang-jiang1,JIA Wei-guo1,2

(1.DeptofPharmacology,ShanghaiInnovationResearchCenterofTraditionalChineseMedicine,Shanghai201203,China;2.CentreforBrainHealth,UniversityofBritishColumbia, 2211WesbrookMall,Vancouver,BCV6T2B5,Canada)

Aim To study the analgesic effect of geraniol on neuropathic pain and to explore the possible mechanism.Method A neuropathic pain rat model of Spared Nerve Injury(SNI) was established to measure changes in the threshold of paw withdrawal before and after i.p. administration of geraniol. Patch clamp whole-cell recording was performed to measure activity of sodium channels using ipsilateral L3/L4/L5 dorsal root ganglion(DRG) cells isolated from the SNI rats. In addition, HEK 293 cells expressing hNav1.7 and hTRPA1 channels were used for measuring the changes in channel activities with or without geraniol by whole-cell patch clamp.Results Geraniol had a fast analgesic effect on hypersensitivity of mechanical pain in the SNI model. It significantly inhibited sodium channels on DRGs isolated from SNI rats and hNav1.7 but not hTRPA1 channels expressed by HEK293 cells. However, high concentrations of geraniol facilitated the activation of HTRPA1 channel stimulated by AITC.Conclusion Geraniol may abirritate hypersensitivity of mechanical pain in the SNI model by specifically inhibiting Nav1.7 channel activity on the DRG cells.

geraniol;neuropathic pain;spared nerve injury model; dorsal root ganglion;sodium channel;patch clamp

時(shí)間：2017-3-13 8:38

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170324.1247.034.html

2016-12-10,

2017-01-19

國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目(No 2015DFA31630)；上海市科技支撐項(xiàng)目(No 13431900703)

邢自力(1975-)，男，博士，研究員，研究方向：新藥篩選和評(píng)價(jià)，E-mail: mblxzl2003@163.com; 賈韋國(guó)(1954-)，男，博士，教授，研究方向：腦腫瘤生物學(xué)及基因治療，通訊作者，E-mail：w.jia@ubc.ca

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.04.017

A

1001-1978(2017)04-0535-07

R-332；R284.1；R322.85；R441.1；R745；R971.1