產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測體系的建立

李 慧 蔡 軍 胡夢龍 傅 洋 歐靜堃

（中糧營養(yǎng)健康研究院；營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測體系的建立

李 慧 蔡 軍 胡夢龍 傅 洋 歐靜堃

（中糧營養(yǎng)健康研究院；營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點實驗室，北京 102209）

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SN／T 2582—2010《產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》推薦的產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1、雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列分別設(shè)計4對特異性引物，對4對引物進行多重PCR反應(yīng)體系構(gòu)建與優(yōu)化，建立快速檢測產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR方法，并應(yīng)用10株試驗菌株對所建立的檢測方法進行驗證。結(jié)果表明，建立的多重PCR方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷的優(yōu)點，為產(chǎn)黃曲霉毒素真菌快速檢測試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用提供了重要技術(shù)保障。

多重PCR 產(chǎn)黃曲霉毒素真菌 快速檢測 特異性 靈敏度

目前全球每年約有25%的農(nóng)產(chǎn)品遭受真菌毒素污染，造成高達數(shù)百億美元的經(jīng)濟損失［1］。對農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)危害較嚴(yán)重的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（AFT）、赭曲霉毒素A（OTA）、玉米赤霉烯酮（ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）、伏馬毒素B（FB）和T-2毒素等［2-4］。其中，黃曲霉毒素對環(huán)境污染最嚴(yán)重、對人畜危害最大，能夠廣泛污染花生、玉米、大豆、小麥、堅果等農(nóng)作物及其制品［5-6］。黃曲霉毒素來源于曲霉屬、青霉屬、毛霉屬、鐮孢霉屬和根霉屬等真菌［7］，曲霉屬的黃曲霉（A．flavus）和寄生曲霉（A．parasiticus）是2種主要的黃曲霉毒素產(chǎn)生菌［8-9］。因此，能否及時有效地預(yù)防與控制黃曲霉毒素危害，首要條件就是能夠快速準(zhǔn)確地檢測判斷糧食是否被黃曲霉（A．flavus）、寄生曲霉（A．parasiticus）等產(chǎn)黃曲霉毒素真菌污染［10-11］。

過去對產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測通常采用形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法等傳統(tǒng)檢測方法，主要基于真菌形態(tài)、生理特征、抗原特異性等特征進行分類鑒別，通常需要經(jīng)過純化培養(yǎng)、形態(tài)觀察、生理生化鑒定等的過程，存在檢測周期長、操作程序繁瑣、專業(yè)知識要求高、鑒別水平不夠準(zhǔn)確等缺點，難以滿足企業(yè)和政府監(jiān)管部門對大批量農(nóng)作物及其制品進行產(chǎn)黃曲霉毒素真菌快速、準(zhǔn)確檢測的需求［12］。隨著遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定方法，尤其是PCR技術(shù)在產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的檢測與鑒別方面得到了深入的研究與發(fā)展。如孫長坡等［13］應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)成功鑒別了不同黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株，Mahmoud［14］應(yīng)用實時PCR（RT-PCR）技術(shù)成功檢測了儲藏花生中污染的黃曲霉（A．flavus）菌株及其產(chǎn)黃曲霉毒素基因的表達水平，Ahmad等［8］應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)成功檢測并區(qū)分了黃曲霉毒素污染花生中的黃曲霉（A．flavus）、寄生曲霉（A．parasiticus）菌株，Midorikawa等［15］建立了曲霉屬特異的PCR檢測方法。此外，基于普通PCR技術(shù)發(fā)展起來的能夠在同一反應(yīng)體系中同時檢測多個目標(biāo)DNA的多重PCR技術(shù)，由于具備操作簡便、成本低廉和快速高效等優(yōu)點，也被廣泛用于有害微生物檢測［16-17］。然而，除秦文彥等［18］應(yīng)用多重PCR技術(shù)對可污染食品及飼料的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌進行檢測外，國內(nèi)關(guān)于應(yīng)用多重PCR技術(shù)進行產(chǎn)黃曲霉毒素真菌快速檢測的研究鮮見報道。

本研究針對標(biāo)準(zhǔn)SN／T 2582—2010《產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法》［19］推薦的黃曲霉毒素生化合成途徑中關(guān)鍵調(diào)控基因aflR、omt-1和ver-1及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列，通過生物信息學(xué)手段設(shè)計多重PCR檢測引物，同時優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系及擴增程序，建立了更為靈敏特異、快捷高效的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測體系，并成功應(yīng)用于人工污染樣品的檢測。本研究為產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測奠定了良好研究基礎(chǔ)，為其他類型的有害微生物的多重PCR檢測提供了一定的技術(shù)借鑒，為農(nóng)作物及其制品的科學(xué)儲藏和質(zhì)量安全控制提供了有力的檢測技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 供試菌株

試驗菌株部分購自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC菌種庫，部分為本實驗室分離鑒定后保藏。菌株目錄如表1。

表1 供試菌株

1.1.2 試劑和儀器

馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；薩氏培養(yǎng)液（SDB）：蛋白胨1.0%，葡萄糖4.0%及酵母粉1.0%，pH 6.0±0.2，蒸餾水配制，121℃、20 min滅菌備用；YPD固體培養(yǎng)基：酵母粉1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，121℃、20 min滅菌備用。

dNTPs、Taq酶及DNA Marker等：Takara公司；真菌基因組DNA提取試劑盒：北京索萊寶科技有限公司。

MJ-150-Ⅱ霉菌培養(yǎng)箱、HZQ-X300C恒溫振蕩器及DK-8D三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Veriti96孔快速熱循環(huán)儀：美國ABI公司；PowerPac通用電泳儀及GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-rad公司；NanoDrop 2000超微量分光光度計：美國ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與基因組DNA提取

各菌株接種于馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上，28℃活化培養(yǎng)3～5 d（酵母菌使用YPD瓊脂培養(yǎng)基）；挑取少量相應(yīng)菌株菌絲體分別接種于薩氏培養(yǎng)液（SDB），28℃、150 r／min培養(yǎng)2～3 d（酵母菌使用YPD培養(yǎng)基）；離心收集菌體，采用真菌基因組DNA提取試劑盒對所收集的菌體進行基因組DNA提取。

1.2.2 目標(biāo)基因檢測引物的設(shè)計

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)推薦的產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR［19］、柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因omt-1、雜色曲霉素A脫氫酶基因ver-1及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)特異性多重PCR引物，引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成，引物序列如表2。

表2 產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測所用目的基因及其引物序列

1.2.3 單重PCR檢測特異性及檢測靈敏度測定

以表1所列菌株基因組DNA為模板，分別PCR擴增ITS、aflR、ver-1和omt-1目的基因片段，測定各基因PCR擴增特異性，同時采用標(biāo)準(zhǔn)推薦方法進行對比驗證［21］。經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系為：5.0 μL 10×PCR buffer，1.0 μL 10 mmol／L dNTP，各引物0.4 μmol／L，Taq酶0.3 μL（5 U／μL），2 μL DNA模板（10 ng／μL），加ddH2O至50 μL。經(jīng)優(yōu)化的擴增程序為：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。經(jīng)凝膠電泳觀察分析相應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物后，分別進行純化測序，并與GenBank中相應(yīng)序列進行比對。

以黃曲霉菌株CGMCC 3.4410基因組DNA為模板，按終濃度10 ng／μL～1 pg／μL進行10倍梯度稀釋，采用上述經(jīng)優(yōu)化的反應(yīng)體系及擴增程序分別進行PCR檢測，經(jīng)凝膠電泳觀察分析相應(yīng)單重PCR擴增的檢測靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單重PCR檢測特異性分析

應(yīng)用所設(shè)計的4對引物，分別對表1中11株菌株的ITS、aflR、ver-1和omt-1目的基因進行單重PCR特異性分析。采用本研究提供的4對引物進行單重PCR檢測結(jié)果（圖1b）與采用標(biāo)準(zhǔn)［21］推薦方法檢測結(jié)果（圖1a）相一致，5、6、8、10號菌株基因組DNA中均能擴增出ITS、aflR、ver-1和omt-1目的基因片段，表明這4株菌株可能都具有產(chǎn)黃曲霉毒素能力，同理論結(jié)果一致。此外，2號樣品采用本研究提供方法擴增產(chǎn)物中未出現(xiàn)明顯非特異性擴增。表明本研究所提供的單重PCR檢測方法具有較高的檢測特異性，能夠滿足產(chǎn)黃曲霉毒素真菌特異性檢測的要求。

1.2.4 多重PCR檢測特異性與檢測靈敏度測定

在不改變擴增程序的前提下，對多重PCR反應(yīng)體系主要因素進行優(yōu)化，確定多重PCR反應(yīng)體系：5.0 μL 10×PCR buffer，1.0 μL 10 mmol／L dNTP，各引物0.2μmol／L，Taq酶0.3μL（5 U／μL），2 μL DNA模板（10 ng／μL），加ddH2O至50 μL。經(jīng)凝膠電泳觀察分析相應(yīng)PCR擴增產(chǎn)物后，分別回收純化相應(yīng)擴增DNA片段進行測序比對驗證。

以黃曲霉菌株CGMCC 3.4410基因組DNA為模板，按終濃度10 ng／μL～1 pg／μL進行10倍梯度稀釋，采用上述經(jīng)優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系及擴增程序進行多重PCR檢測，經(jīng)凝膠電泳觀察分析相應(yīng)多重PCR擴增的特異性及靈敏度。同時采用基于標(biāo)準(zhǔn)［19］構(gòu)建的多重PCR檢測方法進行對比驗證。

1.2.5 人工污染樣品的多重PCR檢測

取表1中1～10號菌株新鮮SDB培養(yǎng)物各1 mL，分別充分混入10～15 g經(jīng)121℃、20 min滅菌處理的玉米和花生中，制備成20份人工污染樣品，于28℃、相對飽和濕度60%的條件下培養(yǎng)10 d。分別加入20 mL TE緩沖液，渦旋振蕩120～180 s，分離上清。離心收集菌體（和孢子），加1 mL TE緩沖液漂洗后離心，重復(fù)2～3次，收集菌體，采用真菌基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取。調(diào)整基因組DNA濃度至10～50 ng／μL，按1.2.4所建立的多重PCR反應(yīng)體系及擴增程序進行多重PCR檢測，凝膠電泳觀察分析多重PCR體系擴增的特異性及穩(wěn)定性。

圖1 11株菌株ITS、aflR、ver-1和omt-1目的基因單重PCR檢測

2.2 單重PCR檢測靈敏度分析

圖2 以ITS、aflR、ver-1和omt-1基因為目的基因的單重PCR檢測靈敏度檢測

以黃曲霉菌株CGMCC 3.4410基因組DNA為模板，分別對各對引物的PCR檢測靈敏度進行了分析。圖2顯示，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)推薦方法［19］，加入基因組DNA濃度最低至100 pg／μL時，能看到清晰的ITS、ver-1和omt-1基因擴增條帶，加入基因組DNA濃度最低至1 ng／μL時，能看到清晰的aflR基因擴增條帶；應(yīng)用本研究提供的單重PCR方法，加入基因組DNA濃度最低至10 pg／μL時，能看到清晰的ver-1和omt-1基因擴增條帶，加入基因組DNA濃度最低至100 pg／μL時，能看到清晰的ITS和aflR基因擴增條帶。表明本研究提供的單重PCR檢測方法對aflR、ver-1和omt-1基因的檢測靈敏度均優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)推薦方法的檢測靈敏度［19］。

2.3 多重PCR檢測特異性和檢測靈敏度分析

本研究在不改變擴增程序的前提下，對反應(yīng)體系主要因素進行優(yōu)化，確定了多重PCR反應(yīng)體系。應(yīng)用優(yōu)化的多重PCR檢測體系及擴增程序，以黃曲霉菌株CGMCC 3.4410基因組DNA為模板，對多重PCR檢測特異性及靈敏度進行了分析。圖3顯示，應(yīng)用基于標(biāo)準(zhǔn)［19］構(gòu)建的多重PCR檢測方法，加入基因組DNA濃度最低至1 ng／μL時，能看到清晰的4條目的擴增條帶；應(yīng)用本研究提供的多重PCR檢測方法，加入基因組DNA濃度最低至100 pg／μL時，能看到清晰的4條目的擴增條帶，并且未出現(xiàn)非特異性擴增。表明本研究所提供的多重PCR檢測方法在檢測特異性和靈敏度方面均優(yōu)于基于標(biāo)準(zhǔn)［19］構(gòu)建的多重PCR檢測方法，能夠滿足產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR檢測的要求。

圖3 ITS、aflR、ver-1和omt-1目的基因的多重PCR檢測特異性和檢測靈敏度檢測

2.4 人工污染樣品的多重PCR檢測分析

應(yīng)用本研究提供的多重PCR檢測方法對20份人工污染樣品檢測結(jié)果顯示，由4株產(chǎn)黃曲霉毒素真菌分別污染的4份花生樣品及4份玉米樣品的檢測結(jié)果中4條目的擴增條帶均清晰可見，被判定為樣品被可能具有產(chǎn)黃曲霉毒素能力菌株污染；而其他12份樣品的檢測結(jié)果中4條目的擴增條帶均未同時出現(xiàn)，被判定為樣品未被產(chǎn)黃曲霉毒素菌株污染。本研究建立的多重PCR方法符合產(chǎn)黃曲霉毒素真菌快速、高通量檢測的要求。

3 結(jié)論

以SN／T 2582—2010推薦的黃曲霉毒素生化合成途徑中關(guān)鍵調(diào)控基因aflR、omt-1和ver-1及真菌共有的5.8S rDNA的ITS序列為目標(biāo)檢測基因，通過生物信息學(xué)手段設(shè)計多重PCR檢測引物，優(yōu)化反應(yīng)體系及擴增程序，建立了產(chǎn)黃曲霉毒素真菌多重PCR快速檢測方法。該方法對aflR、ver-1和omt-1基因具有較高的檢測靈敏度，能夠很好地滿足實際樣品的檢測需求。此外，該方法具有操作簡便、成本低廉和快速高效等優(yōu)點，更能符合當(dāng)前高通量、快速檢測的需求。

［1］杜英秋，張瑞英，楊煥春，等.國內(nèi)外真菌毒素檢測標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀及分析［J］.糧食與油脂，2014（7）：60-66 Du Y Q，Zhang R Y，Yang H C，et al.Current status and analysis of domestic and international mycotoxin determination standard［J］.Cereals and Oils，2014（7）：60-66

［2］Marin S，Ramos A J，Cano-Sancho G，et al.Mycotoxins：occurrence，toxicology，and exposure assessment［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，60（10）：218-237

［3］Rocha M E B D，F(xiàn)reire F D C O，Maia F E F，et al.Mycotoxins and their effects on human and animal health［J］. Food Control，2014，36：159-165

［4］秦健，朱珠，于海華，等.糧油飼料原料中外源性真菌毒素的危害與防控［J］.糧食與食品工業(yè)，2015，22（1）：61-64 Qin J，Zhu Z，Yu H H，et al.The harm and prevention&control of exogenous mycotoxins in raw material of grain and oil feedstuff［J］.Cereal and Food Industry，2015，22（1）：61-64

［5］Razzaghi-Abyaneh M，Chang P，Shams-Ghahfarokhi M，et al.Global health issues of aflatoxins in food and agriculture：challenges and opportunities［J］.Frontiers in Microbiology，2014，5（8）：420

［6］Hassan Yazdanpanah D，Eslamizad S.Aflatoxins［J］.Toxinology，2014，42（4）：1-16

［7］Abrar M，Anjum F M，Butt M S，et al.Aflatoxins：biosynthesis，occurrence，toxicity，and remedies［J］.Critical Reviews in Food Science&Nutrition，2013，53（8）：862-874

［8］Ahmad M M，Ahmad M，Ali A，et al.Detection of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus from aflatoxin-contaminated peanuts and their differentiation using PCR-RFLP［J］.Animals of Microbiology，2014，64（4）：1597-1605

［9］Gourama H，Bullerman L B，Gourama H.Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus：aflatoxigenic fungi of concern in foods and feeds：a review［J］.Journal of Food Protection，1995，58（12）：1395-1404

［10］楊生瑞，屈凌波，孫長坡，等.黃曲霉菌株的分離、鑒定及產(chǎn)毒能力分析［J］.中國糧油學(xué)報，2012，27（6）：110-114 Yang S R，Qu L B，Sun CP，et al.Isolation and identification of aspergillus olavus strains and analysis of toxin-producing ability［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2012，27（6）：110-114

［11］Ahmad M M，Alam P，Z.Abdin M，et al.Panfungal PCR method for detection of aflatoxigenic molds［J］.Fungal Biology，2013：495-499

［12］Sudini H，Srilakshmi P，Vijay K K K，et al.Detection of aflatoxigenic Aspergillus strains by cultural and molecular methods：A critical review［J］.African Journal of Microbiology Research，2015，9（8）：484-491

［13］孫長坡，常曉嬌，伍松陵，等.利用PCR-RFLP方法鑒別黃曲霉毒素產(chǎn)毒菌株［J］.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（18）：3675-3683 Sun C P，Chang X J，Wu S L，et al.Identification of aflatoxin producing strains by using PCR-RFLP method［J］. Scientia Agricultura Sinica，2014，47（18）：3675-3683

［14］Mahmoud，M A.Detection of Aspergillus flavus in stored peanuts using real-time PCR and the expression of aflatoxin genes in toxigenic and atoxigenic A．flavus isolates［J］. Foodborne Pathogens and Disease，2015，12（4）：289-296

［15］Midorikawa G E，Sousa M D L M D，Silva O F，et al.Characterization of Aspergillus species on Brazil nut from the Brazilian Amazonian region and development of a PCR assay for identification at the genus level［J］.Bmc Microbiology， 2014，14：138

［16］蔡軍，李慧，歐靜堃，等.3種食源性致病菌多重PCR檢測體系的建立［J］.食品科技，2015，40（3）：324-329 Cai J，Li H，Ou J K，et al.Establishment of multiplex PCR for the detection of three foodbornebacterial pathogens［J］. Food Science and Technology，2015，40（3）：324-329

［17］Yan W.Multiplex PCR primer design for simultaneous detection of multiple pathogens［J］.Methods in Molecular Biology，2015，1275：91-101

［18］秦文彥，程潔，應(yīng)盛華，等.可污染食品及飼料的產(chǎn)黃曲霉毒素真菌的多重PCR檢測［J］.菌物學(xué)報，2007，26（3）：448-454 Qin WY，Cheng J，Ying S H，et al.Multiplex PCR detection of aflatoxigenic fungi able to contaminate food and feed［J］.Microsystem，2007，26（3）：448-454

［19］SN／T 2582—2010產(chǎn)黃曲霉毒素真菌PCR檢測方法［S］SN／T 2582—2010 Detection of aflatoxigenic strains of Aspergillus by PCR［S］

［20］GB／T 18979—2003食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法［S］GB／T 18979—2003 Determination aflatoxins content in foodcleanup by immunoaffinity chromatographyand determination by high-performance liquid chromatography and fluorometer［S］

［21］Kumeda Y，Asao T.Single-strand conformation polymorphism analysis of PCR-amplified ribosomal DNA internal transcribed spacers to differentiate species of Aspergillus section Flavi［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62（8）：2947-2952.

Establishment of Multiplex PCR for the Detection of Aflatoxigenic Fungi

Li Hui Cai Jun Hu Menglong Fu Yang Ou Jingkun

（Nutrition&Health Research Institute，COFCO Corporation；Beijing Key Laboratory of Nutrition，Health&Food Safety，Beijing 102209）

To establish a multiplex PCR method for rapid and high sensitivity detection of aflatoxigenic fungi，4 pairs of specific primers were designed according to the specific genes recommended by the standard of SN／T 2582—2010 Detection of aflatoxigenic strains of Aspergillus by PCR，including aflatoxin biosynthesis regulatory gene aflR，versicolorin A dehydrogenase gene ver-1，sterigmatocystin o-methyltransferase gene omt-1，and the internal transcribed spacer（ITS）of fungal 5.8S rDNA，a multiplex PCR reaction system for aflatoxigenic fungi was established and optimized，and then verified by detection of 10 testing stains.The results showed that this multiplex PCR method had many advantages，such as high sensitivity，strong specificity，convenient and efficient to operation.In conclusion，this method provided a key technical support for developing and applying of rapid detection kit of aflatoxigenic fungi．

multiplex PCR，aflatoxigenic fungi，rapid detection，specificity，sensitivity

Q93-31

A

1003-0174（2017）01-0125-05

國家科技支撐計劃（2012BAK08B04-01）

2015-06-05

李慧，女，1971年出生，博士，生物技術(shù)

蔡軍，男，1985年出生，博士，微生物學(xué)