黃蜀葵花黃酮抗氧化性及對DNA氧化損傷的保護(hù)作用

黎 望 孫培冬 季曉彤 路 帥

(1. 江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

黃蜀葵花黃酮抗氧化性及對DNA氧化損傷的保護(hù)作用

黎 望1,2孫培冬1,2季曉彤1,2路 帥1,2

(1. 江南大學(xué)食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對黃蜀葵花乙醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取，得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相4個(gè)不同極性成分。采用DPPH·清除、·OH清除和H2O2清除試驗(yàn)考察了其抗氧化活性，研究了正丁醇相對·OH 和H2O2誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用，并利用HPLC—MS對正丁醇中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：黃蜀葵花黃酮主要富集于乙酸乙酯相和正丁醇相；乙酸乙酯相對DPPH·的清除能力最好，IC50值為0.038 6 mg/mL，而正丁醇相對·OH和H2O2的清除能力較好，IC50值分別為0.225 0， 0.575 7 mg/mL；正丁醇相對·OH和H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷都有保護(hù)作用；正丁醇相中含有11種黃酮類化合物。

黃蜀葵花；黃酮；萃取相；抗氧化活性；DNA氧化損傷

自由基是人體生物反應(yīng)中產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，正常情況下處于動(dòng)態(tài)平衡，但由于大氣污染、紫外線照射以及不良生活習(xí)慣等因素，常使人體內(nèi)自由基過剩，從而引發(fā)DNA氧化損傷，導(dǎo)致衰老和各種疾病。大量研究[1-3]表明，黃酮類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能夠通過多種方式有效地清除自由基，從而預(yù)防、治療疾病，減緩人體衰老等。而天然抗氧化劑的應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品行業(yè)日益凸顯其優(yōu)勢。

黃蜀葵花為錦葵科秋葵屬植物黃蜀葵的干燥花。黃蜀葵花含有黃酮類、還原糖類、鞣質(zhì)、長鏈烴類化合物、多糖類化合物以及其他化學(xué)成分[4]，其中黃酮類化合物為黃蜀葵花主要活性成分。研究表明黃蜀葵花黃酮具有降血糖[5]、改善腎纖維化[6]、保護(hù)心肌損傷[7]和促進(jìn)血管新生[8]等生物活性，但有關(guān)黃蜀葵花黃酮對DNA氧化損傷的保護(hù)作用尚未見報(bào)道。

本研究擬利用不同極性溶劑對黃蜀葵花乙醇提取物進(jìn)行分級(jí)萃取，得到不同極性部位，并通過清除DPPH·、·OH 和H2O2試驗(yàn)進(jìn)行抗氧化活性篩選，對活性較好的部位進(jìn)行·OH和H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的研究，并對該組分的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行鑒定，為黃蜀葵花黃酮的藥用機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃蜀葵花：產(chǎn)地河南，購自亳州市芝春堂藥材采購站；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；

質(zhì)粒pBR322 DNA：寶生物工程有限公司；

Goldview染料：上海寶曼生物科技有限公司；

DPPH(1,1-二苯基苦?；诫?：美國Sigma公司；

其他試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：ME203E型，美國Mettler-Toledo公司；

超聲波清洗儀：KH-100B型，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-S2型，上海亞榮生化儀器廠；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-5203型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式真空泵：SHB-Ⅲ型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；

雙光束紫外可見分光光度計(jì)：U-1901型，北京普析通用儀器有限公司；

熒光分光光度計(jì)：Cary Esclipse型，美國Varian公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黃蜀葵花黃酮樣品的制備 稱取黃蜀葵花粉末，用60%乙醇以1∶20(g/mL)的料液比在50 ℃下超聲提取30 min，抽濾，將濾液減壓濃縮得浸膏。將浸膏冷凍干燥得黃蜀葵花粗提物(ACF)，再將其用適量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行少量多次的萃取，直至萃取相顏色較淺，將各相濃縮除盡溶劑后，干燥得到石油醚相(AFP)、乙酸乙酯相(AFE)、正丁醇相(AFB)和水相(AFW) 4部分萃取相固體，測各相得率及黃酮含量。將各萃取相均用水超聲溶解，并配制成不同濃度樣品備用。

(1)

式中：

Y——得率，%；

M1——各萃取相質(zhì)量，g；

M0——粗提取物質(zhì)量，g。

1.3.2 黃酮含量的測定 以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用NaNO2—Al(NO3)3—NaOH法[9]得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A=11.645 71C-0.003 04(R2=0.999 7)。將各萃取相配制成相應(yīng)濃度，分別測定其吸光度，根據(jù)式(2)計(jì)算黃酮含量。

(2)

式中：

X——黃酮含量，mg/g；

C——稀釋后樣品溶液黃酮濃度，mg/mL；

N——稀釋倍數(shù)；

V——體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 黃蜀葵花各萃取相對DPPH·清除能力測定 參考文獻(xiàn)[10]，在10 mL離心管中加入1 mL不同濃度的萃取相溶液和4 mL 0.04 mg/mL的DPPH溶液，混合均勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在520 nm處測定吸光度，以Vc為陽性對照。

(3)

式中：

S1——DPPH清除率，%；

A1——1 mL萃取相溶液+4 mL DPPH溶液的吸光度；

A2——1 mL萃取相溶液+4 mL乙醇的吸光度；

A0——1 mL H2O+4 mL DPPH溶液的吸光度。

1.3.4 黃蜀葵花各萃取相對·OH清除能力測定 參考文獻(xiàn)[11]，在10 mL離心管中依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL磷酸緩沖溶液(pH=7.4)、1 mL 0.75 mmol/L 的FeSO4溶液、1 mL不同濃度萃取相溶液，最后加入1 mL 0.01% H2O2，振蕩搖勻，在37 ℃下水浴1 h，于510 nm處測吸光度，以Vc為陽性對照。

(4)

式中：

S2——·OH清除率，%；

A1——1 mL鄰二氮菲+2 mL磷酸緩沖溶液+1 mL FeSO4+1 mL H2O+1 mL H2O2的吸光度；

A2——1 mL鄰二氮菲+2 mL磷酸緩沖溶液+1 mL FeSO4+1 mL萃取相溶液+1 mL H2O2的吸光度;

A3——1 mL鄰二氮菲+2 mL磷酸緩沖溶液+1 mL FeSO4+2 mL H2O的吸光度。

1.3.5 黃蜀葵花各萃取相對H2O2清除能力測定 參考文獻(xiàn)[12]，在10 mL離心管中加入40 mmol/L H2O2磷酸緩沖溶液(pH=7.4)0.5 mL，萃取相溶液0.5 mL，用PBS(pH=7.4)稀釋到8 mL，混勻，靜置反應(yīng)15 min，在230 nm處測其吸光度。

(5)

式中：

S3——H2O2清除率，%；

A1——0.5 mL H2O2+0.5 mL萃取相溶液+7 mL PBS的吸光度；

A2——0.5 mL萃取相溶液+7.5 mL PBS的吸光度；

A0——0.5 mL H2O2+7.5 mL PBS的吸光度。

1.3.6 黃蜀葵花正丁醇相對·OH誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用 參考文獻(xiàn)[13]，在微量熒光比色皿中依次加入1 μL 100 ng/μL DNA、10 μL 0.1 mol/L (NH4)2Fe(SO4)2溶液、10 μL 0.17 mol/L的EDTA-2Na溶液、10 μL 0.015% H2O2溶液、10 μL 10 mg/mL VC溶液、10 μL AFB溶液、40 μL 1×TE緩沖溶液及0.5 μL Goldview染料，混勻后靜置5 min，熒光測定條件為：狹縫Ex=5 nm，Em=10 nm，在激發(fā)波長486 nm下掃描500～700 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.3.7 黃蜀葵花正丁醇相對H2O2誘導(dǎo)DNA氧化損傷的保護(hù)作用 參考文獻(xiàn)[14]，在微量熒光比色皿中依次加入1 μL DNA、1 μL 30% H2O2溶液，5 μL待測AFB溶液，95 μL 1×TE緩沖溶液以及0.5 μL Goldview溶液，混勻后放置10 min，再置于紫外燈下照射10 min，熒光測定條件同1.3.6。

1.3.8 黃蜀葵花正丁醇相的HPLC—MS解析 AFB用甲醇溶解，進(jìn)行HPLC—MS分析。液相色譜條件：BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相：乙腈—0.1%甲酸；梯度洗脫，流速：0.3 mL/min；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣量：5 μL；記錄200～400 nm紫外光譜。質(zhì)譜條件：負(fù)離子模式；檢測范圍(m/z)：100～1 000；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；錐孔電壓：30 V；離子源溫度：100 ℃；脫溶劑溫度：400.0 ℃；脫溶劑氣流量：700 L/h；噴霧氣流量：50 L/h；檢測電壓：1 800 V。

2 結(jié)果與分析

2.1 各萃取相得率及黃酮含量

由表1可知，經(jīng)萃取后水相的得率達(dá)到67.39%，但黃酮含量僅僅是113.9 mg/g，而乙酸乙酯相和正丁醇相中的黃酮含量分別達(dá)到491.24，417.68 mg/g。

表1 不同極性部位得率及總黃酮含量Table 1 The yield and content of flavonoid in different phase

2.2 黃蜀葵花各萃取相對DPPH·的清除能力

由圖1可知，各萃取相和VC清除DPPH·的能力隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.18 mg/mL時(shí)，AFE 和AFB的清除率分別為95.233%，87.25%，而AFP和AFW對DPPH·的清除率低于50%。4個(gè)萃取相中AFE的清除能力最好，接近VC的清除能力。

圖1 各萃取相對DPPH·的清除作用Figure 1 Scavenging effect of extracts on free radical DPPH·

2.3 黃蜀葵花各萃取相對·OH的清除能力

由圖2可知，各萃取相對·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。AFB和AFE對·OH的清除能力高于AFP和AFW。當(dāng)樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.4 mg/mL時(shí)，AFB和AFE對·OH的清除率均高于95%，AFW的清除率為56.33%，而AFP對·OH的清除率不足50%，表明 AFB和AFE有較強(qiáng)的清除·OH的能力。

2.4 黃蜀葵花各萃取相對H2O2的清除能力

由圖3可知，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，各萃取相對H2O2的清除能力也增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)，AFP和AFW的清除率比較低，而AFE和AFB的清除率接近90%，AFE和AFB的IC50值分別為0.628 5，0.575 7 mg/mL。

圖2 各萃取相對·OH的清除作用Figure 2 Scavenging effect of extracts on free radical ·OH

圖3 各萃取相對H2O2的清除能力Figure 3 The scavenging activity of extracts on H2O2

2.5 AFB對·OH誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用

由圖4可知，Goldview-DNA在波長532 nm左右有最大發(fā)射光譜，在沒有·OH氧化損傷DNA時(shí)，其熒光強(qiáng)度為258.836 8 a.u.；引入·OH后，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到破壞，影響DNA和染料Goldview之間的能量傳遞，導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度降低，此時(shí)熒光強(qiáng)度為61.324 7 a.u.。由圖5可知，加入AFB溶液后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，說明樣品溶液的存在減弱了·OH對DNA 的氧化損傷程度。AFB濃度低于0.12 mg/mL時(shí)，隨著樣品溶液質(zhì)量濃度的增加，其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，即對DNA氧化損傷的保護(hù)作用增強(qiáng)，當(dāng)濃度超過0.12 mg/mL時(shí)，對DNA氧化損傷的保護(hù)作用隨著AFB濃度的增加而減弱。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是：質(zhì)量濃度低時(shí)，AFB主要用于消除體系中·OH，從而抑制DNA的氧化損傷；而濃度過高時(shí)，AFB除了清除·OH，還能與DNA發(fā)生相互作用，削弱了體系的熒光強(qiáng)度。

圖4 AFB對·OH誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用Figure 4 Protection of AFB on ·OH-induced oxidative DNA damage

圖5 不同質(zhì)量濃度時(shí)AFB體系的最大熒光強(qiáng)度Figure 5 The maximum fluorescence intensity of AFB system at different concentration

2.6 AFB對H2O2誘導(dǎo)DNA氧化損傷的抑制作用

由圖6、7可知，在該試驗(yàn)條件下，Goldview-DNA在波長532 nm左右有最大發(fā)射光譜，沒有H2O2氧化損傷DNA時(shí)，其熒光強(qiáng)度為278.10 a.u.；引入H2O2后，其熒光強(qiáng)度降至91.521 a.u.，表明H2O2的加入使DNA氧化損傷。加入AFB之后，體系的熒光強(qiáng)度也發(fā)生了變化。AFB質(zhì)量濃度低于0.12 mg/mL，體系的熒光強(qiáng)度隨著濃度的增加而增強(qiáng)；但濃度超過0.12 mg/mL后，體系的熒光強(qiáng)度就隨濃度的增加而降低，但均大于僅被H2O2氧化損傷的熒光強(qiáng)度，即AFB對H2O2氧化損傷的DNA保護(hù)作用減弱，但對氧化損傷的DNA仍有保護(hù)作用，即AFB濃度在0.04～0.60 mg/mL時(shí)，對H2O2氧化損傷的DNA有保護(hù)作用。

2.7 AFB中黃酮類化合物結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)過HPLC—MS分析，檢測波長350 nm處的液相色譜圖見圖8，而相應(yīng)的色譜峰對應(yīng)的最大紫外吸收波長和質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表2，與相關(guān)的文獻(xiàn)對照，推斷鑒定出11個(gè)化合物。

圖6 AFB對H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷的保護(hù)作用Figure 6 Protection of AFB on H2O2-induced oxidative DNA

圖7 不同質(zhì)量濃度時(shí)AFB體系的最大熒光強(qiáng)度Figure 7 The maximum fluorescence intensity of AFB system at different concentration

圖8 AFB在檢測波長350 nm的色譜圖Figure 8 Chromatogram of AFB at 350 nm

文獻(xiàn)[15]表明，負(fù)離子模式下的黃酮苷類化合物有如下裂解規(guī)律：3’位糖苷主要丟失糖分子，只產(chǎn)生[苷元-H]-離子，不產(chǎn)生[苷元-2H]-離子；7位糖苷丟失糖分子，不僅產(chǎn)生[苷元-H]-，還能產(chǎn)生[苷元-2H]-離子，但后者強(qiáng)度明顯低于前者；3位糖苷分別發(fā)生丟失糖分子和糖苷鍵均裂，同時(shí)產(chǎn)生[苷元-H]-和[苷元-2H]-離子，但后者強(qiáng)度高于前者。黃酮苷元為槲皮素的黃酮類化合物會(huì)產(chǎn)生m/z301或300離子；黃酮苷元為楊梅素和棉皮素的黃酮類化合物會(huì)產(chǎn)生317或316的離子，當(dāng)同時(shí)有碎片離子峰195、167時(shí)為棉皮素。

表2中化合物1、5、6的分子離子峰都是m/z463，且都有碎片離子峰m/z301，300，表明苷元為槲皮素，而化合物5、6中m/z300的碎片峰強(qiáng)于m/z301的碎片峰，表明這兩種化合物中糖苷為3取代[15]，而化合物1則相反，表明糖苷為7取代，在根據(jù)各物質(zhì)的出峰時(shí)間，參考文獻(xiàn)[16]，推測1、5、6依次為槲皮素-7-O-葡萄糖苷、異槲皮素、金絲桃苷?；衔?的分子離子峰為m/z493，且有碎片離子峰m/z317，表明苷元為楊梅素或槲皮素，同時(shí)有碎片m/z195和167，則苷元為棉皮素，參考文獻(xiàn)[16]，推測該化合物為棉皮苷?；衔?的[M-H]-為505，其分子量為506，碎片離子峰m/z463，301與文獻(xiàn)[17]一致，推測為乙酰化金絲桃苷?；衔?、10、11分子離子峰都是m/z479，推測其分子量為480，都有碎片離子峰317，參考文獻(xiàn)[16]推測其依次為楊梅素-3’-O-葡萄糖、楊梅素-3-O-葡萄糖、楊梅素-3-O-半乳糖?；衔?、8的分子離子峰為m/z609，且都有m/z301、300的碎片離子峰，參考文獻(xiàn)[16]，推測這兩種物質(zhì)分別為槲皮素3-O-半乳糖基鼠李糖、蘆丁?；衔?的分子離子峰為m/z595，則分子量為596，由文獻(xiàn)[16]可知，該化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖基阿拉伯糖苷。

表2 HPLC分離化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Mass Spectrum data of compounds separated by HPLC

3 結(jié)論

黃蜀葵花粗提物經(jīng)不同極性的溶劑萃取后，得到4個(gè)萃取相，黃酮富集于乙酸乙酯相和正丁醇相。抗氧化活性的研究表明乙酸乙酯相和正丁醇相的抗氧化性優(yōu)于石油醚相和水相，這與兩相中總黃酮含量存在量效關(guān)系。其中乙酸乙酯相對DPPH·的清除能力最佳，清除率最高達(dá)95.23%，IC50值為0.038 6 mg/mL；而正丁醇相對·OH和H2O2的清除能力最好，清除率最高分別為96.21%和88.62%，IC50值分別為0.225 0 mg/mL和0.575 7 mg/mL。選取正丁醇相進(jìn)行DNA氧化損傷的研究，結(jié)果表明在0.04～0.60 mg/mL時(shí)，AFB對·OH和H2O2誘導(dǎo)的DNA氧化損傷都有保護(hù)作用，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL時(shí)，對DNA損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)。通過HPLC—MS鑒定了正丁醇相中的11種黃酮類化合物。綜上所述，黃蜀葵花黃酮具有較好的抗氧化活性，同時(shí)對DNA的氧化損傷也有較為顯著的保護(hù)作用，且初步鑒定正丁醇相中的11種黃酮類化合物。本研究可為黃蜀葵花總黃酮在化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域的開發(fā)提供理論依據(jù)，但黃蜀葵花黃酮保護(hù)DNA氧化損傷的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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The antioxidant activities and protection on DNA oxidative damage of flavonoid from the flowers ofAbelmoschusmanihot

LI Wang1,2SUNPei-dong1,2JIXiao-tong1,2LUShuai1,2

(1.MinistryofEducation,SchoolofChemicalandMaterialEngineering,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China;2.TheKeyLaboratoryofFoodColloidsandBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

The ethanol extracts of flowers fromAbelmoschusmanihotwas extracted by petroleum ether、ethyl acetate and n-butyl alcohol, and four different polar portions were obtained. The scavenging effect of different phases on DPPH·, ·OH and H2O2were studied to research the antioxidant activities of each phase. Moreover, the protection of n-butyl alcohol phase on DNA oxidative damage was also studied, and the flavonoids component was identified by HPLC-MS. The results showed that the ethyl acetate phase had the best scavenging effect on DPPH·, withIC50value 0.038 6 mg/mL. However, the n-butyl alcohol phase had scavenge ·OH and H2O2best, and theIC50values were 0.225 0 and 0.575 7 mg/mL, respectively. The n-butyl alcohol phase was proved to show protective effect in some degree on DNA oxidative damage., and totally 11 kinds of flavonoids were found in the n-butyl alcohol phase.

Abelmoschusmanihotflower; flavonoids; extracts; antioxidant activity; DNA oxidative damage

黎望，女，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

孫培冬(1967-)，女，江南大學(xué)副教授，碩士。 E-mail: sunpeidong2004@126.com

2016—12—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.029