李靖坤,王珊珊,陳相峰*,王曉利,林云良
(山東省分析測試中心,山東 濟南 250014)
氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定基因毒性雜質(zhì)3,4-二氯苯胺的方法學驗證
李靖坤,王珊珊,陳相峰*,王曉利,林云良
(山東省分析測試中心,山東 濟南 250014)
文章建立了一種氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定吉非替尼中3,4-二氯苯胺的方法。本方法采用多反應監(jiān)測(MRM)掃描模式,能夠有效的降低基質(zhì)效應,在1~100ng/mL 范圍內(nèi)3,4-二氯苯胺線性關(guān)系良好,化合物相關(guān)系數(shù)均大于0.990,回收率在92.53%~118.15%,目標化合物峰面積(RSD%)值均小于10.0%。可滿足吉非替尼中基因毒性雜質(zhì)3,4-二氯苯胺的測定要求。
GC/MS/MS;基因毒性雜質(zhì);3,4-二氯苯胺
吉非替尼(易瑞沙)是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑[1],是一種新型的治療癌癥的藥物,可以通過抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中細胞信號的傳導來抑制惡性腫瘤細胞的增生[2-4],目前已在多個國家批準上市用于癌癥的治療[5]。吉非替尼常被應用于治療已經(jīng)接受了化學治療或者是不適于化療的晚期的或者轉(zhuǎn)移性非小細胞肺癌。在制備吉非替尼的工藝流程中往往會存在溶劑殘留問題,而這些殘留的溶劑中有許多是基因毒性雜質(zhì)?;蚨拘噪s質(zhì)在低濃度時就可造成人體的遺傳物質(zhì)的損傷[6-7],從而導致基因突變[10-12]并可能促使腫瘤的發(fā)生。近幾年來,隨著基因毒性雜質(zhì)法規(guī)的逐步完善,美國食品和藥物管理局( FDA) 和歐洲藥物管理局( EMEA)等部門對基因毒性雜質(zhì)的監(jiān)管要求越來越高。藥物中基因毒性雜質(zhì)如果控制不當,可能會導致臨床隱患,同時也會影響新藥上市時間。歐洲EMEA和美國FDA 均提出采用“毒理學關(guān)注閾值”( thresh-old of toxicological concern,TTC) 作為基因毒性雜質(zhì)的可接受限度[8-9]。本文對吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性雜質(zhì)進行了研究。
2.1 材料、試劑與儀器
分析儀器采用Agilent 7890A-7000B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,色譜柱采用DB-5 30 m×0.25 mm×0.25μm, 固定相為5%-苯基-甲氧基聚硅氧烷,柱溫采用起始溫度80℃,維持0分鐘,以15℃每分鐘的速率升溫至250℃,維持0.5分鐘。進樣口溫度設定為220℃,分流模式為不分流,載氣采用高純氦氣,流速為1.0 ml/min,進樣體積為1.0 μl,離子源溫度為230℃,采集模式為多反應監(jiān)測采集模式(MRM),定量離子對為166/99,定性離子對為166/90,碰撞能為25eV。超聲使用KQ2202型數(shù)控超聲波清洗機。
圖1 全掃描色譜圖Fig.1 Full scan chromatogram
圖2 3,4-二氯苯胺質(zhì)譜圖Fig.2 3,4-dichloroaniline mass spectrogram
2.2 溶液配制
稀釋溶劑采用甲醇。供試品溶液采取吉非替尼40mg,精密稱定,置10ml量瓶中,加稀釋溶劑溶解并定容至刻度,搖勻,超聲2min,作為供試品溶液。對照品貯備液取3,4-二氯苯胺100mg,精密稱定,置10ml量瓶中,加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液1。精密量取1.0ml貯備液1,置100ml量瓶中,加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,貯備液2。精密量取1.0ml 貯備液2,置100ml量瓶中,加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度,作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液2.0ml,置100ml量瓶中,加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度,作為對照品溶液。
3.1 專屬性研究
專屬性實驗要求單獨進空白溶液,證明該溶液對被測物測試無干擾,然后取對照品貯備液進樣。結(jié)果見圖1、圖2,由色譜圖可以看出,空白溶液對雜質(zhì)檢測無干擾,供試品中其他雜質(zhì)對3,4-二氯苯胺的檢測無干擾。
3.2 標準曲線
精密量取適量對照品儲備液,配置成100ng/mL、50ng/ mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL濃度梯度的標準溶液,取上述各線性溶液各1μL 進樣,記錄峰面積。以目標物濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標作回歸曲線,計算回歸方程及相應的線性回歸系數(shù)。獲得化合物的標準曲線及相關(guān)系數(shù)。得到2,4 -二氯苯胺的回歸方程y=3.1736x+4.358,其相關(guān)系數(shù)為0.9984,說明方法線性良好。
3.3 檢出限及定量限
準確配制被測物標準溶液,逐步稀釋至一定濃度并進樣,其信噪比(S/N)為3左右時的樣品濃度即為檢測限濃度,檢測限連續(xù)進3針;信噪比在10~15的樣品的濃度即為定量限濃度,定量限連續(xù)進樣6針;檢測限濃度與樣品理論濃度的比值即為檢測限;定量限濃度與樣品理論濃度的比值即為定量限,計算對應的峰高RSD應≤10.0%,定量限為2.5ppm,檢出限為1ppm。結(jié)果見表1。
表1 檢出限及定量限結(jié)果Table 1 Detection limit and the quantitative results
3.4 方法回收率及精密度
精密稱取吉非替尼40mg,置10ml量瓶中,再精密加入對照品儲備溶液0.16mL,再加稀釋溶劑溶解并稀釋至刻度,搖勻,超聲2min。取上清液作為80%限度測試溶液。同上述方法,做100%和120%限度測試溶液分析。由表3可見,回收率在92.53%~118.15%之間,回收率的相對標準偏差為4.86%。方法的精密度為7.68%?;厥章屎途芏葘嶒灲Y(jié)果良好,符合方法學的要求。
表2 方法的加標回收率Table 2 The method of standard addition recovery rate
3.5 樣品檢測
精密稱定1#、2#和3#樣品各40mg,置于10mL的量瓶中,超聲2min,搖勻,按照上述方法分析,分別測三次。三批樣品中均未檢出該基因毒性雜質(zhì),可見所分析樣品安全。
本方法采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定吉非替尼中3,4-二氯苯胺基因毒性雜質(zhì),方法靈敏度高,基質(zhì)干擾小,適合應用到實驗室中藥物基因毒性雜質(zhì)的日常檢測。
[1] Astra Zeneca plc (GB) Oncolytic EGF receptor tyrosine kinaseinhibitor IressaTM [J]. Drugs Future, 2002, 27(4): 339-345.
[2] Yang L, Parkin DM, Li LD,et al. Estimation and projection of the national profile of cancer mortality in China: 1991-2005[J]. British J Cancer 2004, 90(11): 2157-2166.
[3] Parkin DM, Bray F, Ferlay J,et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74-108.
[4] Gandara D, Narayan S, Lara PN,et al. Integration of novel therapeutics into combined modality therapy of locally advanced non-small cell lung cancer[J]. Clin Cancer Res 2005, 11(13):5057-5062.
[5] JX20030224 進口藥品注冊標準[S]. 2003. JX20030224 Import Drug Registration Standards [S]. 2003.
[6] Bouder F Regulating impurities in pharmaceutical products: atolerability of risk approach[J] Expert Rev Clin Pharmacol, 2008,1(2):241-250.
[7] Mueller L, Mauthe RJ, Riley CM,et al. A rationale for determining, testing and controlling specific impurities in pharmaceuticals that possess potential for genotoxicity[J] Regul Toxicol Pharmacol, 2006, 44(3): 198-211.
[8] Committee for Medicinal Products for Human Usetime(CHMP) Guidelines on the limits of genotoxic impurities(CPMP/ SWP/5199/02). London: European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use ( EMEA), 2006.
[9] U.S. Food and Drug Administration, Department of Health and Human Services, Center for Drug Evaluation and Research(CDER) Guidance for industry: genotoxic and carcinogenicimpurities in drug substances and products: recommended approaches(draft) [S]. Silver Spring: U. S. Food and DrugAdministration, 2008.
[10] Benigni R, Bossa C. Mechanisms of chemical carcinogenicity and mutagenicity: areview with implications for predictive toxicology[J]. Chem Rev,2011,111(4) : 2507-2536.
[11] 王萍,徐彩虹,陳仙,胡愛玲. 原料藥中基因毒性雜質(zhì)控制的研究進展[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學,2015,(1):119-126.
[12] 陳帥,袁崇均,羅森等. HPLC測定易瑞沙中的吉非替尼及有關(guān)物質(zhì)[J]. 華西藥學雜志,2013,28( 2) : 205-206.
Validation of GC-MS/MS Method for The Analysis of Genotoxic Impurity 3,4-Dichloroaniline
Li Jingkun, Wang Shanshan, Chen Xiangfeng*, Wang Xiaoli, Lin Yunliang
(Shandong Analysis and Test Centre, Jinan 250014 Shandong China)
A gas chromatography tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) method was developed for the determination of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib. The matrix effect was effectively reduced by multiple reaction monitoring (MRM) mode. The developed method has good linear relationship in the concentration range of 1~100 ng/mL with correlation coefficient above 0.990. The recoveries of target analyte ranged from 92.53% to 118.15%. The precision of method (RSD%) were less than 10.0%. This method can be used to the analysis of 3,4-Dichloroaniline in Gefitinib.
GC/MS/MS, Genotoxic impurity, 3,4-Dichloroaniline
TS255.7
A
10. 11967/ 2017150112
TS255.7
A DOI:10. 11967/ 2017150112
李靖坤 , 山東省分析測試中心, 碩士研究生, 研究方向: 藥物分析。
陳相峰, 副研究員,博士, 山東省分析測試中心, 研究方向: 復雜體系質(zhì)譜分析方法、技術(shù)與應用研究 E-Mail: xiangfchen@aliyun.com.
基金支持: 山東省科學院科技發(fā)展基金 (科基合字(2012)第11號)。