基于NaOH刻蝕玻碳電極的電化學(xué)傳感器在檢測(cè)膀胱癌DNA中的應(yīng)用*

張憶一,許世超,2,3*,溫俊男,董 凱

(1.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,天津 300387;2.天津工業(yè)大學(xué)中空纖維膜材料與膜過程省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387;3.天津工業(yè)大學(xué)水質(zhì)安全評(píng)價(jià)與保障技術(shù)工程中心,天津300387)

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基于NaOH刻蝕玻碳電極的電化學(xué)傳感器在檢測(cè)膀胱癌DNA中的應(yīng)用*

張憶一1,許世超1,2,3*,溫俊男1,董 凱1

(1.天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,天津 300387;2.天津工業(yè)大學(xué)中空纖維膜材料與膜過程省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津300387;3.天津工業(yè)大學(xué)水質(zhì)安全評(píng)價(jià)與保障技術(shù)工程中心,天津300387)

制備了一種基于活化的玻碳電極的新型電化學(xué)DNA生物傳感器,可用于膀胱癌DNA的檢測(cè)。通過循環(huán)伏安法(CV)實(shí)現(xiàn)玻碳電極在NaOH溶液中的刻蝕,使電極表面負(fù)載大量官能團(tuán),為DNA提供連接位點(diǎn),由Laviron方程計(jì)算得到玻碳電極表面的羧基濃度為 1.022×10-6mol/cm2。亞甲基藍(lán)(MB)作為電化學(xué)檢測(cè)的雜交指示劑。采用原子力顯微鏡(AFM)對(duì)刻蝕后的電極進(jìn)行了形貌表征。在最優(yōu)雜交條件下,通過差分脈沖法(DPV)計(jì)算出最佳檢測(cè)限為5.677×10-13mol/L(n=5),適用目標(biāo) DNA濃度范圍1×10-8mol/L～1×10-12mol/L。該傳感器有望用于實(shí)際樣品中膀胱癌DNA的快速檢測(cè)。

DNA電化學(xué)傳感器;活化的玻碳電極;差分脈沖法;亞甲基藍(lán)

脫氧核糖核酸(DNA)是形成生物的最基本的分子形式,因此對(duì)特定DNA序列的識(shí)別和量化在疾病監(jiān)測(cè)和微生物檢測(cè)領(lǐng)域中是非常重要的[1-4]。目前,常用的DNA 檢測(cè)技術(shù)有熒光檢測(cè)法、電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法、試劑盒法、電化學(xué)檢測(cè)法等[5]。與其他方法相比電化學(xué)檢測(cè)法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。如Jin等[9]采用發(fā)夾式探針DNA在金電極表面與目標(biāo)DNA雜交的檢測(cè)方法;Pandey等[10]構(gòu)建了一種自組裝膜做修飾成分檢測(cè)大腸桿菌基因的電化學(xué)傳感器;Pan等[11]制備了一種金納米粒子與石墨烯復(fù)合材料修飾玻碳電極的傳感器,并成功檢測(cè)克雷白氏桿菌;Zhao等[12]將玻碳電極在NaH2PO4溶液中進(jìn)行電化學(xué)刻蝕,使電極的電化學(xué)性能明顯增強(qiáng)并成功應(yīng)用于電化學(xué)檢測(cè)中。在生物傳感器組裝過程中,DNA序列的負(fù)載是制備傳感器的關(guān)鍵步驟,DNA負(fù)載的數(shù)量決定了傳感器的靈敏度。玻碳電極(GCE)由于其良好的表面導(dǎo)電性在電化學(xué)測(cè)試中廣泛應(yīng)用,而經(jīng)過活化的GCE表面負(fù)載的大量官能團(tuán)為DNA的固定提供良好的連接位點(diǎn)。目前,在GCE表面直接固定生物分子的方法也多用于檢測(cè)多巴胺、抗壞血酸、尿酸[13-15]。膀胱癌是世界第9大癌癥,復(fù)發(fā)率高且潛伏期長(zhǎng)[16-17],其前期分析和診斷的已經(jīng)成為疾病檢測(cè)的熱點(diǎn)。

亞甲基藍(lán)(MB)是一種吩噻嗪族有機(jī)染料,常作為電化學(xué)雜交指示劑用于生物傳感器的檢測(cè)中[18]。亞甲基藍(lán)的一個(gè)重要特征是可以和DNA分子中的鳥嘌呤核苷酸(Guanine)進(jìn)行特異性結(jié)合,具有非常好的生物親和性[19]。因此,亞甲基藍(lán)可以非常方便的被加入到 DNA 鏈段中,并發(fā)生氧化還原反應(yīng),產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。

本研究制備了由NaOH刻蝕玻碳電極的新型電化學(xué)DNA生物傳感器,采用亞甲基藍(lán)作為雜交指示劑,實(shí)現(xiàn)了對(duì)膀胱癌細(xì)胞DNA序列的特異性檢測(cè)。通過循環(huán)伏安法實(shí)現(xiàn)對(duì)玻碳電極的活化,使其表面負(fù)載了大量的官能團(tuán)[13,18](其中羧基為主要官能團(tuán)),為DNA的連接提供位點(diǎn),傳感器的靈敏度得到提高。通過這種方法,單鏈DNA可以直接固定于電極表面,簡(jiǎn)化了修飾電極繁復(fù)的制備過程,使檢測(cè)更加快速高效。此外,玻碳電極曾被用于0.1 mol/L H2SO4在0～2 V的范圍內(nèi)刻蝕[20],或者在+1.8 V的電勢(shì)下在PBS緩沖液(pH=5)中活化[21],但很少被用于堿性介質(zhì)中活化并檢測(cè)DNA序列,本研究首次使用NaOH活化的電極檢測(cè)DNA序列。與其他電化學(xué)傳感器相比,此傳感器具有很好的靈敏度,并且具有檢測(cè)范圍寬、檢測(cè)限低的特點(diǎn),可以對(duì)膀胱癌細(xì)胞特異DNA序列進(jìn)行檢測(cè),有望用于實(shí)際樣品中膀胱癌DNA的快速檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

LK2006A電化學(xué)工作站(天津蘭力科電子高技術(shù)有限公司),Easyscan-2原子力顯微鏡(瑞典 Nanosurf 科技公司),SB-5200D超聲清洗儀(寧波新芝生物科技有限公司);三電極系統(tǒng):表面修飾的工作電極為玻碳電極(GCE,Φ=3 mm),參比電極為飽和甘汞電極,對(duì)電極為鉑絲電極。

1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC,純度為98%)、三羥基烷基甲烷、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,純度為98%)、EDTA(上海阿拉丁試劑公司);亞甲基藍(lán)(MB,天津博迪化工有限公司);NaCl、NaOH、鹽酸(天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司);無(wú)水乙醇、KH2PO4(天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠);Na2HPO4·12H2O、檸檬酸鈉(天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);K3Fe(CN)6(天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司)。Tris-HCl緩沖液(pH=7.2,50 mmol/L,含20 mmol/L NaCl):50 mL 0.1 mol/L Tris溶液與44.7 mL 0.1 M鹽酸混合均勻,加水稀釋至100 mL。PBS緩沖液(pH=7.0,0.1 mol/L):用KH2PO4和Na2HPO4·12H2O配制。2×SSC緩沖液(pH=7.0):NaCl溶液與檸檬酸鈉溶液混合配制。TE緩沖液(pH=8.0):用Tris和EDTA配制,再用0.1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.0。所用試劑均為分析純,所用水均為超純水。

1.2 DNA序列

下列①～⑦DNA 鏈段由天津伯益特生物技術(shù)有限公司合成:①5′端氨基標(biāo)記的探針DNA序列:5′-NH2-(CH2)6-CAGTAGACGGGGGTGTCTCGCGAC-3′;②互補(bǔ)目標(biāo)DNA 序列:5′-NH2-(CH2)6-CAGTAGACGGGGGTGTCTCGCGAC-3′;③單堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA序列:5′-GTCATCTGGCCCCACAGAGCGCTG-3′;④兩堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA序列:5′-GTCATCTGGCCCCTCAGAGCGCTG-3′;⑤多堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA序列:5′-TGGTTCTGGCCCCTCAGAGCGCTG-3′;⑥弓形蟲特征DNA序列:5′-AGCTATTATAAACTCGTTGGA-TGC-3′;⑦化膿單桿胞菌DNA序列:5′-GGCTTTT-CGTCCGGCGAAAATGCC-3′。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1 修飾電極的制備

將玻碳電極分別在0.3 μm和0.05 μm的氧化鋁拋光粉中進(jìn)行打磨拋光,然后依次用稀硝酸、乙醇、超純水超聲清洗,最后用氮?dú)獯蹈呻姌O表面。將預(yù)處理好的玻碳電極置于1 mol/L的NaOH溶液中,通過循環(huán)伏安法掃描進(jìn)行電化學(xué)蝕刻,循環(huán)掃描20圈,電位設(shè)定在-0.1 V～1.2 V,掃速為50 mV/s,即得到NaOH/GCE的修飾電極。

1.3.2 傳感器的組裝

將5 μL單鏈DNA(ssDNA)探針溶液和10 μL Tris-HCl溶液(內(nèi)含25 mmol/L EDC和10 mmol/L NHS,pH=7.2)緩慢滴加于處理好的玻碳電極表面,在40 ℃的條件下靜置1 h,在此過程中要保證電極表面的濕潤(rùn)程度。將電極用Tris-HCl緩沖液和超純水輕輕清洗,以除去未組裝的DNA,用氮?dú)獯蹈杀砻?即得到ssDNA/NaOH/GCE。

1.3.3 目標(biāo)DNA的雜交

將ssDNA/NaOH/GC置于一定濃度的互補(bǔ)目標(biāo)DNA的2×SSC溶液中,在37 ℃下雜交1 h。雜交完成后,使雜交溶液自然冷卻至室溫取出電極,并用Tris-HCl和超純水依次沖洗電極表面以便將未雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)的DNA(dsDNA)除去,即得到dsDNA/NaOH/GCE。

1.3.4 雜交指示劑的嵌入

將上述制備好的dsDNA/NaOH/GCE浸沒在含一定濃度亞甲基藍(lán)的Tris-HCl溶液中,自組裝反應(yīng)一段時(shí)間,將電極取出并用Tris-HCl溶液沖洗電極。此傳感器制備的流程如圖1所示。

圖1 電化學(xué)蝕刻法制備電化學(xué) DNA 傳感器的流程圖

2 結(jié)果與討論

2.1 膀胱癌DNA電化學(xué)傳感器的制備

2.1.1 玻碳電極的電化學(xué)蝕刻表征

NaOH蝕刻過程本質(zhì)是通過電極在堿性溶液中的活化,使得玻碳電極表面本身形成羧基、 醌型分子、羰基等官能團(tuán)層[14,22],以便進(jìn)行進(jìn)一步的電化學(xué)固定。由圖2可以看出,相比于裸玻碳電極的循環(huán)伏安(圖2(a)),經(jīng)NaOH溶液刻蝕后(圖2(b)),出現(xiàn)了很明顯的氧化還原峰,證明已經(jīng)得到了充分活化的電極,形成了穩(wěn)定的羧基官能團(tuán)。

a為裸玻碳電極;b為經(jīng)NaOH刻蝕的玻碳電極;底液為0.1 mol/L(pH=7.0)PBS緩沖液圖2 電化學(xué)蝕刻玻碳電極表面的循環(huán)伏安圖

圖3是玻碳電極表面在原子力顯微鏡(AFM)下的2D和3D形貌圖。可以明顯看出,相比裸玻碳電極的AFM圖(圖3(a)),當(dāng)玻碳電極在NaOH溶液中活化過后(圖3(b)),電極表面形成許多不規(guī)則的微球狀物質(zhì),通過測(cè)量這些微球的平均直徑為151.3 nm,這說明電極表面的粗糙程度明顯增加。此外,對(duì)比3D形貌圖(圖3(c)與圖3(d)),在電極活化之后表面形成大量凹凸不平的凸起,同樣說明了電極粗糙程度的改變,同時(shí)電極的有效表面積增大[12],為傳感器的組裝提供更多的結(jié)合位點(diǎn)。綜上所述,NaOH已成功在電極表面完成刻蝕過程,得到了活化的玻碳電極。

圖3 玻碳電極表面的 AFM 表征圖

圖4表明,電化學(xué)蝕刻后的玻碳電極隨著掃描速度的增加,峰電流值也逐漸增加。圖5將圖4中不同的掃描速度所對(duì)應(yīng)的氧化峰和還原峰電流值進(jìn)行了擬合。如圖5所示,所蝕刻后的玻碳電極其氧化峰和還原峰電流值隨著掃速的增加而呈現(xiàn)非常好的線性相關(guān)性,擬合后的氧化峰曲線R為0.998 31,擬合方程為IPA=0.018 22·ν+0.892 87;還原峰曲線R為0.997 93,擬合方程為IPC=-0.01853·ν-1.000 89(式中ν為循環(huán)伏安法中的掃描速度)。以上結(jié)果表明,NaOH蝕刻后的玻碳電極表面為典型的表面控制過程,不是擴(kuò)散控制過程。

掃描范圍-0.6 V～0.6 V,掃描速度0.01 V/s～1 V/s圖4 電化學(xué)蝕刻后玻碳電極在不同掃描速度下的循環(huán)伏安曲線圖

IPA為氧化峰電流;IPC為還原峰電流圖5 電化學(xué)蝕刻后的玻碳電極在不同掃速時(shí)的循環(huán)伏安圖擬合曲線

此外,根據(jù) Laviron方程[23]可以推算出電極表面的官能團(tuán)濃度Γ(主要是羧基官能團(tuán))。具體計(jì)算過程如下:

ip=nFQviip=nFQv/4RTip=nFQvj

(1)

Q=nFAΓ Q=n

(2)

式中:n是電子轉(zhuǎn)移數(shù)目,F是法拉第常數(shù),Q是還原峰的積分值,v為掃描速度,R為氣體摩爾常數(shù),T是熱力學(xué)溫度。計(jì)算結(jié)果表明,玻碳電極表面的羧基濃度約為1.022×10-6mol/cm2。

2.1.2 傳感器的組裝

從圖6可以看出,當(dāng)GCE(曲線c)和ssDNA/GCE(曲線b)分別在PBS緩沖液中進(jìn)行循環(huán)伏安曲線掃描時(shí),沒有明顯的氧化還原峰出現(xiàn)。這是因?yàn)樵谏鲜鰞煞N電極表面未組裝雜交指示劑MB,所以沒有出現(xiàn)相應(yīng)的電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)在dsDNA組裝完成的玻碳電極表面(曲線c)進(jìn)行MB自組裝之后,在-0.235V和-0.312V位置上出現(xiàn)了MB的氧化還原峰(vsSCE),并且兩個(gè)電化學(xué)信號(hào)峰對(duì)稱性良好。以上結(jié)果表明,MB分子成功組裝到dsDNA修飾的玻碳電極表面,并且表現(xiàn)出良好的電化學(xué)氧化還原活性。

a為裸玻碳電極;b為ssDNA探針修飾的玻碳電極;c為MB/ss DNA修飾的玻碳電極;d為MB/ds DNA修飾的玻碳電極。掃描底液為PBS緩沖液(0.1 mol/L,pH=7.0),掃描速度50 mV/s,掃描范圍-0.6 V～0.2 V,目標(biāo)DNA濃度為10 μmol/L圖6 電化學(xué)DNA傳感器組裝的循環(huán)伏安圖

2.2 目標(biāo)DNA雜交條件的優(yōu)化

2.2.1 雜交時(shí)間和溫度的選擇

電化學(xué)DNA傳感器與目標(biāo)DNA的雜交時(shí)間和溫度關(guān)系如圖7所示。從圖7可以看出,隨著雜交溫度的上升,雜交時(shí)間逐漸減小。當(dāng)雜交溫度為25 ℃(圖7(a))時(shí),雜交100 min后雙螺旋結(jié)構(gòu)才在電極表面形成;隨著雜交溫度的升高,在35 ℃(圖7(b))和45 ℃(圖7(c))條件下,分別只需要60 min和40 min即可完成目標(biāo)DNA在電極表面的雜交,形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。但是,在45 ℃條件下,起初由于溫度較高,DNA雜交過程進(jìn)行較快,但是隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行,雙螺旋結(jié)構(gòu)在高溫下逐漸被破壞,因此所測(cè)得的電信號(hào)值大幅減小。當(dāng)雜交溫度為55 ℃(圖7(d))時(shí),由于雜交溫度過高,ssDNA探針和目標(biāo)DNA鏈段并未發(fā)生明顯雜交就在高溫中被破壞結(jié)構(gòu),因此并未有明顯的雜交信號(hào)出現(xiàn)。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)后續(xù)的目標(biāo)DNA雜交實(shí)驗(yàn)均選擇在35 ℃下雜交1 h。

a為25 ℃;b為35 ℃;c為45 ℃;d為55 ℃圖7 不同溫度條件下MB/dsDNA/GCE的差分脈沖信號(hào)響應(yīng)與不同雜交時(shí)間的關(guān)系圖

DNA雜交溶液為10 μmol/L,MB濃度為10 μmol/L圖8 亞甲基藍(lán)自組裝時(shí)間對(duì)雜交信號(hào)的影響圖

2.2.2 MB分子自組裝條件的優(yōu)化

由圖8可知,dsDNA/GCE在組裝MB時(shí),隨著組裝時(shí)間的增加,最后所測(cè)得的電信號(hào)值逐漸增加。當(dāng)自組裝時(shí)間達(dá)到5 min時(shí),電信號(hào)達(dá)到最大,隨后趨于平穩(wěn),沒有發(fā)生明顯波動(dòng)。因此,在后續(xù)MB自組裝實(shí)驗(yàn)中,MB的組裝時(shí)間均選為5 min。從圖9可知,在相同實(shí)驗(yàn)條件下,隨著MB濃度的增加,電極最后所測(cè)得的電信號(hào)也逐漸增加。當(dāng)MB在底液中的濃度達(dá)到2×10-5mol/L時(shí),電信號(hào)值達(dá)到最大,并且隨著MB濃度的繼續(xù)增加再無(wú)明顯波動(dòng)和變化。因此,后續(xù)MB自組裝實(shí)驗(yàn)中,選擇MB組裝底液的濃度為2×10-5mol/L。

DNA雜交溶液為10 μmol/L,MB組裝時(shí)間為5 min圖9 亞甲基藍(lán)濃度對(duì)雜交信號(hào)的影響圖

2.3 傳感器的電化學(xué)表征

2.3.1 傳感器的選擇性

a為裸玻碳電極;b為MB/ssDNA/GCE;c為多堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA;d為兩堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA;e為單堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA;f為完全互補(bǔ)目標(biāo)DNA。檢測(cè)底液為Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH=7.2),以上DNA雜交溶液濃度均為10 μmol/L,DNA雜交溫度為35 ℃,雜交時(shí)間為60 min。圖10 電化學(xué)DNA傳感器與不同DNA雜交后的差分脈沖伏安圖

從圖10可以看出,當(dāng)探針與互補(bǔ)目標(biāo)DNA(曲線f)雜交時(shí),電化學(xué)信號(hào)最強(qiáng)。這是因?yàn)镸B分子充分組裝到了dsDNA/GCE 表面,因此其電化學(xué)反應(yīng)充分,電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)。當(dāng)與單堿基錯(cuò)配(曲線e)和兩堿基錯(cuò)配的目標(biāo)DNA鏈段(曲線d)雜交之后,在玻碳電極表面并未形成完整的雙鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu),致使MB分子并不能充分嵌入dsDNA結(jié)構(gòu)中因此電化學(xué)還原峰信號(hào)相比于完全互補(bǔ)的目標(biāo)DNA明顯減小。最后,當(dāng)探針與多堿基錯(cuò)配目標(biāo)DNA(曲線c)雜交后,在玻碳電極表面幾乎未形成雙鏈DNA螺旋結(jié)構(gòu),MB幾乎未組裝在dsDNA結(jié)構(gòu)中,因此其電化學(xué)信號(hào)僅比MB/ssDNA/GCE微微增大。這種電化學(xué)信號(hào)微增的現(xiàn)象是因?yàn)槲⒘康膕sDNA鏈段物理吸附在了電極表面,在MB分子組裝到這些ssDNA結(jié)構(gòu)中之后,產(chǎn)生了微弱的電信號(hào)[20]。圖10中的曲線a是探針與裸玻碳電極雜交的空白實(shí)驗(yàn),曲線b為ssDNA探針組裝MB之后的電化學(xué)信號(hào)。以上結(jié)果表明,所制備的電化學(xué)DNA傳感器具有很好的選擇性,能夠?qū)δ繕?biāo)DNA鏈段進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。

2.3.2 膀胱癌目標(biāo)DNA檢測(cè)

從圖11可以看出,隨著目標(biāo)DNA雜交液濃度的逐漸增大,DPV信號(hào)也相應(yīng)增加。圖12為圖11的線性擬合曲線,從圖中可以看出,電信號(hào)值與目標(biāo)DNA濃度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(R=0.998 78),這說明該傳感器的有很高的靈敏度。

a～e分別對(duì)應(yīng)1×10-8 mol/L～1×10-12 mol/L圖11 電化學(xué)DNA傳感器與不同濃度的目標(biāo)DNA雜交的差分脈沖曲線圖

圖12 電化學(xué)傳感器與不同濃度的目標(biāo)DNA雜交后的電信號(hào)擬合曲線(n=5)

為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,我們還對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行了5組平行實(shí)驗(yàn),并計(jì)算了實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)差,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

所得到的曲線方程為Ip=-7.661 07-1.016 01·C(C為目標(biāo)DNA濃度,Ip為電信號(hào)值)。根據(jù)3δ法,計(jì)算出最佳檢測(cè)限為5.677×10-13mol/L(n=5)。與其他現(xiàn)有傳感器相比較,本傳感器具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、檢出限低的優(yōu)點(diǎn)(如表2所示)。

表2 其他傳感器的檢測(cè)范圍和檢出限的比較

2.4 傳感器的特異性

圖13為所制備的傳感器分別與相同濃度的膀胱癌目標(biāo)DNA、弓形蟲DNA以及化膿單桿胞菌DNA雜交后的電信號(hào)變化對(duì)比圖。從圖13可以明顯看出,當(dāng)探針與目標(biāo)DNA雜交時(shí),其DPV電信號(hào)變化值最大,這進(jìn)一步表明所制備的探針對(duì)于膀胱癌DNA的檢測(cè)具有良好的特異性。

DNA雜交溶液濃度均為10 μmol/L圖13 電化學(xué)DNA傳感器與不同菌種和細(xì)胞DNA雜交的DPV信號(hào)比較圖

2.5 傳感器的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性

將所制備的傳感器在0.1 mol/L的PBS緩沖液中利用循環(huán)伏安法掃描10圈后,氧化峰與還原峰的峰值電流沒有發(fā)生明顯改變。此傳感器儲(chǔ)藏于4 ℃的冰箱中一個(gè)星期后,峰值電流仍未發(fā)生明顯改變,由此可知,本研究所制備的傳感器有很高的穩(wěn)定性。

在相同的條件下依照上述方法制備了5個(gè)傳感器,分別檢測(cè)濃度為0.1 μmol/L的互補(bǔ)目標(biāo)DNA。檢測(cè)發(fā)現(xiàn),5個(gè)傳感器的還原峰電流的平均值為-12.234 3 μA,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.22%。由此可知,所制備的探針有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)利用NaOH溶液活化玻碳電極表面,使其被大量羧基修飾,在EDC/NHS的作用下將一端用氨基標(biāo)記的單鏈DNA探針在表面進(jìn)行固定,設(shè)計(jì)了一種新型DNA生物傳感器,以MB作為雜交指示劑對(duì)DNA的固定與雜交進(jìn)行研究。結(jié)果表明該電化學(xué)傳感器檢測(cè)范圍寬,檢測(cè)限低,靈敏度高,具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,并且操作簡(jiǎn)單,有望用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

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張憶一(1992-),女,漢族,天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院碩士研究生,主要研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)生物傳感器的制備,zhangyiyi711@163.com;

許世超(1975-),男,漢族,天津工業(yè)大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院黨委書記,副教授,博士,主要研究方向?yàn)殡娀瘜W(xué)傳感器,納米材料的合成,光催化等,xushichao@tjpu.edu.cn。

A Sensitive Electrochemical Biosensor Based on NaOH Etched Glassy Carbon Electrode for Detection of Bladder Cancer DNA*

ZHANGYiyi1,XUShichao1,2,3*,WENJunnan1,DONGKai1

(1.School of Environmental and Chemical Engineering,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China;2.State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane Processes,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China;3.TianJin Engineering Center for Safety Evaluation of Water Quality and Safeguards Technology,Tianjin Polytechnic University,Tianjin 300387,China)

In this paper,a novel and sensitive electrochemical DNA biosensor based on activated glassy carbon electrode(GCE)for detection of bladder cancer DNA. GCE was activated by etching in NaOH solution by cyclic voltammetry(CV)for providing the electrode surface with abundant functional groups for DNA attachment,the average surface concentration of carboxyl groups on electrode surface is about 1.022×10-6mol/cm2(Laviron’s equations). Methylene blue(MB)was used as hybridization indicator for electrochemical detection. Atomic force microscope(AFM)analysis was employed for the morphological performance of activated electrode surface. Under the optimal hybridization conditions,differential pulse voltammetry(DPV)responses of the biosensor were in linear with the target DNA in the concentration range from 1×10-12mol/L to 1×10-8mol/L with the detection limit as 5.677×10-13mol/L(3δ). This sensor will be promising for the fast detection of bladder cancer DNA in real sample.

electrochemical DNA biosensor;activated glassy carbon electrode;differential pulse voltammetry;methylene blue

項(xiàng)目來(lái)源:天津市自然科學(xué)基金(11JCZDJC22300;13JCQNJC02600);天津市外國(guó)專家局引智項(xiàng)目(Y2012061)

2016-08-22 修改日期:2016-11-23

TP212.3

A

1004-1699(2017)03-0353-07

C:7230J

10.3969/j.issn.1004-1699.2017.03.004