乳品中細菌含量的自動識別與檢測方法研究

陳思

（貴陽職業(yè)技術學院，貴州貴陽550023）

乳品中細菌含量的自動識別與檢測方法研究

陳思

（貴陽職業(yè)技術學院，貴州貴陽550023）

乳品發(fā)生細菌污染可產生嚴重后果，威脅消費者健康。為提高乳品中細菌的檢測精度，減少檢測誤差，我們開發(fā)一種自動識別檢測方法。該方法采用圖像采集識別技術與快速基因檢測技術相結合的方法，實現(xiàn)自動識別乳品細菌總數、活菌數和細菌種類的目的，與經典的檢測方法相比符合率達到99%以上，具有實時、快速、便捷、經濟的優(yōu)點，適合推廣使用。

乳品；細菌污染；活菌數；細菌種類

乳品一直在人類食品中占有重要地位，其安全性對當今我國的食品安全問題具有顯著影響，一直是政府和媒體關注的重點[1]。在眾多危害乳制品質量的因素中，由于細菌污染導致的乳制品品質下降甚至產生毒性是主要的危害因素。受到細菌污染的乳品不僅僅對消費者健康產生危害，同時影響我國的乳制品行業(yè)和整個食品行業(yè)的聲譽，甚至對我國的國家形象也會產生不良影響[2]。因此，采用科學的手段對乳品中污染細菌含量進行檢測，具有較大的市場需求。傳統(tǒng)的微生物含量檢測方式是主要包括：光學顯微鏡計數法、電子儀器計數法、吸光度換算法、平板計數法、濾膜計數法、熒光或同位素染色法、流式細胞儀檢測法等，這些經典的方法均存在一些缺點，比如：計數染料存在污染性，難以清除；濾膜法可以篩選出多種菌落，但無法精確計數；光學顯微鏡和電子儀器計數無法區(qū)分細胞的存活狀態(tài)；平板計數法所需的檢測時間過長，影響乳品的生產[3-5]。為了解決現(xiàn)存問題，我們開發(fā)了一套乳品中微生物含量自動檢測識別的技術，該技術具有實時、準確和快速的特點，可以準確對乳品中的微生物含量進行定量，同時可以對微生物的種類進行識別。

1自動檢測系統(tǒng)的組成

1.1乳品中細菌含量的自動識別檢測技術的總體構成

完整的自動識別檢測系統(tǒng)由4個主要部分組成，分別為樣品前處理系統(tǒng)、圖像采集與識別系統(tǒng)、快速基因檢測系統(tǒng)和數據統(tǒng)計軟件。樣品前處理系統(tǒng)可以根據乳品濃度，按比例將PMT和乳品樣本進行充分混勻，并進行光照激活處理，做好檢測前的準備工作。處理好得樣品需要通過自動進樣器將10μL樣品滴入檢測臺，準備開始圖像采集和識別工作。圖像采集與識別系統(tǒng)和快速基因檢測系統(tǒng)是核心部分，通過顯微鏡對乳品樣本中的菌體進行自動觀察和拍照，連續(xù)記錄3個視野后識別出菌落和菌團后進行分別計數和統(tǒng)計，得到10μL乳品中的細菌種類和數量。為了進一步得到乳品中活菌的數量，我們在第三部分設置快速基因檢測系統(tǒng)，通過PMT-qPCR的方法對乳品樣本中的活菌數目進行精確檢測。至此，我們完成完整的檢測工作，最后將得到的數據通過統(tǒng)計學軟件進行分析，得到最終結果。完整的自動識別檢測系統(tǒng)流程圖如1所示，各部分系統(tǒng)詳細功能描述如下：

圖1 乳品中細菌自動識別檢測方法的構成Fig.1 Thestructureof thebacteria autom atic identification detectionmethod in dairy products

1.2樣本處理系統(tǒng)

無論是巴氏奶還是發(fā)酵乳，均存在脂肪濃度過高影響檢測的現(xiàn)象，樣品前處理系統(tǒng)的第一步通過高速離心（10 000 g，10min）的方法使乳品分層，去除干擾物質錄。隨后通過自動進樣器，將20μgPMT注入1mL乳品樣本中，經過低速混勻后，采用650W鎢絲燈照射15min，達到樣本的完全制備，準備進一步檢測。

1.3顯微鏡自動檢測識別系統(tǒng)

經過處理的樣品首先經過顯微鏡自動檢測識別系統(tǒng)檢測，自動對3個視野下的所有物質進行圖像分析。在圖像采集階段，軟件內置判斷模塊，對拍攝圖片的清洗度和分辨率進行比較，符合要求的圖片進行下一環(huán)節(jié)，不符合要的圖片需要重新拍照。通過軟件對拍攝圖片上的細菌進行識別和計算。該技術主要利用圖像處理軟件，在計算機上對照片事業(yè)上的細菌進行逐個識別，識別方法主要包括：預處理（圖像對比增強）、對疑似細菌顆粒進行特征提取、采用最佳算法進行快速計算和對所有的細菌進行形態(tài)分類標號。具體的細菌識別方案如下：采用數學形態(tài)學中開運算的方法區(qū)分細菌間存在的粘附情況，采用十字結構4領域元素對細胞圖像D（f，k）的原二值化進行膨脹和腐敗處理，要求目標圖像E（f，k）的初始數值為225，即為白色。分別對D（f，k）和E（f，k）的像素點進行逐個腐蝕計算，計算結束后，重新掃描每個像素點，再逐個進行膨脹運算，最后輸出D（f，k）經過腐蝕覆蓋后的圖像，即為去除細菌間粘連的圖像。經過該方案處理過的圖像，細菌間的界面更平滑，菌團的纖細連接點分離，增大細菌間的間隙，而正常的未發(fā)生粘連的細菌不發(fā)生任何改變。在圖像采集與識別系統(tǒng)中，微生物圖像數據庫是重要的組成部分，它根據當今報道的乳品微生物形態(tài)特征構建，利用網絡資源可以做到實時更新，通知利用數學形態(tài)學的方法增大檢索速度。目前對10個視野下的細菌進行拍照計數，得到數值后再根據細菌類型進行統(tǒng)計分析。

1.4快速基因檢測系統(tǒng)

快速基因檢測系統(tǒng)是以PMA-qPCR為基礎的檢測方法，其中PMA是一種可以在藍光作用下與雙鏈DNA結合的染料。PMA具有疊氮基團可以被藍光激活產生氮烯自由基，該自由基具有高活性特點可立即與核酸形成穩(wěn)定的共價鍵，將PMA穩(wěn)固的粘附在DNA上，抑制擴增反應，導致該DNA無法進行qPCR檢測。PMA具有一個顯著的生物學特點，其不能通過活菌細胞膜而無法與其基因組結合，只能通過死亡細胞的細胞膜與死菌基因組結合，這一功能被廣泛應用在活菌數量檢測試驗。在本試驗中，我們利用PMA這一特性，在細菌基因組提取前先使用PMA溶液處理細菌，充分抑制死亡細菌基因組，保證qPCR的模板來自于活菌。在PMT處理后，采用商品化細菌基因組提取試劑盒進行基因組提取，提取步驟嚴格按照操作說明書進行，隨后立即進行qPCR檢測，檢測使用的通用引物為16S-14f：CCGTACATAGCAGGGCCCAG；16S-15r：GAT CTAGTGATTCGACTAGCAGCCG。共擴增長度為289bp。該引物覆蓋常見乳品污染細菌35種，具有廣泛的通用性。PCR反應體系如下，反應條件：95℃8min，38個循環(huán)（95℃30 s，55℃45 s，72℃30 s）。每個樣本設置3個平行檢測孔，試驗接受后取3孔的平均Ct值，并經過我們反復測定，證實該方法檢測Ct值在26.60～29.25間，乳品中每1mL含菌量小于1.25×105CFU/mL。

1.5數據統(tǒng)計系統(tǒng)

我們以SPSS18.0為基礎開發(fā)一套數據自動轉換軟件，該軟件可以根據Ct值直接進行活菌數換算，簡單快捷，準確性高。

1.6實際樣本檢測分析

2015年8月～12月，我們從吉林省某乳業(yè)采集收細菌污染的乳品樣品共20份。在進行試驗前均進行人工顯微鏡計數、平板計數、細菌形態(tài)學和微生物自動分析儀鑒定，完成后采用我們的自動識別檢測方法對樣品進行檢測。

1.7數據統(tǒng)計與分析

所有數據的統(tǒng)計分析均采用spss18.0，計量資料進行采用t檢驗，計數資料采用Χ2檢驗，P＜0.05為差異顯著，具有統(tǒng)計學意義。

2結果與分析

2.1實際樣品細菌總數檢測

我們采用經典的平板計數法計算乳品樣品中的細菌數量作為對比，但需要注意的是平板計數法僅可以檢測活菌數，細菌總數檢測見表1。

表1 細菌總數檢測Table1 The totalnumber of bacteria detection

如表1所示，我們建立的方法檢測的細菌總數與經典鏡檢計數符合率達到95%以上，活菌總數與平板計數結果符合率達到100%，具有準確性優(yōu)勢，同時所需而時間僅為平板計數的1/5，因此具有時效性優(yōu)勢。

2.2實際樣品細菌種類檢測

我們采用人工顯微鏡形態(tài)學觀察和微生物鑒定儀作為對照，比較我們建立的檢測方法的準確性。樣品細菌種類檢測結果如表2所示。

表2 樣品細菌種類檢測Table2 Bacterialspecies test sam ple

續(xù)表2樣品細菌種類檢測Continue table2 Bacterialspecies test sample

由表2可知，我們建立的檢測方法對乳品中細菌種類識別的數量明顯高于人工顯微鏡觀察（P＜0.05），與微生物鑒定儀的符合度達到99%以上。

3討論

乳制品具有易消化和營養(yǎng)豐富的優(yōu)點，其中富含蛋白質、糖類、脂肪、維生素、無機鹽等營養(yǎng)物質，是一種制備簡單經濟實惠的優(yōu)質食品，受到廣大消費者喜歡[6]。由于營養(yǎng)豐富，乳品也容易受到細菌污染，細菌繁殖過程中大量消耗乳品營養(yǎng)，同時產生有毒的代謝產物，影響乳品的風味和營養(yǎng)價值，同時消費者食用后可能產生嚴重中毒現(xiàn)象[7-8]。因此實時監(jiān)測乳品的細菌污染現(xiàn)象，對提高我國乳品形象，維護乳品行業(yè)的信譽，保護消費者健康具有積極影響。在本研究中我們提出一種乳品污染細菌的自動識別檢測方法，通過分析捕捉到的圖像資料，依據建立的細菌形態(tài)學數據庫，采用數學形態(tài)學的方法可以快速進行細菌計數和種類鑒定。同時為了進一步判斷乳品污染的活菌數，我們提出一種PMT-qPCR的檢測方法，可以在3 h內對乳品中的活菌數進行精確計數。與傳統(tǒng)的方法相比，我們的方法具有實時、準確、快速的優(yōu)勢，大幅度縮短試驗時間，同時所需的儀器要求不高，大部分試驗室均有可以立即使用。在將來的研究中，我們將以此方法為基礎，開發(fā)一套具備自動進樣、自動檢測和自動讀值的檢測設備，為維護我國乳品品質，維持食品安全，盡一份力。

參考文獻：

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Research on Bacteria Autom atic Identification and Detection M ethod in Dairy Products

CHENSi
（Guiyang Vocationaland TechnicalCollege，Guiyang 550023，Guizhou，China）

Dairy bacteria pollution could caused seriousconsequences，threatened the consumershealth.To improve the accuracy ofbacteria detection in dairy products，and reduced detection error，an automatic identification detectionmethodwere developed.Themethod uses image acquisition and recognition technology combinedwith rapid gene detection technology to realize the purposeofautomatically identifying the totalnumberof bacteria，number ofviable bacteria and bacteria species.Compared with the classical detectionmethod，the co incidencerateismorethan99%，andhad fast，convenient，economicadvantages，suitable forpromotionanduse.

dairyproduct；bacterialcontamination；viablecount；bacterialspecies

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.05.040

2016-10-20

陳思（1983—），女（漢），講師，碩士，研究方向：生物技術。